Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Summary

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Abstract

Istnieje kilka metod wizualizacji oczyszczonych biomolekuł w pobliżu powierzchni. Mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) jest powszechnie stosowaną metodą, ale ma tę wadę, że wymaga znakowania fluorescencyjnego, co może zakłócać aktywność cząsteczek. Problemem jest również fotowybielanie i fotouszkodzenia. W przypadku mikrotubul stwierdziliśmy, że obrazy o jakości podobnej do TIRF można uzyskać za pomocą mikroskopii interferencyjnej (IRM). Sugeruje to, że IRM może być ogólną techniką wizualizacji dynamiki dużych biomolekuł i oligomerów in vitro. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób mikroskop fluorescencyjny może być modyfikowany w prosty sposób w celu uzyskania obrazów IRM. IRM jest łatwiejszy i znacznie tańszy do wdrożenia niż inne techniki kontrastu, takie jak interferencja różnicowa, mikroskopia kontrastowa lub interferometryczna mikroskopia rozpraszająca. Jest również mniej podatna na defekty powierzchniowe i zanieczyszczenia roztworem niż mikroskopia ciemnego pola. Korzystając z IRM, wraz z oprogramowaniem do analizy obrazu opisanym w tym artykule, pole widzenia i liczba klatek na sekundę są ograniczone tylko przez kamerę; za pomocą kamery sCMOS i szerokokątnego oświetlenia długość mikrotubul może być mierzona z precyzją do 20 nm przy szerokości pasma 10 Hz.

Introduction

Obrazowanie mikrotubul bez znaczników jest interesujące, ponieważ omija potrzebę fluorescencyjnego znakowania tubuliny w celu generowania kontrastu na obrazach. Znakowanie fluorescencyjne ma kilka wad: nie jest wykonalne, jeśli stężenie białka jest niskie¹, a fotowybielanie i fotouszkodzenia ograniczają czas obserwacji. Do obrazowania mikrotubul bez znaczników wykorzystano kilka technik, w tym mikroskopię kontrastową z interferencją różnicową (DIC) i mikroskopię ciemnego pola^2,3,4,5. Ostatnio zastosowano również interferometryczną mikroskopię rozpraszania (iSCAT)⁶, mikroskopię rotaccyjno-koherentno-rozpraszającą (ROCS)⁷ oraz przestrzenną mikroskopię interferencji światła (SLIM)⁸. Wszystkie te techniki są zdolne do obrazowania mikrotubul i okazały się cenne w badaniu dynamiki mikrotubul. Jednak każdy z nich ma swoje ograniczenia. W DIC kontrast zależy od kąta między mikrotubulą a osią pryzmatu Nomarskiego. W ciemnym polu sygnał mikrotubul jest degradowany przez rozproszone światło pochodzące od zanieczyszczeń lub wad powierzchniowych. Chociaż iSCAT wykazuje niezwykłą czułość (aż do pojedynczych białek), a ROCS może obrazować mikrotubule głębiej w próbce, obie metody są technicznie wymagające i wymagają skanerów laserowych.

Ten protokół pokazuje, jak mikroskopia interferencyjna (IRM)^{9, 10} może być skonfigurowana jako alternatywna technika obrazowania mikrotubul bez znaczników. IRM jest łatwy do wdrożenia, ponieważ wymaga jedynie dodania niedrogiego lustra 50/50 do standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. W połączeniu z opisanym tutaj oprogramowaniem, IRM tworzy obrazy mikrotubul o wysokim kontraście, może obrazować duże pola widzenia z dużą prędkością, wymaga jednorazowego wyrównania i może być łatwo łączony z innymi technikami, takimi jak obrazowanie fluorescencyjne.

Protocol

1. Modyfikacja mikroskopu i soczewki obiektywu

1. Włóż lustro 50/50 do koła filtrów mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniej kostki filtrującej (Rysunek 1). Z lustrem 50/50 należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ często mają one powłokę antyrefleksyjną.
   UWAGA: Użyliśmy lustra 50/50 w pustej kostce filtrującej mikroskopu. Lustro 50/50 jest wkładane w miejsce, w którym znajduje się lustro dichroiczne.
2. Użyj obiektywu o dużym powiększeniu/oleju o wysokim NA.
   UWAGA: W tym protokole użyliśmy obiektywu 100x/1,3 NA.

2. Przygotowanie komory do przylegania mikrotubul do powierzchni

1. Wyczyść szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm (do mikroskopu pionowego) lub szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm i 18 mm x 18 mm (do mikroskopów odwróconych). W razie potrzeby zmodyfikuj powierzchnię. Na przykład, wyczyść szkiełka nakrywkowe za pomocą alkalicznego detergentu (patrz Tabela materiałów), a następnie 100% etanolu z wodą destylowaną, przemyj pomiędzy i po¹¹.
2. Wytnij paski plastikowej folii parafinowej o szerokości 3 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą żyletki i innego szkiełka mikroskopowego jako krawędzi.
3. Umieść dwa plastikowe paski folii parafinowej w odległości 3 mm od siebie na czystym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm, aby utworzyć kanał. Jeśli używasz mikroskopu pionowego, umieść paski na czystym szkiełku mikroskopowym, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze.
4. Umieść szkiełko nakrywkowe (lub szkiełko) na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C na 10-30 sekund, aby folia parafinowa utworzyła szczelny kanał.
5. Przelać 50 μg/ml przeciwciała (w Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) przez perfuzję za pomocą pipety. Inkubować przez 10 min.
   UWAGA: Używamy przeciwciał anty-rodaminowych do wiązania nasion mikrotubul znakowanych rodaminą z powierzchnią. Alternatywnie, awidyna może być stosowana do wiązania nasion mikrotubul znakowanych biotyną lub do biotynylowanych cząsteczek złota. Aby po prostu przyjrzeć się mikrotubulom przy braku tubuliny w roztworze (tj. Test niedynamiczny), można użyć przeciwciała antytubulinowego.
6. Umyć pięć razy buforem BRB80. Zaleca się filtrowanie roztworów za pomocą filtra 0,22 μm.
7. Przepływ w 1% poloksamerze 407 (kopolimer triblokowy) w BRB80 w celu zablokowania powierzchni przed niespecyficznym wiązaniem. Inkubować przez 10 minut.
8. Umyć pięć razy buforem BRB80.
9. Próbka jest gotowa do umieszczenia w mikroskopie. Aby zapobiec wysychaniu próbki, dodaj dwie kropelki buforu BRB80 na końcach kanału i uzupełnij w razie potrzeby.

3. Wyrównanie mikroskopu

1. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Włącz źródło światła epi-illumination.
2. Skoncentruj się na powierzchni próbki. Będziesz obserwować wiele powierzchni, gdy obiektyw jest przesuwany w górę iw dół z powodu wstecznego odbicia światła od układu optycznego w obrębie ścieżki optycznej. Dobrą metodą znalezienia powierzchni próbki jest skupienie się na krawędzi filmu parafinowego. Po znalezieniu powierzchni ustaw pole widzenia na środku komory.
3. Wyśrodkuj membranę pola w polu view, zamykając ją do połowy i używając regulacyjnych. Po wyrównaniu ponownie otwórz membranę.
   UWAGA: Regulacja musi być wykonywana tylko sporadycznie, być może co 3-6 miesięcy lub podczas rozwiązywania problemów.
4. Wsuń soczewkę Bertranda, aby view źrenica wyjściowa (tylna płaszczyzna ogniskowa) obiektywu.
5. Zamknij przysłonę przysłony (AD) poza krawędziami źrenicy wyjściowej obiektywu.
6. Użyj regulacyjnych, aby wyśrodkować AD ze źrenicą wyjściową. Sprawdź dokładnie, otwierając AD i dopasowując jego krawędzie do krawędzi źrenicy wyjściowej.
   UWAGA: Ta regulacja musi być wykonywana tylko sporadycznie.
7. Ustaw przysłonę przysłony na około 2/3 NA obiektywu. Patrz rozdział 7, aby zapoznać się ze szczegółowymi procedurami optymalizacji przysłony.

4. Obrazowanie stabilizowanych mikrotubul lub cząstek złota o długości 40 nm

UWAGA: Stabilizowane mikrotubule i nanocząstki złota służą jako dobre próbki kontrolne. Zaleca się obrazowanie mikrotubul przyczepionych do powierzchni lub nanocząstek złota jako pierwszy krok do oceny wydajności IRM i pomocy w ustawieniu optymalnego otwarcia membrany apertury (sekcja 7).

1. Ustaw czas naświetlania aparatu na 10 ms i dostosuj oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny kamery.
2. Przepłyń w 10 μl mikrotubul stabilizowanych biosulianem guanylilu (alfa, beta)-metyleno-difosfonianu (GMPCCP) lub taksolem w BRB80^4,12,13 (lub cząstki złota 40 nm) przez perfuzję za pomocą pipety do świeżej próbki i monitorowanie wiązania poprzez obrazowanie powierzchni. Gdy 10-20 mikrotubul znajdzie się w polu widzenia, przemyj próbkę 2x za pomocą BRB80.
   UWAGA: Przy dobrze ustawionym mikroskopie mikrotubule powinny być widoczne bez odejmowania tła.
3. Zrób 10 zdjęć, ustawiając upływ czasu z 1-sekundowym opóźnieniem na 10 sekund (przy ekspozycji 10 ms).
4. Uzyskaj obraz tła. W tym celu należy przesunąć stolik za pomocą kontrolera sceny lub oprogramowania komputerowego wzdłuż długiej osi kanału, jednocześnie uzyskując 100 obrazów bez opóźnień (tj. przesyłanie strumieniowe z prędkością bliską 100 kl./s @ ekspozycja 10 ms).
   UWAGA: Tło to mediana 100 obrazów. Biorąc pod uwagę medianę, profil oświetlenia i inne nieruchome elementy, takie jak zabrudzenia na optyce, są zachowywane, podczas gdy wszystko inne jest odfiltrowywane. Próbka nie powinna być przechylona, ponieważ doprowadzi to do zmiany położenia osiowego podczas przesuwania stolika i ostatecznie pogorszy jakość obrazu tła. Jeśli nie można uniknąć nachylenia, alternatywną metodą jest uzyskanie uśrednionych obrazów tła przed wylaniem nasion.
5. Aby przetworzyć i przeanalizować obrazy, przejdź do kroku 6.

5. Obrazowanie dynamiki mikrotubul

1. W przypadku dynamiki mikrotubul z wykorzystaniem tubuliny mózgowej należy ustawić temperaturę podgrzewacza próbki na 37 °C.
2. Przelej 10 μl nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCCP w BRB80¹¹ przez perfuzję za pomocą pipety do świeżej próbki i monitoruj ich wiązanie z powierzchnią poprzez obrazowanie powierzchni na żywo (tj. podczas strumieniowania). Gdy 10-20 nasion zostanie związanych w polu widzenia, przemyj próbkę za pomocą 2x objętości kanałowej z BRB80 (BRB80 należy wstępnie podgrzać do 37 °C lub co najmniej w temperaturze pokojowej).
   UWAGA: Przy dobrze ustawionym mikroskopie nasiona powinny być widoczne bez odejmowania tła.
3. Przepływ w mieszaninie polimeryzacyjnej (7,5 μM nieznakowanej tubuliny + 1 mM trifosforanu guanozyny (GTP) + 1 mM ditiotreitolu (DTT) w buforze BRB80). Aby zmierzyć wzrost mikrotubul, ustaw film poklatkowy za pomocą oprogramowania do akwizycji, aby uzyskać obraz co 5 sekund (0,2 klatki na sekundę (fps)) przez 15 minut.
4. Aby zwiększyć kontrast, uzyskaj 10 obrazów (zamiast jednego) w każdym punkcie czasowym i uśrednij je. W przypadku skurczu mikrotubul należy uzyskać obrazy z prędkością 100 kl./s, ustawiając opóźnienie czasowe na 0 i czas ekspozycji 10 ms (możliwa jest wyższa liczba klatek na sekundę przy mniejszych obszarach zainteresowania w zależności od używanej kamery).
5. Uzyskaj obraz tła jak w kroku 4.4.

6. Przetwarzanie i analiza obrazu

UWAGA: Do analizy, ten protokół używa Fiji¹⁴, ale czytelnik może swobodnie korzystać z dowolnego oprogramowania, które uzna za odpowiednie.

1. Otwórz zapisane obrazy tła.
2. Oblicz medianę obrazu (tj. tło) za pomocą projektu Obraz > Stos > Z > Mediana.
3. Otwórz film o dynamice mikrotubul jako stos (tak samo dla mikrotubul niedynamicznych) za pomocą polecenia File > Open.
4. Odejmij obraz tła od stosu za pomocą kalkulatora Process > Image. Upewnij się, że zaznaczyłeś opcję "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
5. W przypadku mikrotubul dynamicznych za pomocą narzędzia do tworzenia linii narysuj linię wzdłuż interesującej nas mikrotubuli i dodaj ją do menedżera obszaru zainteresowania, naciskając "t". Powtórz tę czynność dla wszystkich interesujących nas mikrotubul.
6. W przypadku mikrotubul dynamicznych uruchom makro Multi-Kymo (plik uzupełniający 1). Makro wygeneruje wideo i kimograf dla każdej mikrotubuli w menedżerze ROI. Każda mikrotubula otrzyma unikalny identyfikator.
7. W przypadku mikrotubul dynamicznych uruchom makro Kymo-Analysis (plik uzupełniający 2) i postępuj zgodnie z jego krokami, aby zmierzyć tempo wzrostu i kurczenie się mikrotubul.

7. Rozmiar przysłony

UWAGA: Ważnym czynnikiem dla uzyskania obrazów mikrotubul o wysokim kontraście za pomocą IRM jest prawidłowe ustawienie apertury numerycznej oświetlenia (INA^10,15. INA można zmienić, zmieniając rozmiar przychodzącej wiązki świetlnej na źrenicy wyjściowej obiektywu, która jest kontrolowana przez rozmiar AD (AD znajduje się na płaszczyźnie sprzężonej ze źrenicą wyjściową (tylna płaszczyzna ogniskowa) obiektywu, Rysunek 1):

gdzie D_AD jest średnicą przysłony, f_{obiektywu jest} ogniskową obiektywu, a D_ep jest średnicą źrenicy wyjściowej obiektywu. Zazwyczaj AD pozostaje całkowicie otwarty do obrazowania fluorescencyjnego, więc INA jest równa NAc obiektywu. W mikroskopie fluorescencyjnym skala AD nie wskazuje jego średnicy, dlatego nie można obliczyć INA. Możliwe jest skalibrowanie rozmiaru AD za pomocą obiektywu. Nie jest to jednak konieczne, ponieważ rozmiar AD byłby ustalony na rozmiar, który daje najwyższy kontrast.

1. Przygotować próbkę stabilizowanych mikrotubul znakowanych fluorescencyjnie przyklejonych do powierzchni (kroki 4.1-4.2).
   UWAGA: Użyliśmy mikrotubul oznaczonych tetrametylorodaminą¹⁶ (np. 550 nm, Em: 580 nm).
2. Ustaw ostrość mikrotubul za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu, jednocześnie obrazując je fluorescencyjnie (jeśli mikrotubule nie są oznaczone, zobrazuj je za pomocą IRM¹⁵ lub DIC⁵).
3. Ustaw ekspozycję aparatu na 10 ms za pomocą oprogramowania aparatu.
   UWAGA: Ta ekspozycja jest dowolna i ekspozycja 100 ms również będzie działać.
4. Zamknij AD do najmniejszego otworu. Dostosuj oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny kamery lub osiągnąć maksimum możliwości.
   UWAGA: Jako wskazówkę należy skorzystać z tabeli przeglądowej zwykle dostarczanej przez oprogramowanie do akwizycji.
5. Uzyskaj 10 obrazów (przesyłając strumieniowo lub robiąc zdjęcie co sekundę) pola widzenia zawierającego 10+ mikrotubul.
6. Uzyskaj obraz tła jak w kroku 4.4.
7. Zmień rozmiar AD i powtórz kroki 7.5-7.6 dla całego zakresu otwarcia AD (od rozmiaru źrenicy zamkniętej do wyjściowej, Rysunek 2). Za każdym razem, gdy rozmiar AD jest zmieniany, dostosuj intensywność oświetlenia do tej z kroku 7.4.
8. Dla każdego uzyskanego pola widzenia odejmij odpowiednie tło za pomocą kalkulatora obrazu > procesu i wybierając "odejmij" z menu rozwijanego. Upewnij się, że opcja "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)" jest zaznaczona. Następnie uśrednij wynikowe obrazy za pomocą obrazu > stosu > projektu Z > średniej.
9. Zmierz stosunek sygnału do szumu tła (SBR) mikrotubul zdefiniowany jako średnie natężenie sygnału mikrotubuli (intensywność mikrotubuli minus intensywność tła) podzielone przez odchylenie standardowe tła (Rysunek 3).
10. Określ optymalny rozmiar AD (tj. optymalny INA), obliczając średni SBR mikrotubul dla każdego rozmiaru otworu i ustaw rozmiar AD na ten, który daje najwyższy SBR (Rysunek 2). Możliwe, że istnieje szereg rozmiarów AD, które dają porównywalny kontrast¹⁵.

Results

Jak wspomniano powyżej, przy dobrze ustawionym mikroskopie, mikrotubule powinny być widoczne bez odejmowania tła (Rysunek 4A). Odejmowanie tła (Rysunek 4B) zwiększa kontrast mikrotubul (Rysunek 4C). Aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, można zastosować uśrednianie lub filtrowanie Fouriera lub kombinację obu tych metod (rysunek 4D,F,E). Linia skanuje w Rysunek 4G pokazuje stopniową poprawę jakości obrazu. Zwróć uwagę na redukcję szumów tła na każdym etapie przetwarzania.

Przykłady kymografii dynamiki mikrotubul generowanych z filmów poklatkowych są pokazane w Rysunek 5. Filmy zostały zarejestrowane z dwiema szybkościami klatek: 0,2 kl./s (wolno) i 100 kl./s (szybko). Pierwsza z nich nadaje się do pomiaru szybkości wzrostu, podczas gdy druga jest bardziej odpowiednia do pomiaru szybkości skurczu, która jest o rząd wielkości szybsza niż szybkość wzrostu.

Dla przypadku, gdy nanocząstki złota są używane do ustawienia mikroskopu, przykładowy obraz jest pokazany w Rysunek 6. Nanocząstki złota zostały pasywnie przyczepione do powierzchni. Podczas gdy zalecane są cząstki o długości fali 40 nm, możliwe jest również obrazowanie cząstek o długości fali 20 nm, ale przy niższym kontraście.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie usługi IRM. (A) Epi-oświetlenie ze źródła światła przechodzi przez przysłonę apertury przed dotarciem do lustra 50/50. Przysłona aperturowa ustawia szerokość wiązki, a tym samym oświetlenie NA. Lustro 50/50 częściowo odbija światło aż do obiektywu, aby oświetlić próbkę. Światło odbite od próbki jest zbierane, a następnie rzutowane na chip kamery (przez soczewkę tubusu), gdzie zakłóca generowanie obrazu. Kontrast obrazu jest wynikiem interferencji między światłem odbitym od granicy faz szkło/woda (I1) a światłem odbitym od granicy faz woda/mikrotubula (I2). W zależności od odległości między mikrotubulą a powierzchnią (h), różnica ścieżek optycznych między I1 i I2 spowoduje konstruktywny (jasny sygnał) lub destrukcyjny (ciemny sygnał) lub cokolwiek pomiędzy. Na przykład, jeśli do obrazowania używa się światła o długości fali 600 nm, kontrast zmieni się z ciemnego na jasny, gdy wysokość mikrotubuli zmieni się o około 100 nm. Gwiazdka oznacza płaszczyzny sprzężone (zmodyfikowane z¹⁵). (B) Przykład instalacji lustra 50/50. Otwarto odpowiednią kostkę filtracyjną i włożono lustro w miejsce, w którym zwykle znajduje się lustro dichroiczne. Lustro zostało zorientowane zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie kostkę włożono do koła filtrów, które zostało włożone z powrotem do mikroskopu (nie pokazano). Podczas montażu użyto rękawiczek, a lustro było przytrzymywane tylko za krawędzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Optymalne ustawienie przysłony przysłony. (A) To samo pole widzenia zostało zobrazowane przy różnych otworach przysłony bez odejmowania tła. Wizualnie kontrast zwiększał się wraz ze wzrostem rozmiaru przysłony przysłony, aż osiągnął plateau, a następnie zaczął ulegać degradacji. Zostało to potwierdzone przez pomiary (B) SBR odjętych obrazów tła. Słupki błędów są odchyleniem standardowym. Podziałki mają średnicę 500 μm (AD) i 3 μm (mikrotubule). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Pomiar stosunku sygnału do szumu tła. Mikrotubule wyizolowano w obszarach zainteresowania. Każdy obszar zainteresowania został wyznaczony do oddzielenia mikrotubuli od tła. Średni sygnał mikrotubuli uzyskano ze skanu liniowego w poprzek mikrotubul. Szerokość linii skanowania została ustawiona tak, aby była równa długości mikrotubul. W ten sposób każdy punkt na skanie jest średnią sygnałów wszystkich pikseli wzdłuż osi mikrotubul, które są równoległe do tego punktu. Szum tła to odchylenie standardowe wszystkich pikseli poniżej progu odcięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przetwarzanie obrazu. Po uzyskaniu surowych obrazów (A) tło (B) zostało odjęte (C) w celu zwiększenia kontrastu mikrotubul. Aby jeszcze bardziej poprawić kontrast, obrazy zostały uśrednione (D) lub przefiltrowane Fourierem (E) lub oba (F). Skany linii (G), których położenie jest oznaczone przerywaną czerwoną linią w (A), są dopasowane kolorystycznie do różnych obrazów w (A) do (F). Liczby w dolnym rogu to średnie SBR mierzone dla całego pola widzenia. Podziałka wynosi 5 μm (zmodyfikowana z¹⁵) . Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Przykłady kymografów. (A) Kymograficzne przykłady dynamiki mikrotubul generowanej z filmów poklatkowych uzyskanych przy 0,2 kl./s. (B) Kymograf przedstawiający przykład zdarzenia skurczu generowanego z filmu zarejestrowanego przy 100 klatkach na sekundę. Przerywane linie oznaczają nasiona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Przykład nanocząstek złota zobrazowanych za pomocą IRM. Nanocząstki złota o rozmiarach 20 i 40 nm zostały pasywnie przymocowane do powierzchni. Pozyskano 10 obrazów. Po odjęciu tła obrazy zostały uśrednione w celu zwiększenia kontrastu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Długość mikrotubul Precyzja śledzenia w obrazach IRM. Stabilizowane mikrotubule (tj. o stałych długościach) były obrazowane 200x przy 100 kl./s, a następnie uśredniane do 10 kl./s w celu zwiększenia kontrastu. Następnie zmierzono długość mikrotubul za pomocą oprogramowania śledzącego Fiesta¹⁷. Dla każdej mikrotubuli obliczono średnią długość i odchylenie standardowe, jak pokazano na rysunku (linia przerywana oznacza średnią, a czerwone linie ciągłe reprezentują odchylenie standardowe, długość = 3971 ± 20 nm. Ogólna precyzja śledzenia była średnią odchylenia standardowego wszystkich śledzonych mikrotubul (n = 6 mikrotubul x 20 punktów danych = 120 punktów danych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Protokół ten wykazał udane wykorzystanie IRM do obrazowania i pomiaru dynamiki mikrotubul. Należy zwrócić uwagę na prawidłowe ustawienie przysłony numerycznej oświetlenia, ponieważ ma ona największy wpływ na kontrast obrazu. Ponadto używanie obiektywów o dużej aperturze numerycznej (NA) jest ważne dla uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości/wysokim kontraście, ponieważ obiektywy o wyższej NA mają większą moc zbierania światła w porównaniu z obiektywami o niskiej NA. Im czystsza powierzchnia i użyte roztwory, tym niższy szum, ponieważ brud ostatecznie przyczepia się do powierzchni i dodaje (w trakcie eksperymentu) plamki przypominające szum do obrazów. Akwizycja obrazu tła jest ważna, ponieważ usuwa niejednorodności oświetlenia, szumy statyczne i nierówności powierzchni.

Zalecaną modyfikacją jest wprowadzenie filtra długoprzepustowego (>600 nm) w torze oświetlenia. Widmo źródeł światła białego zazwyczaj zawiera długości fal w promieniowaniu UV, które mogą uszkadzać mikrotubule. Ponadto wykorzystanie długiej długości fali dla IRM jest przydatne przy łączeniu IRM z fluorescencją (np. podczas badania wpływu białek związanych z mikrotubulami (MAP) na dynamikę mikrotubul). Należy pamiętać, że podczas obrazowania przez dłuższy czas dryf próbki (zwłaszcza wzdłuż osi optycznej) zmniejsza kontrast obrazu z powodu odchylenia płaszczyzny obrazu od płaszczyzny tła. Nowoczesne mikroskopy są często wyposażone w mechanizmy stabilizacji (np. perfect focus (Nikon), Definite focus.2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Alternatywnym rozwiązaniem jest stabilizacja termiczna układu pasywnie lub aktywnie¹⁸ lub poprzez korektę dryfu 19,20,21. Wreszcie, kontrast mikrotubul można zwiększyć, zmniejszając rozmiar przysłony pola (dobrym wyborem jest otwór 70%, ponieważ zapewnia równowagę między wzrostem kontrastu a wielkością pola widzenia)¹⁵.

Chociaż IRM nadaje się do obrazowania mikrotubul, nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć pojedyncze białka. Do takiego zastosowania bardziej odpowiednią techniką jest iSCAT. Podobnie fluorescencja i iSCAT są lepiej przystosowane, jeśli wymagana jest precyzja śledzenia mniejsza niż 10 nm. W przypadku IRM zmierzona precyzja śledzenia długości wynosi ~20 nm, jak pokazano na rysunku 7.

Zastosowanie IRM w testach powierzchniowych może wykraczać poza mikrotubule; Na przykład silniki molekularne mogą być znakowane nanocząstkami złota i śledzone podczas interakcji z mikrotubulami. Ponadto bardziej zaawansowana forma IRM, znana jako refleksyjna interferencyjna mikroskopia kontrastowa (RICM)²² , może być zasadniczo stosowana w celu dalszego zwiększenia kontrastu mikrotubul i uzyskania wyższej precyzji śledzenia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop	Nikon	Ti-Eclipse	Odwrócony mikroskop służący do wykonywania analiz
rozdzielacz wiązki 50/50	Chroma	21000	Kupując, upewnij się, że wybierasz wymiary rozdzielacza, które pasują do kostki używanej w mikroskopie
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris	Nikon	MRH02902	Obrazowanie. Ten obiektyw ma regulację NA, tęczówkę, która została otwarta na NA 1.3
Mucasol uniwersalny detergent	Sigma-aAldrich	Z637181-2L	Służy do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek
z tworzywa sztucznego folia parafinowa (nazwa handlowa Parafilm M)	Sigma-aAldrich	P7793	Służy do budowy kanałów przepływowych
Przeciwciało anty-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Służy do wiązania cząsteczek znakowanych TAMRA (np. mikrotubuli) z powierzchnią próbki. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nazwa handlowa Pluronic F-127)	Sigma-aAldrich		Służy do blokowania powierzchni kanału w celu zapobieżenia niespecyficznemu wiązaniu
nanocząstek złota 40 nm	Sigma-aAldrich	753637	Stosowany jako próbka kontrolna
Nanocząstki złota 20 nm	Sigma-aAldrich	753610	Używany jako próbka kontrolna
Zyla 4.2 Aparat fotograficzny	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 pikseli (6,5&mikro; m rozmiar piksela) z wydajnością kwantową 72% i 16-bitowym zakresem dynamiki
		śledzące Feista	https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
Stabilizowane mikrotubule			przygotowane we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)