Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla i pomiar kości długich myszy płodu i noworodka

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59509

⸱

26 kwietnia 2019

 , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę hodowli ex vivo długich kości mysich zarówno na etapie płodowym, jak i noworodkowym, odpowiednią do analizy rozwoju i homeostazy kości i chrząstki w kontrolowanych warunkach, podczas rekapitulacji procesu in vivo.

Streszczenie

Kości długie to skomplikowane i dynamiczne struktury, które powstają w wyniku kostnienia śródchrzęstnego przez pośrednią chrząstkę. Ograniczony dostęp do zdrowych kości ludzkich sprawia, że szczególnie cenne jest wykorzystanie modeli ssaków, takich jak myszy i szczury, do badania różnych aspektów wzrostu i homeostazy kości. Ponadto rozwój wyrafinowanych narzędzi genetycznych u myszy pozwala na bardziej złożone badania wzrostu kości długich i wymaga rozszerzenia technik stosowanych do badania wzrostu kości. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli kości myszy ex vivo, który pozwala na badanie kości i chrząstki w ściśle kontrolowany sposób przy jednoczesnym podsumowaniu większości procesu in vivo. Opisana metoda pozwala na hodowlę szeregu kości, w tym kości piszczelowej, udowej i śródstopia, ale skupiliśmy się tutaj głównie na posiewie piszczelowym. Co więcej, może być stosowany w połączeniu z innymi technikami, takimi jak obrazowanie poklatkowe na żywo lub leczenie farmakologiczne.

Wprowadzenie

Wzrost narządów musi być ściśle dostrojony, aby zapobiec pojawieniu się zaburzeń wzrostu, i obejmuje regulację wielu typów komórek, szlaków molekularnych i przesłuchów między różnymi częściami ciała. Techniki obrazowania są niezbędne, aby zająć się zmianami zachodzącymi w czasie w rosnącym zarodku, zarówno w normalnych warunkach, jak i po wywołaniu perturbacji w systemie. Zarodki z rozwojem wewnątrzmacicznym, takie jak powszechnie stosowane modele gryzoni, stanowią dodatkowe wyzwanie dla obrazowania żywego ciała i leczenia farmakologicznego, które można częściowo przezwyciężyć dzięki zastosowaniu technik hodowli ex vivo. Aby skutecznie podsumować procesy in vivo i uzyskać znaczące wyniki, kluczowe staje się znalezienie odpowiednich warunków hodowli dla każdego narządu lub tkanki.

Większość kości szkieletu ssaków rośnie poprzez kostnienie śródchrzęstne, gdzie embrionalna chrząstka (złożona z komórek zwanych chondrocytami) napędza wzrost podłużny i jest stopniowo zastępowana przez kość. Proces ten zachodzi na płytkach wzrostowych, znajdujących się na końcu kości długich, gdzie można wyróżnić trzy strefy: spoczynkową, proliferacyjną i przerostową1,2. Po pierwsze, okrągłe chondrocyty progenitorowe w strefie spoczynku przechodzą w cykliczne chondrocyty kolumnowe w strefie proliferacyjnej. W kolejnym etapie różnicowania chondrocyty te stają się przerostowe i zaczynają wydzielać kolagen typu X. Przerostowe chondrocyty koordynują kolejne etapy kostnienia: wydzielają kluczowe cząsteczki sygnałowe, takie jak czynnik wzrostu tkanki łącznej, białka morfogenetyczne kości i jeż indyjski, a także kierują mineralizacją macierzy, rekrutują naczynia krwionośne do centralnej części kości, a po apoptozie umożliwiają osteoblastom (komórkom tworzącym kości) inwazję macierzy w celu utworzenia pierwotnego centrum kostnienia3, 4. Zmineralizowana macierz ułatwia przenikanie naczyń krwionośnych, przez które migrują osteoblasty, aby zastąpić tę zdegradowaną chrząstkę macierzą kostną5. Większość osteoblastów atakuje macierz chrząstki z perichondrium, włóknistej warstwy, która owija chrząstkę6. Alternatywnie, pewna część przerostowych chondrocytów jest w stanie przetrwać i zróżnicować się do osteoblastów7,8,9. Ostateczna długość kości wynika ze skumulowanego wzrostu przejściowej chrząstki, której tempo wzrostu z kolei zależy od liczby i wielkości przerostowych chondrocytów oraz ich produkcji macierzy10. Dodatkowo, niedawno wykazano, że czas trwania ostatniej fazy hipertrofii koreluje z końcową długością bone11. Dlatego wymagana jest ścisła regulacja proliferacji i różnicowania tych komórek, aby zapewnić prawidłowy rozmiar kości.

Pomimo zdobytej przez lata wiedzy na temat organizacji i rozwoju płytek wzrostowych, większość tych wniosków opiera się na obserwacji ustalonych odcinków histologicznych. Sekcja tkanek dostarcza cennych informacji na temat tego procesu, ale może być obarczona artefaktami technicznymi, więc nie zawsze może być wiarygodnie wykorzystana do oszacowania zmian morfologicznych lub wielkości między różnymi etapami. Ponadto, ponieważ wzrost kości jest procesem dynamicznym, statyczne dwuwymiarowe (2D) obrazy oferują ograniczony wgląd w ruch komórek na płytce wzrostowej, podczas gdy obrazowanie poklatkowe na żywej tkance może dostarczyć cennych informacji na temat zachowania chondrocytów w płytce wzrostowej.

Wszystkie te ograniczenia mogą być potencjalnie rozwiązane za pomocą hodowli kostnych ex vivo. Chociaż protokoły hodowli kości zostały opracowane jakiś czas temu, były one w ograniczonym stopniu stosowane do mysich kości długich. W większości badań wykorzystuje się kości piskląt ze względu na zalety techniczne oferowane przez model piskląt12,13. Kultury organotypowe (granica powietrze/ciecz) zastosowano do embrionalnych kości udowych piskląt, które utrzymywano w hodowli przez 10 dni14. Wyrafinowane narzędzia genetyczne dostępne u myszy sprawiają, że model ten jest bardzo atrakcyjny do stosowania w hodowli kości ex vivo. Badania, w których wykorzystano myszy do zbadania wzrostu kości, dotyczyły głównie kości śródstopia15, prawdopodobnie ze względu na ich mały rozmiar i większą liczbę uzyskaną na zarodek16. Chociaż tradycyjnie uważa się, że kości długie śródstopia wchodzą w proces starzenia się (charakteryzujący się zmniejszoną proliferacją i inwolucją płytki wzrostu17) wcześniej niż inne kości długie in vivo, a zatem ich ciągły wzrost ex vivo tak naprawdę nie podsumowuje procesu in vivo. Na potrzeby tego artykułu będziemy używać terminu kości długie dla kości z bliższego i pośredniego odcinka kończyny. W kilku poprzednich badaniach wykorzystano długie kości mysie, takie jak kość piszczelowa, w hodowlach ex vivo i zaobserwowano znaczny wzrost chrząstki, ale niewielkie kostnienie18. Ostatnio korzystaliśmy również z kultur piszczelowych, głównie do badania dynamiki chondrocytów19. W innych badaniach wykorzystano głowy kości udowej młodych myszy20 lub tylko dystalną część kości udowej dla culture21. Niektóre nowsze prace z powodzeniem łączą hodowlę ex vivo pełnych kości z obrazowaniem poklatkowym w celu uzyskania trójwymiarowych (3D) filmów chondrocytów w żywej tkance myszy22,23. Autorom udało się zaobserwować wcześniej niezauważone zdarzenia w rearanżacji chondrocytów do strefy proliferacyjnej23 w dobrym przykładzie potencjalnego zastosowania hodowli kości ex vivo. Alternatywa, czyli analiza obrazów statycznych, wymaga technik pośrednich i złożonych. Zostało to zilustrowane w niedawnym badaniu oceniającym znaczenie klonów zorientowanych poprzecznie dla wzrostu chrząstki, w którym zastosowano śledzenie genetyczne z wielokolorowymi szczepami myszy reporterowych w połączeniu z modelowaniem matematycznym24. Dlatego hodowla ex vivo może pomóc w uzyskaniu wglądu w dynamiczne procesy w szybszy i prostszy sposób.

Tutaj prezentujemy metodę hodowli mysich kości długich, która może być połączona z różnymi zabiegami molekularnymi i/lub z poklatkowym obrazowaniem na żywo. Ten protokół dostosowuje metody używane w poprzednich raportach15,18,25, ale rozwiązuje kilka dodatkowych problemów i skupia się na kościach długich, takich jak kość piszczelowa, a nie na kościach śródstopia. Na koniec zbadano potencjał wykorzystania statystycznie potężnych porównań par poprzez hodowlę oddzielnie lewej i prawej kości w obecności różnych substancji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi wytycznymi rządowymi i instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi.

1. Przygotowania przed Dniem Hodowli Kości

  1. Ustaw kojarzenie myszy w czasie, aby uzyskać płody i młode od 14,5 dnia embrionalnego (E14,5) i później.
    nuta: Kultura kości długich może być z powodzeniem stosowana do różnych szczepów myszy; w niniejszym protokole wykorzystuje się niekrewniacze szwajcarskie myszy typu dzikiego Webster.
  2. Przygotować pożywkę separacyjną (zaadaptowaną z Houston et al.15): rozcieńczyć α minimum pożywkę niezbędną (α-MEM) lub zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco 1/13 w buforowanej fosforanie soli fizjologicznej (PBS) i 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i przefiltrować przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm i średnicy 33 mm. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  3. Dzień przed ekstrakcją płodów należy przygotować pożywkę do hodowli kości bez surowicy składającą się z DMEM zawierającego 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutaminy, 40 U/ml penicyliny/streptomycyny, 0,05 mg/ml kwasu askorbinowego i 1 mM betaglicerofosforanu. Filtr sterylizować przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm i średnicy 33 mm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  4. W dniu hodowli i przed ubojem myszy należy przygotować 24-dołkowe płytki i szalki o średnicy 60 mm z podłożem preparacyjnym i utrzymywać je w lodowatym chłodzie. Podgrzej pożywkę do hodowli kości w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozpyl 80% (v/v) etanolu na narzędzia (pęsety i małe nożyczki), które mają być używane do pracy z płodem. Przenieś lunetę lornetkową do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

2. Kultura kości piszczelowej i udowej płodu oraz noworodka

  1. Usunąć ciężarną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy na pożądanym etapie ciąży (w zakresie od E14,5 do E18,5). Jeśli używane są nowonarodzone szczenięta, usuwaj je pojedynczo z matki i zabijaj przez ścięcie.
  2. Umieść mysz na jej plecach i wysterylizuj okolicę brzucha, rozpylając 80% (v/v) etanolu na jej powierzchnię.
  3. Przetnij skórę i mięsień brzucha małymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do rogów macicy.
  4. Wyciągnij macicę z jamy brzusznej za pomocą pęsety i małych nożyczek, usuwając mezometrium i przecinając podstawę rogów. Umieść macicę na szalce Petriego o średnicy 60 mm z lodowatą pożywką separacyjną i trzymaj szalkę hodowlaną na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
  5. Przenieś szalkę Petriego wraz z macicą do szafki bezpieczeństwa biologicznego i tam pracuj od teraz.
  6. Oddziel poszczególne płody nożyczkami, przecinając między workami.
  7. Przenieś pojedynczy worek pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym do czystej naczynia o średnicy 60 mm z pożywką separacyjną i otwórz je pęsetą, aby oddzielić płody od łożyska i oczyścić je z błon.
    nuta: Pracuj z jednym zarodkiem na raz, pozostawiając resztę na lodzie.
  8. Odciąć głowy płodom i przenieść ciało do czystego, nowego naczynia o średnicy 60 mm za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml.
  9. Usuń skórę płodów lub szczeniąt pęsetą, zaczynając od tyłu i obierając ją aż do palców u stóp.
  10. Oddziel tylne kończyny od ciała, przecinając pęsetą blisko kręgosłupa i przenieś je do czystego naczynia z lodowatym podłożem preparacyjnym
    11. .
  11. Oddziel kość piszczelową od kości udowej za pomocą pęsety, ostrożnie wprowadzając je między powierzchnię chrząstki dystalnej kości udowej i bliższej kości piszczelowej.
  12. Usuń kości biodrowe z bliższej kości udowej i kości piętowej oraz kości strzałkowej i strzałkowej z kości piszczelowej.
  13. Ostrożnie usuń tkankę miękką z kości udowej i piszczelowej, szczypiąc ją i ściągając.
    nuta: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej tkanki miękkiej, zwracając szczególną uwagę na usunięcie tkanki łączącej dwa bieguny chrząstki, ale unikając uszkodzenia chrząstki, okołochrzęstnej i kości.
  14. Umieść cztery kości (lewą i prawą piszczel i kości udowe) w pierwszym dołku 24-dołkowej płytki za pomocą plastikowej sterylnej pipety o pojemności 1 ml. Alternatywnie, aby porównać wpływ różnych zabiegów na lewą i prawą kończynę, umieść kończyny przeciwległe w różnych studzienkach.
    nuta: Należy zachować szczególną ostrożność podczas przenoszenia kości do studzienek, ponieważ mogą one łatwo przykleić się do pipety.
  15. Postępuj w ten sam sposób z tyloma płodami, ile to konieczne.
    nuta: Zmień naczynie z podłożem preparacyjnym, gdy tylko stanie się zbyt mętne, ponieważ ważne jest, aby wyraźnie zobaczyć wypreparowane kości.
  16. Gdy wszystkie pożądane kości zostaną przeniesione do studzienek, usuń pożywkę preparacyjną za pomocą plastikowej sterylnej pipety o pojemności 1 ml i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zassać kości.
    1. W zależności od celu eksperymentu, można zrobić zdjęcia kości przed usunięciem podłoża preparacyjnego, jako punkt zerowy eksperymentu. Rób zdjęcia mikroskopem podłączonym do aparatu cyfrowego i opisuj użytą ekspozycję i skalę. Aby zapewnić łatwe i wiarygodne pomiary, rób zdjęcia z dobrym kontrastem, aby odróżnić zmineralizowaną część.
  17. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Jeśli jakiekolwiek leczenie jest przeznaczone na kości (doksycyklina, tamoksyfen, czynniki wzrostu itp.), należy je dodać teraz.
  18. Aby zaobserwować efekt zahamowania wzrostu w warunkach hodowli, należy potraktować lewe piszczele kwasem retinowym (RA, 500 nM), podczas gdy prawe piszczele inkubuje się z równoważną objętością nośnika (dimetylosulfotlenek [DMSO], stężenie końcowe 0,1%) jako kontrolę.
  19. Pozostawić kości do wzrostu na dwa dni lub dłużej w inkubatorze do hodowli komórkowych w standardowych warunkach hodowli komórkowej (w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    20. ).
  20. Aby ocenić proliferację, dodać 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU) lub 5-bromo-2'-deoksyurydynę (BrdU) do pożywki w końcowym stężeniu 10 μM 1−2 h przed utrwaleniem.
    nuta: Stężenie zapasów EdU wynosi 20 mM.
    ostrożność: EdU i BrdU są analogami tymidyny i mogą być toksyczne i mutagenne.
  21. Rozmrozić 4% paraformaldehydu (PFA) i utrwalić kości przez zanurzenie w PFA w pojedynczych probówkach o pojemności 2 ml.
    ostrożność: PFA jest toksyczny i oznaczony jako prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi. Unikaj wdychania proszku i par paraformaldehydu. EdU i BrdU są analogami tymidyny i mogą być toksyczne i mutagenne.
  22. Po krótkiej, 10-minutowej fiksacji w PFA w temperaturze pokojowej, przenieś kości do PBS w celu uzyskania obrazu w końcowym punkcie czasowym. Następnie umieść kości z powrotem w PFA w celu utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.
  23. Po utrwaleniu kości mogą być przetwarzane do pożądanych dalszych zastosowań.

3. Pomiar i analiza pełnej długości kości i obszaru zmineralizowanego

  1. Użyj oprogramowania do edycji obrazu, aby zmierzyć długość kości, biorąc pod uwagę skalę obrazu. Zmierz zarówno całkowitą długość kości, jak i zmineralizowany obszar. Rozpocznij pomiary od pierwszych ciemnych komórek na jednym końcu do ostatnich na drugim końcu.
    nuta: Zmineralizowany obszar charakteryzuje się ciemniejszym kolorem i można go łatwo odróżnić od chrząstki.
  2. Aby obliczyć tempo wzrostu, zdefiniowane jako średni wzrost długości na dzień, podziel różnicę między końcową długością kości a początkową przez liczbę dni w hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowlę kości można prowadzić, rozpoczynając od różnych etapów rozwoju. Na Rysunku 1A-D przedstawiono porównanie hodowanej kości piszczelowej z kośćmi świeżo wyizolowanymi na odpowiadających sobie etapach. Pierwszą obserwacją jest fakt, że do dwóch dni hodowli osiągnięty rozmiar jest porównywalny z wzrostem kości in vivo, zarówno w przypadku chrząstki, jak i zmineralizowanej kości (Rysunek 1A,B,D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody hodowli kości ex vivo są stosowane od pewnego czasu do oceny biologii wzrostu kości28, ale rzadko są stosowane do mysich kości długich. Wraz z rozwojem technik obrazowania, hodowla kości ex vivo oferuje atrakcyjny sposób badania wzrostu kości w czasie rzeczywistym w warunkach bardzo zbliżonych do warunków in vivo. W tym scenariuszu ważne jest zdefiniowanie warunków, w których wzrost kości długich jest porównywalny z ich wzrostem in vivo.

W niniejszym badaniu opis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Alexandrze Joyner za jej wsparcie, kiedy ten protokół był ustanawiany, Edwinie McGlinn i Yi-cheng Chang za udostępnienie kwasu retinowego. Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez dotacje rządu stanowego Wiktorii i rządu australijskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-etynylo-2'-deoksyurydynaSanta CruzCAS 61135-33-9
5-bromo-2′-deoksyurydynaSigmaB5002
50 ml stożkowe probówki wirówkoweFalcon352070
60 mm Naczynie do hodowli organów w studzience centralnej z powłoką TC, 20 sztuk w opakowaniu, 500 sztuk w opakowaniu, sterylnysokół353037
Adobe PhotoshopAdobeCS4
Kwas askorbinowySigmaA92902
Jednostka bazowa do lunetyZeiss435425-9100-000
BetaglicerofosforanSigmaG9422
LornetkaZeissSTEMI-2000
Frakcja albuminy surowicy bydlęcej (BSA) vRoche/Sigma10735086001
Aparat DigiRetina 500Zestaw do
Cumper RobbinsPFS00034
DMEMGibco11960044
DMSOSigmaD8418
Eppendorf 2 mL probówki Eppendorf0030120094
Etanol 96%Merk159010
Kleszcze Dumont#5 Inox08Fine Science ToolsT05811
Inkubator CO2 Heracell 150Thermo Fisher51026282
Minimum Essential Medium EagleSigmaM2279
Multiwell 24 dołkiFalcon353047
ParaformaldehydeSigma158127
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140-122
Pipety plastikowe 1 ml Sterylne Pakowane pojedynczoThermo273
Filtr strzykawkowy 0,2 umNauki BiologicznePN4612
Strzykawka Terumo 20 mlTerumoDVR-5174
Tretinoina (kwas retinowy)SigmaPHR1187-3X
Teleskop trinetowyAunetAZS400T
rozwarstwiania Aunet

Bibliografia

  1. Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).
  2. Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
  3. Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
  4. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  5. Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
  6. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
  7. Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
  8. Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
  9. Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820(2014).
  10. Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
  11. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
  12. Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653(2015).
  13. Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
  14. Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
  15. Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  16. Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
  17. Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263(2018).
  18. Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18(2007).
  19. Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086(2018).
  20. Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818(2016).
  21. Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306(2013).
  22. Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332(2018).
  23. Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
  24. Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
  25. Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
  26. De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
  27. Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212(2015).
  28. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
  29. Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
  30. Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
  31. Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
  32. Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla kości ex vivoprotokół hodowli kości piszczelowejanaliza wzrostu kościmineralizacja chrząstkitechnika obrazowania na żywotraktowanie kwasem retinowymznakowanie analogami tymydynyfiksacja paraformaldehydempomiar długości kości
Hodowla i pomiar kości długich myszy płodu i noworodka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.