Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u Drosophila melanogaster

10.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59510

⸱

19 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy szczegółowy protokół oceny profili toksykologicznych nanocząstek tlenku (NPs ZnO), w szczególności rodzaju śmierci komórki w ludzkich fibroblastach płuc MRC5 i tworzenia ROS u muszki owocowej Drosophila.

Streszczenie

Nanocząstki tlenku (ZnO NPs) mają szeroki zakres zastosowań, ale liczba doniesień o toksyczności związanej z ZnO NP gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Jednak badania, które wyjaśniają mechanizmy leżące u podstaw toksyczności indukowanej przez ZnO NP, są skąpe. Określiliśmy profile toksyczności nanocząsteczek ZnO za pomocą modeli eksperymentalnych zarówno in vitro, jak i in vivo. Zaobserwowano znaczny spadek żywotności komórek w fibroblastach płuc MRC5 narażonych na ZnO NP, co pokazuje, że NP ZnO wywierają działanie cytotoksyczne. Podobnie, co ciekawe, jelita wystawione na działanie nanocząsteczek ZnO wykazywały dramatyczny wzrost poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) u muszki owocowej Drosophila. Konieczne są bardziej dogłębne badania w celu ustalenia oceny ryzyka związanego ze zwiększonym stosowaniem nanocząsteczek ZnO przez konsumentów.

Wprowadzenie

Nanotechnologia odnosi się do zastosowania materiałów o rozmiarach nano, które są używane we wszystkich dziedzinach nauki, w tym w medycynie, materiałoznawstwie i biochemii. Na przykład nanocząsteczki ZnO, które są znane ze swojego rozpraszania w ultrafiolecie, wykrywania chemicznego i właściwości przeciwdrobnoustrojowych, a także wysokiej przewodności elektrycznej, są wykorzystywane do produkcji różnych produktów konsumenckich, takich jak opakowania do żywności, kosmetyki, tekstylia, gumy, baterie, katalizator do oczyszczania spalin samochodowych i zastosowania związane z biomedycyną1,2,3.

Jednak rosnące zastosowania produktów na bazie ZnO NPs, prowadzące do zwiększonej ekspozycji ludzi na NPs, wzbudziły obawy co do ich potencjalnego negatywnego wpływu na zdrowie ludzi. Szereg badań komórkowych in vitro wykazało, że nanocząsteczki ZnO mogą indukować stres oksydacyjny, cytotoksyczność związaną z autofagią, stan zapalny i genotoksyczność4,5,6,7,8. W szczególności zakłada się, że toksyczność nanocząsteczek ZnO jest spowodowana rozpuszczaniem Zn w celu uwolnienia jonówZn 2+, a także reaktywnością powierzchniową ZnO, co powoduje zaburzenia równowagi jonowej i metabolicznej komórek, które są związane z upośledzoną homeostazą jonową i hamowaniem transportu jonów4,7,9,10. Co ważne, badania wykazały, że wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) jest jednym z podstawowych mechanizmów leżących u podstaw toksyczności związanej z ZnO NPs. Wykazano, że niewystarczająca aktywność antyoksydacyjna po znieważeniu ROS jest odpowiedzialna za wywołanie cytotoksyczności i uszkodzenia DNA9. Toksyczne działanie nanocząsteczek ZnO odnotowano również w modelach zwierzęcych, w tym gryzoni1, danio pręgowany11,12, a także bezkręgowca Drosophila13.

Drosophila służy jako sprawdzony alternatywny model zwierzęcy do badania toksyczności jednostek chemicznych i nanomateriałów (NMs)14,15. Co ważne, istnieje wysoki poziom genetycznego i fizjologicznego podobieństwa między człowiekiem a Drosophila, co uzasadnia użycie Drosophila jako modelu in vivo do oceny reakcji biologicznych na zanieczyszczenia środowiska, takie jak NMs16. Ponadto istnieje wiele zalet stosowania Drosophila ze względu na jego niewielkie rozmiary, krótką żywotność, podatność genetyczną oraz łatwą i opłacalną pielęgnację. Co więcej, Drosophila jest szeroko stosowana do badań genetycznych, biologii molekularnej i rozwojowej, odkąd jej pełny genom został w pełni zsekwencjonowany wiele lat temu w 2000 roku, dzięki czemu nadaje się do różnych wysokoprzepustowych badań przesiewowych i do rozwiązywania nierozwiązanych problemów biologicznych17,18,19,20,21. W ostatnich latach opisano szereg badań związanych z immunotoksycznością przy użyciu różnych typów NP u Drosophila15,22,23,24. Ta fundamentalna nowa wiedza uzyskana w badaniach z wykorzystaniem Drosophila pomogła nam lepiej zrozumieć nanotoksykologię.

ROS jest dobrze znanym winowajcą cytotoksyczności i genotoksyczności powodowanej przez NPs, w szczególności NPs25. ROS to związki chemiczne zawierające tlen o wyższych właściwościach reaktywnych niż tlen cząsteczkowy. Wolne rodniki, takie jak rodnik ponadtlenkowy (O2-), a nawet cząsteczki nierodnikowe, takie jak nadtlenek wodoru (H2O2) mogą działać jako ROS. W normalnych warunkach fizjologicznych są one niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej26, jednak nadmierne ROS spowodowane nadprodukcją lub rozregulowaniem systemu obrony antyoksydacyjnej może powodować stres oksydacyjny, prowadząc do uszkodzenia białek, lipidów i kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)27. Na przykład, wraz ze wzrostem poziomu ROS i jednoczesnym spadkiem poziomu glutationu (GSH), dochodzi do zakłócenia syntezy trifosforanu adenozyny (ATP) i wzrostu poziomu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w pożywce, czego kulminacją jest śmierć komórki27.

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzania analiz komórkowych i genetycznych z wykorzystaniem hodowanych komórek ssaków i Drosophila w celu określenia potencjalnych negatywnych skutków NP ZnO. Przegląd metody zastosowanej do badania toksyczności nanocząsteczek ZnO przedstawiono na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Analiza sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) na komórkach żywych/stałych

  1. Sonikować ZnO NPs w zawiesinie przez 15 min.
  2. Przygotować nanocząsteczki ZnO o różnych stężeniach (np. 0, 10, 25, 50,100 i 200 μg/ml) przy użyciu 1 mg/ml roztworu podstawowego ZnO NP do traktowania hodowanych komórek.
  3. Wysiewaj ludzkie fibroblasty płuc MRC5 (1 x 105 komórek/dołek) na 6-dołkową płytkę hodowlaną dzień wcześniej, a następnie traktuj komórki 2 ml NP ZnO (w trzech powtórzeniach) przez 8 godzin, 16 godzin i 24 godziny.
  4. W każdym punkcie czasowym zebrać komórki, odwirowując przy 300 x g przez 5 minut.
  5. Przemyć osady komórkowe dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  6. Ponownie zawiesić komórki z 1x buforem wiążącym, który składa się z 0,1 M HEPES/wodorotlenku sodu (NaOH), 1,4 M chlorku sodu (NaCl) i 25 mM chlorku wapnia (CaCl2), w stężeniu 1 x 105 komórek na 100 μL.
  7. Dodać 5 μl izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) aneksyny V i 5 μl barwnika DNA jodkiem propidyny (PI) i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT; 25 °C) w ciemności.
  8. Uzupełnij próbki dodatkowymi 400 μl 1x buforu wiążącego przed sortowaniem komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Dla każdej próbki analizowanych jest co najmniej 10 000 komórek.
  9. Wykres słupkowy należy sporządzić w tabeli, korzystając z uzyskanej mediany intensywności.

2. Narażenie NPs ZnO na Drosophila

  1. Dodać 1 ml nanocząstek o różnych stężeniach do fiolek, a następnie 9 ml pokarmu dla much, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mg/mL, 0,25 mg/ml lub 0,5 mg/ml NPs ZnO.
  2. Dokładnie wymieszać nanocząstki z pokarmem w fiolkach za pomocą pipety.
  3. Przed użyciem pozostawić pokarm dla much zawierający nanocząsteczki ZnO do ostygnięcia przez co najmniej 2-3 godziny.
  4. Wprowadzić dorosłe samce i samice much do fiolek na 5 dni i pozwolić im łączyć się w pary i składać jaja (które pojawiają się jako białe plamki) na powierzchni pokarmu.
  5. Usuń muchy rodzicielskie i pozwól jajom przejść dalszy rozwój, który składa się z 4 różnych etapów rozwoju (stadium embrionalne, larwalne, poczwarkowe i dorosłe).

3. Sekcja muchy

  1. Pobrać późne larwy 3. stadium rozwojowe ze ścianki fiolek do analizy. Świeżo złożone jaja zwykle rozwijają się w larwy późnego 3. stadium rozwojowego po 72-120 h w temperaturze pokojowej.
  2. Wyczyść naczynie preparacyjne i napełnij studzienkę pożywką do preparacji/PBS.
  3. Wypreparuj larwy (późne 3stadium rozwojowe) pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy.
  4. Użyj końcówki kleszczy, aby zrobić mały otwór i rozerwać warstwę naskórka larw. Ostrożnie wyciągnij jelito i umieść je w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę Drosophila firmy Schneider, przed etapem utrwalania przy użyciu 1 ml 4% paraformaldehydu (PF).
  5. 3.5Utrwalić jelito w PF przez 10 minut w RT, do kolejnych eksperymentów, takich jak barwienie immunologiczne.

4. Wykrywanie ROS za pomocą barwienia dihydroethidium (DHE)

  1. Traktować larwy różnymi stężeniami nanocząsteczek ZnO, jak opisano w kroku 2.1.
  2. Po wypreparowaniu jelita z larw w 3.stadium rozwojowym, jak opisano w sekcji 3, należy inkubować jelito w pożywce Drosophila Schneidera w temperaturze RT przed wykonaniem barwienia tkanek. Rozpuścić 1 μl barwnika DHE (o stężeniu podstawowym 30 mM) w 1 ml pożywki Schneidera, uzyskując końcowe stężenie robocze 10-30 μM barwnika DHE.
  3. Inkubować jelita przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie myć trzy razy pożywką Schneidera co 5 minut.
  4. Namocuj jelito za pomocą 4% PF (krok opcjonalny) i zamontuj jelito na szkiełkach podstawowych z podłożem zapobiegającym blaknięciu zawierającym 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI). Rejestruj obrazy pod mikroskopem konfokalnym.

5. Pomiar fluorescencji za pomocą oprogramowania ImageJ

  1. Zaimportuj przechwycone obrazy fluorescencyjne uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do oprogramowania ImageJ.
  2. Kliknij menu Analizuj i wybierz Ustaw pomiary.
  3. Wybierz miarę wyjściową, taką jak obszar zintegrowany z intensywnością i średnia wartość szarości.
  4. Kliknij przycisk Zmierz.
  5. Wybierz region bez fluorescencji, aby ustawić tło.
  6. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego Excel i określ skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF), korzystając z obliczeń, jak pokazano poniżej.
    CTCF = Gęstość zintegrowana - (Obszar wybranej komórki X Średnia fluorescencja odczytów tła)
  7. Skonstruuj wykres słupkowy i przeprowadź analizę statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki eksponowane na NP poddano obróbce z użyciem zestawu odczynników do barwienia komórek, a następnie wykonano sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej. Komórki traktowane NP ZnO (panel prawy, dół) wykazują wyższy odsetek komórek we wczesnej (R3) i późnej (R6) fazie apoptozy niż komórki kontrolne (R5, panel lewy, dół). Śmierć komórek w wyniku nekrozy jest oznaczona jako R4 (panel prawy, góra) (Rycina 2). Wyniki testu FITC/Annexin V przeprowadzone...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby ocenić, czy ZnO NP może indukować apoptozę w fibroblastach MRC5, używamy cytometrii przepływowej do odróżnienia komórek od martwiczej lub apoptotycznej śmierci komórki. W normalnych żywych komórkach fosfatydyloseryna (PS) jest zlokalizowana na błonie komórkowej. Jeśli dojdzie do apoptozy, PS jest przemieszczany do zewnątrzkomórkowej płatka błony komórkowej, umożliwiając wiązanie aneksyny V znakowanej fluoresceiną (FITC Aneksyna V)29. Z drugiej strony, jodek propydyny (PI) o czerwonej fluoresce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez grant o numerze R706-000-043-490. Badanie nie reprezentuje poglądu sponsora grantu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15% 4-hydroksybenzoesan metyluSigma Aldrich
4% ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences
cncCK6/TM3, Sba prezent od Dr. Kerppola T
Mąka kukurydziana, glukoza, drożdże piwowarSigma Aldrich
CyAn ADP z Oprogramowanie SummitDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Zestaw do wykrywania apoptozy IBD biosciences556547
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus
GlucolinSupermarket
Oprogramowanie ImageJNIH
MRC5 ludzki fibroblast płucATCCCCL-171
Schneider ' s Drosophila mediumThermo Fisher Scientific21720-024
Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu Vectashield z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyONIG-FLY
Nanocząstki tlenku cynkuSigma Aldrich721077Patrz karta 2

Bibliografia

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Żywotność komórekreaktywne formy tlenucytometria przepływowamikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnafibroblasty płucne MRC5analiza jelitbarwienie anneksyną V
Badanie toksyczności nanocząstek tlenku w hodowli komórkowej i u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.