Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Neuromodulacja, znana również jako powolna transmisja synaptyczna, narzuca silną kontrolę nad funkcjonowaniem mózgu podczas różnych stanów zachowania, takich jak stres, pobudzenie, uwaga i lokomocja^1,2,3,4. Pomimo swojego znaczenia, badanie tego, kiedy i gdzie zachodzą zdarzenia neuromodulacyjne, jest wciąż w powijakach. Neuromodulatory, w tym acetylocholina, dopamina, noradrenalina, serotonina i wiele neuropeptydów, aktywują receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które z kolei uruchamiają wewnątrzkomórkowe szlaki drugiego przekaźnika w szerokim oknie czasowym od sekund do godzin. Podczas gdy każdy neuromodulator wyzwala odrębny zestaw zdarzeń sygnalizacyjnych, szlak cAMP/kinazy białkowej A (PKA) jest wspólnym szlakiem dla wielu neuromodulatorów^1,5. Szlak cAMP/PKA reguluje pobudliwość neuronów, przekaźnictwo synaptyczne i plastyczność^6,7,8,9, a tym samym dostraja dynamikę sieci neuronalnej. Ponieważ różne neurony lub typy neuronów wyrażają różne typy lub poziomy receptorów neuromodulatora¹⁰, wewnątrzkomórkowe efekty tego samego neuromodulatora zewnątrzkomórkowego mogą być niejednorodne w różnych neuronach, a zatem muszą być badane z rozdzielczością komórkową. Do tej pory wyzwaniem pozostaje monitorowanie zdarzeń neuromodulacyjnych w poszczególnych neuronach in vivo podczas zachowania.

Aby zbadać czasoprzestrzenną dynamikę neuromodulacji, wymagana jest odpowiednia metoda nagrywania. Mikrodializa i woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania są często używane do badania uwalniania neuromodulatorów, ale brakuje im rozdzielczości przestrzennej do monitorowania zdarzeń komórkowych^11,12. Analogicznie do dynamiki wapnia używanej jako wskaźnik zastępczy dla aktywności elektrycznej neuronów w obrazowaniu populacji¹³, obrazowanie PKA może być używane do odczytywania zdarzeń neuromodulacyjnych w populacji neuronów w rozdzielczości komórkowej. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie ulepszonego reportera aktywności kinazy A (AKAR) do monitorowania aktywności PKA in vivo podczas zachowania zwierząt. Opisana tutaj metoda pozwala na jednoczesne obrazowanie populacji neuronów w rozdzielczości subkomórkowej z rozdzielczością czasową, która śledzi fizjologiczne zdarzenia neuromodulacyjne.

AKAR składają się z donora i akceptora białek fluorescencyjnych połączonych peptydem substratu fosforylacji PKA i domeną związaną z forkheadem (FHA), która wiąże się z fosforylowaną seryną lub treoniną substratu^14,15. Po aktywacji szlaku PKA peptyd substratowy AKAR ulega fosforylacji. W rezultacie domena FHA wiąże się z fosforylowanym peptydem substratowym, zbliżając w ten sposób dwa fluorofory do siebie, co określa się jako stan zamknięty AKAR. Stan zamknięty fosforylowanego AKAR powoduje zwiększony transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi. Ponieważ proporcja fosforylowanych AKAR jest związana z poziomem aktywności PKA¹⁶, ilość FRET w próbce biologicznej może być wykorzystana do ilościowego określenia poziomu aktywności PKA^{16,17,18,19,20}.

Wczesne wersje AKAR-ów były przeznaczone głównie do dwukolorowego obrazowania ratiometrycznego¹⁴. Podczas obrazowania w głąb tkanki mózgowej metoda ratiometryczna cierpi na zniekształcenia sygnału spowodowane rozpraszaniem światła zależnym od długości fali^17,18,21. Jak omówiono poniżej, mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) eliminuje ten problem, ponieważ FLIM mierzy tylko fotony emitowane przez fluorofor^18,21. W rezultacie, na kwantyfikację FLIM FRET nie ma wpływu głębokość tkanki¹⁷. Ponadto można zastosować "ciemny" (tj. o niskiej wydajności kwantowej [QY]) wariant fluoroforu akceptorowego. Zwalnia to kanał koloru, aby ułatwić multipleksowany pomiar ortogonalnych właściwości neuronów poprzez jednoczesne obrazowanie drugiego czujnika lub markera morfologicznego^17,19,20.

Obrazowanie FLIM określa ilościowo czas, jaki fluorofor spędza w stanie wzbudzonym, tj. czas życia fluorescencji¹⁸. Powrót fluoroforu do stanu podstawowego, a więc koniec stanu wzbudzonego, często towarzyszy emisji fotonu. Chociaż emisja fotonu dla pojedynczej wzbudzonej cząsteczki jest stochastyczna, w populacji średni czas trwania fluorescencji jest cechą charakterystyczną tego konkretnego fluoroforu. Gdy czysta populacja fluoroforów jest wzbudzana jednocześnie, powstała fluorescencja będzie następować po pojedynczym rozpadzie wykładniczym. Stała czasowa tego wykładniczego rozpadu odpowiada średniemu czasowi życia fluorescencji, który zwykle waha się od jednej do czterech nanosekund dla białek fluorescencyjnych. Powrót wzbudzonego fluoroforu dawcy do stanu podstawowego może również nastąpić za pomocą FRET. W obecności FRET czas trwania fluorescencji fluoroforu dawcy ulega skróceniu. Nieufosforylowane AKAR wykazują stosunkowo dłuższy czas życia fluorescencji donora. Po fosforylacji przez PKA czujnik wykazuje krótszą żywotność, ponieważ fluorofory donorowe i akceptorowe są zbliżane do siebie, a FRET jest zwiększony. Kwantyfikacja czasu życia fluorescencji w populacji AKAR reprezentuje zatem poziom aktywności PKA.

Wczesne wersje AKAR nie były skutecznie używane do obrazowania in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki. Wynika to głównie z niskiej amplitudy sygnału czujników AKAR do aktywacji fizjologicznych¹⁷. Niedawno, poprzez systematyczne porównywanie dostępnych czujników AKAR do mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (2pFLIM), stwierdzono, że czujnik o nazwie FLIM-AKAR przewyższa alternatywne czujniki. Ponadto opracowano szereg wariantów FLIM-AKAR zwanych celowanymi AKAR (tAKARs) w celu wizualizacji aktywności PKA w określonych lokalizacjach subkomórkowych: mikrotubulach (tAKARα), cytozolu (tAKARβ), aktyny (tAKARδ), aktyny nitkowatej (tAKARε), błonie (tAKARγ) i gęstości postsynaptycznej (tAKARζ). Wśród tAKAR, tAKARα zwiększył amplitudę sygnału wywoływanego przez noradrenalinę 2,7-krotnie. Jest to zgodne z wiedzą, że większość PKA w neuronach jest zakotwiczona w mikrotubulach w stanie spoczynku^22,23. tAKARα osiągnął najlepsze wyniki spośród istniejących AKAR dla 2pFLIM. Co więcej, tAKARα wykrył fizjologicznie istotną aktywność PKA wywołaną przez wiele neuromodulatorów, a ekspresja tAKARα nie zmieniła funkcji neuronalnych¹⁷.

Niedawno, tAKARα został z powodzeniem wykorzystany do wizualizacji działań PKA u myszy zachowujących się jak myszy z głową¹⁷. Wykazano, że wymuszona lokomocja wyzwala aktywność PKA w somie neuronów warstwy powierzchownej (warstwy od 1 do 3, do głębokości ~300 μm od pia) w korze ruchowej, lufowej i wzrokowej. Aktywność PKA wyzwalana przez lokomocję była częściowo zależna od sygnalizacji za pośrednictwem receptorów β-adrenergicznych i receptorów dopaminy D1, ale nie miała wpływu na antagonistę receptora dopaminy D2. Praca ta ilustruje zdolność tAKAR do śledzenia zdarzeń neuromodulacji in vivo przy użyciu 2pFLIM.

W obecnym protokole, cała metoda obrazowania aktywności PKA u myszy z głową unieruchomionych podczas paradygmatu wymuszonej lokomocji jest opisana w sześciu krokach. Po pierwsze, dodanie możliwości 2pFLIM do konwencjonalnego mikroskopu dwufotonowego (Rysunek 1). Po drugie, budowa bieżni z napędem silnikowym (Rysunek 2). Po trzecie, ekspresja czujnika tAKARα w korze myszy poprzez elektroporację in utero (IUE) plazmidów DNA lub stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Doskonałe protokoły operacyjne dla IUE^24,25 i stereotaktycznego wstrzykiwania cząstek wirusa²⁶ zostały wcześniej opublikowane. Kluczowe parametry, których użyliśmy, zostały opisane poniżej. Po czwarte, instalacja okna czaszkowego. Wcześniej opublikowano doskonałe protokoły dla chirurgii okna czaszki^27,28. Opisano kilka kroków, które zostały zmodyfikowane w stosunku do standardowych protokołów. Po piąte, wykonanie in vivo 2pFLIM. Po szóste, analizy obrazów 2pFLIM (Rysunek 3 i Rysunek 4). To podejście powinno być łatwo stosowane do wielu innych paradygmatów behawioralnych i obszarów mózgu.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zdrowia i Nauki w Oregonie.

1. Konfiguracja mikroskopu 2pFLIM

1. Zainstaluj moduł zliczania czasu fotonów (PTCM, Table of Materials) i podłącz do komputera (Rysunek 1) zgodnie z instrukcją producenta.
   nuta: PTCM jest zazwyczaj płytą komputerową, która otrzymuje wejście "synchronizacji" dla czasu impulsu laserowego i wejście fotonowe z lampy fotopowielacza (PMT). Odbiera również taktowanie zegara dla pikseli, linii i klatek z oprogramowania sterującego obrazowaniem dwufotonowym. PTCM wykorzystuje sygnały zegarowe do rozdzielania pojedynczych fotonów na różne piksele i ramki.
2. Dodaj fotodiodę o szerokości pasma >200 MHz, aby zmierzyć czas lasera. Umieść standardowe szklane szkiełko nakrywkowe na ścieżce światła, aby odbijać niewielką część światła laserowego do fotodiody umieszczonej prostopadle do ścieżki światła (Rysunek 1). Podłącz wyjście fotodiody do wejścia "sync" PTCM.
   nuta: Wiele nowoczesnych laserów również wysyła czas lasera. W przypadku tych laserów fotodioda nie jest konieczna, a wyjście laserowego pomiaru czasu można podłączyć bezpośrednio do wejścia synchronizacji PTCM.
3. Zamień PMT, w przypadku tAKARα, zielony kanał PMT, na niskoszumowy, szybki PMT GaAsP (Rysunek 1). Podłącz wyjście PMT do wejścia sygnału PTCM.
   1. Dodaj opcjonalny rozdzielacz sygnału (Rysunek 1), jeśli pożądana jest jednoczesna akwizycja intensywności przez konwencjonalny kanał obrazowania dwufotonowego. Podłącz wyjście PMT do rozdzielacza sygnału i podłącz wyjście rozgałęźnika do PTCM i konwencjonalnego modułu obrazowania dwufotonowego.
      nuta: PMT GaAsP dają szybsze sygnały jednofotonowe niż konwencjonalne PMT bialkaliczne i pozwalają na bardziej precyzyjne określenie czasu fotonów. Niektóre modele PMT GaAsP mogą być schładzane do temperatury 10−35 °C poniżej temperatury otoczenia, co pozwala na tłumienie ciemnych zliczeń do poziomu poniżej kilkuset zliczeń na sekundę (zwykle ≤200 zliczeń/s). Ten niski poziom szumów jest ważny dla precyzyjnego pomiaru czasu życia fluorescencji, ponieważ liczba fotonów szumu nie może być łatwo odróżniona ani odjęta od krzywej czasu życia fluorescencji.
4. Dodaj filtr emisji fluorescencji pasmowo-przepustowej, który minimalizuje zanieczyszczenie widmowe, jeśli występuje, od akceptora fluoroforu. Na przykład dla tAKARα filtr barierowy o długości fali 500 nm ± 20 nm dla kanału zielonego jest stosowany w celu zmniejszenia zanieczyszczenia z akceptora sREACh, który jest ciemnym (QY ~0,07) żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP)^29,30. Podłącz sygnały czasowe, takie jak zegary dla poszczególnych pikseli obrazu, linii i klatek, zgodnie z oprogramowaniem sterującym i opisanymi w instrukcji obsługi PTCM. Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do kontroli i akwizycji danych.
   nuta: Niektórzy producenci PTCM (Table of Materials) udostępniają swoje oprogramowanie do obrazowania 2pFLIM. W tym przypadku używane jest niestandardowe oprogramowanie o nazwie FLIMimage, które zostało opracowane przez Yasuda Lab (Max Planck Florida, za pośrednictwem komunikacji osobistej). To oprogramowanie funkcjonuje jako dodatkowa funkcja użytkownika do niektórych programów do akwizycji dwóch fotonów (Tabela materiałów). Steruje i komunikuje się z PTCM w odpowiednim czasie podczas obrazowania dwufotonowego w celu uzyskania obrazów 2pFLIM.

2. Budowa bieżni z napędem silnikowym

UWAGA: Projekt specjalnie zbudowanej bieżni z napędem jest pokazany w Rysunek 2.

1. Wytnij wałek piankowy (Ø = 200 mm) na długość 150 mm za pomocą drobnej piły do metalu. Alternatywnie sklej ze sobą dwie połówki piankowej kulki i umieść taśmę na szwie. Opcjonalnie przyklej gumową matę z profilem na wałku, aby zwiększyć przyczepność na wałku.
2. Wywierć otwór o średnicy 1/4 cala przez środek rolki po płaskiej stronie rolki lub wywierć otwór o średnicy 1/4 cala przez środek każdej połowy kulki, jeśli używana jest kulka piankowa.
3. Zamontuj stalową oś o średnicy 1/4 cala przez otwór. Przyklej wałek/kulkę piankową do osi za pomocą kleju kompatybilnego z pianką. Opcjonalnie można zmodyfikować dwa elastyczne sprzęgła wału (średnica wewnętrzna 1/4 cala), aby wzmocnić sprzężenie osi z rolką/kulką piankową.
   nuta: Należy pamiętać, że wiele popularnych klejów może rozpuszczać pianę.
   1. Dla każdego sprzęgła wału należy umieścić sprzęgło wału na płaskiej stronie i pośrodku prostokątnej metalowej płytki (0.7 mm x 15 mm x 76 mm). Przyspawaj płytę do sprzęgła wału. Wywierć otwór 1/4 cala na środku płyty, aby umożliwić montaż zmodyfikowanego sprzęgła wału na osi i dwa otwory na w metalowej płycie po bokach od środka.
   2. Zamontuj sprzęgło wału na osi względem wałka/kuli piankowej. Jeśli używasz tego ostatniego, lekko zegnij płytkę, aby dopasować ją do krzywizny kuli. Umieść w bocznych otworach, aby zamocować rolkę/kulkę na osi.
4. Wywierć i nagwintuj gwint 3/8-32 na środku płyty klatki i zainstaluj enkoder obrotowy. Wywierć otwór na w podstawie wspornika silnika pod kątem prostym, aby umożliwić zamocowanie silnika na uchwycie słupka. Przymocować zarówno enkoder obrotowy, jak i silnik do końca osi za pomocą elastycznego sprzęgła wału.
5. Zamontuj zmontowaną bieżnię na aluminiowej płytce stykowej za pomocą słupków do silnika i enkodera obrotowego (Rysunek 2). Podłącz wejścia silnika do regulatora prędkości, a wyjście enkodera obrotowego do wejścia analogowego płytki komputerowej akwizycji danych (DAQ).
   nuta: Prędkość kątowa obrotu jest kodowana przez enkoder obrotowy jako napięcie i jest digitalizowana za pomocą specjalnego oprogramowania o nazwie AnimalTracker napisanego w MATLAB.
6. Zamontuj uchwyt kompatybilny z płytą czołową do wspornika pod kątem prostym. Zamontuj solidny słupek na płycie chlebowej przed bieżnią i zainstaluj zmontowany uchwyt płyty czołowej ze wspornikiem kątowym na słupku (Rysunek 2). Upewnij się, że pręty uchwytu płyty czołowej są wyrównane z osią, tak aby mysz mogła przyjąć odpowiednią i wygodną pozycję chodzenia na bieżni (Rysunek 2C).

3. Ekspresja czujnika tAKARα w korze myszy

1. Elektroporacja in utero
   1. Przygotuj roztwór DNA dla IUE, dodając 0,2% końcowego stężenia szybkiego zielonego barwnika (do wizualizacji podczas wstrzyknięcia) do plazmidowego DNA (3−4 μg / μL; konstrukcje czujnika zawierające promotor CAG, sekwencję czujnika i wzmacniacz translacyjny elementu odpowiedzi potranskrypcyjnej wirusa zapalenia wątroby świstaka [WPRE] rozpuszczony/rozcieńczony w wodzie lub Tris-EDTA.
   2. Przygotuj ciężarną samicę myszy w ciąży (np. C57BL/6) do IUE w E16²⁴. Znieczulić mysz izofluranem (4% do indukcji i 1,5% do leczenia podtrzymującego, na 95% O2 z 5% CO₂) i zastosować podskórne wstrzyknięcie okołooperacyjne leków przeciwbólowych zawierających 5 mg/kg meloksykamu i 4 mg/kg bupiwakainy. Rozetnij jamę brzuszną skalpelem i nożyczkami i ostrożnie odsłoń rogi macicy.
   3. Wstrzyknąć 1 μl roztworu DNA na zarodek do bocznej komory jednej półkuli, jak opisano wcześniej²⁴.
   4. Wykonuj regularne IUE²⁴ dla neuronów korowych, umieszczając końcówkę elektrody dodatniej na korze mózgowej i używając pięciu impulsów kwadratowych 100 ms (38 V) przy 1 Hz za pomocą elektroporatora.
      UWAGA: Różne obszary kory mózgowej mogą być celem elektroporacji poprzez zmianę położenia stopy końcowej elektrody względem komory bocznej.
2. Wtrysk stereotaktyczny
   1. Przygotuj mysz w 30 dniu po urodzeniu do operacji stereotaktycznej²⁶. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 3.1.2 i zastosuj podskórne wstrzyknięcie okołooperacyjnych leków przeciwbólowych zawierających 5 mg/kg karprofenu.
   2. Rozcieńczyć serotyp AAV 2/1 (AAV2/1) wykazujący ekspresję hSyn-tAKARα-WPRE do empirycznie określonego miana (~1 x 10⁹−1 x 10¹⁰ genomów/μL) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przefiltrowaną strzykawką (0,2 μm membrana octanu celulozy).
   3. Wywierć otwór o średnicy ~500 μm za pomocą wiertarki ręcznej pod mikroskopem stereoskopowym w następujących współrzędnych kory ruchowej: 0,5 mm przed bregmą, 1,2 mm od linii bocznej do środkowej.
   4. Zamontuj wtryskiwacz (np. manipulator olejowo-hydrauliczny, z niestandardowym tłokiem/szklanym uchwytem na pipety) do manipulatora z napędem. Umieścić igłę do wstrzykiwań pod kątem 15° w stosunku do płaszczyzny bregma-lambda. Zaprogramuj ruch ukośny w osiach x i z- odpowiadający progresji 700 μm i 200 μm odpowiednio wzdłuż osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej.
      nuta: Aby uniknąć uszkodzenia tkanki bezpośrednio nad zamierzonym polem obrazowania, cząstki AAV są wstrzykiwane pod kątem względem płaszczyzny bregma-lambda.
   5. Umieść końcówkę igły iniekcyjnej na pia w środku wywierconego otworu i powoli wykonuj ruch ukośny (~25 μm/s) opisany powyżej. Ta procedura umieści środek wstrzyknięcia na 1,2 mm przed bregmą, 1,2 mm z boku do linii środkowej, 0,2 mm poniżej pia.
   6. Wstrzyknąć 20 nL rozcieńczonych cząstek wirusa (~10 nL/min). Odczekać co najmniej 10 minut i powoli wycofać igłę do wstrzykiwań (~12,5 μm/s).
   7. Zakończ procedurę iniekcji stereotaktycznej i przyklej/zszyj skórę²⁶.

4. Instalacja okna czaszkowego

1. Umieścić okno czaszkowe u myszy wykazujących ekspresję tAKARα za pośrednictwem IUE (sekcja 3.1) lub stereotaktycznego wstrzyknięcia cząstek wirusa (sekcja 3.2), między 30. a 60. dniem po urodzeniu. W przypadku myszy zakażonej cząsteczkami wirusa należy wdrożyć okno czaszkowe co najmniej dwa tygodnie po wstrzyknięciu wirusa. Zainstaluj okno czaszki zgodnie z wcześniejszym opisem^27,28, podając następujące szczegóły. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 3.1.2 i zastosuj podskórne wstrzyknięcie okołooperacyjnych leków przeciwbólowych 0,075 mg/kg Buprenex i środka przeciwzapalnego deksametazonu w dawce 4 mg/kg.
2. Usuń okostną i cofnij mięsień szyi. Przyklej krawędź skóry do czaszki za pomocą kleju tkankowego, aby uniknąć odsłonięcia mięśni szyi po operacji.
3. Osusz i usuń okostną z czaszki, delikatnie zeskrobując za pomocą skalpela. Umieść głowicę obrazowania (średnica wewnętrzna 8 mm) tak, aby otaczała zamierzone pole obrazowania. Przyklej nakrycie głowy do czaszki za pomocą kleju na bazie cyjanoakrylanu, a następnie dentystycznego cementu akrylowego. Aby uzyskać optymalną przyczepność, upewnij się, że płyta głowy spoczywa na odsłoniętej i wysuszonej czaszce. Akcelerator kleju może być użyty do przyspieszenia twardnienia.
4. Narysuj okrąg o średnicy 5 mm powyżej zamierzonego pola obrazowania (współrzędne określone w kroku 3.2.3) za pomocą wiertła dentystycznego i odsłoń oponę twardą.
5. Nałóż cienką warstwę przezroczystego polimeru, zwanego również sztuczną oponą twardą, na powierzchnię opony twardej, aby pokryć całe okno czaszki. Polimer ochroni i ustabilizuje oponę twardą. Umieść sterylne okrągłe szkiełko nakrywkowe (o średnicy 5 mm) na oponie twardej. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe klejem cyjanoakrylowym nałożonym wokół krawędzi okna, a następnie dentystycznym cementem akrylowym.

5. Mikroskopia obrazowania in vivo z użyciem fluorescencji dwufotonowej

1. Obrazowanie 2pFLIM należy rozpocząć po 2 tygodniach od zainstalowania okna czaszkowego (sekcja 4). Zminimalizuj zakłócenia eksperymentalne spowodowane stresem poprzez częste manipulowanie myszą i drapanie jej przed rozpoczęciem badania obrazowego w celu przyzwyczajenia myszy.
2. Ustaw długość fali lasera wzbudzenia dwufotonowego na 960 nm za pomocą oprogramowania sterującego laserem dwufotonowym.
3. Znieczulić mysz za pomocą 4% izofluranu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc ogon i obserwując częstość oddechów. Oznacza to, że nie powinno być żadnej reakcji na uszczypnięcie ogona, a częstość oddechów powinna zostać zmniejszona do ~1 oddechu na sekundę. Aby zminimalizować niepotrzebny czas zabiegu i ponieważ znieczulenie trwa tylko dwie do trzech minut, nie stosuje się smarków do oczu.
4. Przenieś znieczuloną mysz na zmotoryzowaną bieżnię (Rysunek 2C) i zamontuj głowicę myszy do uchwytu płyty czołowej zestawu bieżni (patrz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje). Oczyść powierzchnię szkiełka nakrywkowego z szybą czaszki myszy za pomocą 70% etanolu.
5. Umieść zmotoryzowaną bieżnię z zamontowaną myszą pod obiektywem 2pFLIM. Nałóż kroplę wody destylowanej między szkiełko nakrywkowe na szybę czaszki a obiektyw.
6. Pozwól zamontowanej myszy obudzić się ze znieczulenia i zaaklimatyzować się w środowisku bieżni i mikroskopu przez co najmniej 10 minut. Monitoruj częstość oddechów myszy, podczas gdy zamontowana mysz budzi się ze znieczulenia.
7. Udać się do miejsca wstrzyknięcia w świetle epi-oświetlenia. Udokumentuj cechy referencyjne (tj. naczynia krwionośne) w jasnym polu, aby pomóc w obrazowaniu tego samego obszaru zainteresowania (ROI) podczas kolejnych sesji obrazowania.
8. Wyeliminuj wszelkie przychodzące światło inne niż emitowane światło z tkanki mózgowej. Wyłącz źródło światła epi-illumination i zamknij obudowę zestawu 2pFLIM. Aktywuj 2pFLIM PMT, włączając sprzętowe sterowanie napięciem poleceń.
9. Uzyskaj obraz 2pFLIM ze stosu z użyciem oprogramowania do akwizycji 2pFLIM FLIMimage z następującymi zalecanymi ustawieniami do obrazowania tAKARα-dodatnich somatów u obudzonych myszy. Ustaw uśrednianie klatek na 3 klatki, prędkość skanowania na 2 ms/linię, rozmiar obrazu na 128 x 128 pikseli, a pole widzenia na 90−100 μm. Dostosuj ustawienia obrazowania w zależności od przygotowania i konfiguracji sprzętowej.
10. Sprawdź uzyskany obraz w FLIMview (własne oprogramowanie na zamówienie; patrz sekcja 6). Dostosuj ustawienia obrazowania zgodnie z krokiem 5.9, aby zoptymalizować liczbę fotonów i zminimalizować fotowybielanie.
    nuta: Wykonalna zintegrowana liczba fotonów w ROI dla obrazowania w czasie życia tAKARα-dodatniej somy in vivo wynosi ~1,000-10,000 fotonów w zależności od amplitudy sygnału, która wynika z określonego bodźca (patrz Dyskusja).
    1. W razie potrzeby należy użyć zmniejszonego pola widzenia, zmniejszonej prędkości skanowania, zwiększonej mocy lasera i zwiększonej liczby klatek do uśrednienia, aby zwiększyć liczbę zintegrowanych fotonów i zmniejszyć błąd szacowania żywotności. Jednocześnie upewnij się, że używasz minimalnej niezbędnej mocy lasera, uśredniania klatek i prędkości skanowania, aby zminimalizować fotowybielanie.
11. Obraz w regularnych odstępach czasu (np. co 30−60 s), powtarzając akwizycję stosu z ustawieniami określonymi w kroku 5.10. Pobieraj podstawowe obrazy 2pFLIM przez co najmniej 15 minut przy zerowej prędkości bieżni.
12. Ustaw prędkość obrotową bieżni na ~15 cm/s na 15 minut podczas pozyskiwania obrazów 2pFLIM. Kontynuuj obrazowanie przez ≥20 min po wyłączeniu rotacji bieżni, aby ocenić czas trwania aktywności PKA po ustaniu wymuszonej lokomocji.

6. Analiza obrazów 2pFLIM

1. Otwórz uzyskane obrazy w FLIMview i ustaw następujące parametry w FLIMview.
   UWAGA: Szczegóły parametrów są opisane w DYSKUSJI.
   1. Kliknij pola minimalnego i maksymalnego zakresu zliczania pojedynczych fotonów (SPC) w FLIMview. Wprowadź odpowiednią minimalną i maksymalną wartość zakresu SPC, zwykle w zakresie odpowiednio 1,2−2 i 10−12 ns.
   2. Kliknij pole wartości t₀ w FLIMview i wprowadź wartość t₀ (zwykle ~2 ns). Kliknij pole minimalnej wartości progowej luminancji w czasie życia w FLIMview i wprowadź żądaną wartość progową do 5−30 fotonów.
2. Kliknij przycisk nowej grupy (N) i przypisz nazwę grupy eksperymentalnej. Spowoduje to wygenerowanie grupy, która łączy dane z każdego dodanego obrazu FLIM.
3. Kliknij przycisk ROI w module Roi Controls w FLIMview i narysuj ROI wokół tAKARα-dodatniej somy. Zmniejsz zakres z-stack, przesuwając dolny i górny z-limit w suwakach z-stack Control w FLIMview, aby zminimalizować zanieczyszczenie sygnału pochodzącego z fotonów tła na innych głębokościach z.
4. Kliknij przycisk +, aby dodać obraz FLIM do grupy (krok 6.2). Kliknij przycisk Calc, aby obliczyć średni czas życia (LT, zwany również średnim czasem emisji fotonów [MPET]), dla zwrotu z inwestycji i błędu oszacowania czasu życia (δτ).
5. Otwórz następny plik z serii przewlekłych obrazowań 2pFLIM. Powtórz krok 6.4. Pamiętaj, aby dostosować położenie zakresu ROI i z-stack, aby zmierzyć tę samą tAKARα-dodatnią somę w czasie, ponieważ z czasem może dojść do dryfu tkanki.
6. Wybierz deltaMPET/MPET₀ z menu rozwijanego modułu Sterowanie grupowe. Kliknij pole baseline# i wprowadź indeks(y) (np. 1 2 3 4 5 dla pierwszych pięciu obrazów w grupie utworzonej w kroku 6.3). Spowoduje to zdefiniowanie obrazów używanych do obliczania okresu życia linii bazowej (LT₀).
7. Kliknij na Wykres, aby wygenerować wykres zawierający odpowiedź FLIM (ΔLT/LT₀) tAKARα podczas eksperymentu w zdefiniowanych ROI. Znormalizowane zmiany w czasie życia (ΔLT) poszczególnych ROI przez odpowiadający im czas trwania (LT₀) pozwalają na porównanie aktywności PKA podczas lokomocji w różnych ROI.

Czujniki FRET-FLIM pozwalają na wizualizację wielu różnych ścieżek sygnałowych, w tym szlaku cAMP/PKA zaangażowanego w neuromodulację. Obecny protokół wykorzystuje niedawno opracowany czujnik tAKARα w połączeniu z 2pFLIM do wizualizacji działań PKA u myszy zachowujących się jak głowa i skupione. Większość istniejących mikroskopów dwufotonowych można rozbudować o możliwości 2pFLIM poprzez dodanie trzech do czterech komponentów, jak pokazano na rysunku Rysunek 1 (patrz również sekcja 1). Aby zobrazować FRET na obrazach uzyskanych za pomocą 2pFLIM, przeprowadzono kwantyfikację średniego czasu życia na wykresach histogramu czasu trwania fotonów zebranych na piksel (Rysunek 3A,B). Średni czas życia został zwizualizowany za pomocą pseudokolorowego obrazu, w którym wysoki (zimny kolor) i niski (ciepły kolor) średni czas życia reprezentują odpowiednio niską i wysoką aktywność PKA, ponieważ aktywacja PKA prowadzi do skrócenia czasu życia. Należy zachować ostrożność, aby prawidłowo ustawić zakres SPC; zakres ten powinien być ustawiony w interwale impulsów laserowych (np. 12,5 ns z częstotliwością impulsów 80 MHz) ze zminimalizowanymi artefaktami krawędzi sprzętowej (patrz również rozdział 6 i DYSKUSJA). Obliczenie aktywności PKA w ramach ROI przeprowadzono poprzez połączenie LT wszystkich pikseli w ramach danego ROI (Rysunek 3C,D). U myszy obudzonych z głową podstawowe czasy życia wahały się od 1,3 do 1,8 ns (Ryc. 3E). Obrazowanie tAKARα w korze ruchowej u myszy obudzonych z głową pozwoliło na ilościowe określenie aktywności PKA w czasie rzeczywistym z rozdzielczością komórkową podczas podstawowej i wymuszonej lokomocji (Ryc. 4). Eksperyment można powtarzać przez dni i miesiące. Wymuszona lokomocja wyzwala aktywność PKA w populacji neuronów w powierzchownych warstwach kory ruchowej myszy17. Ta aktywność PKA jest zależna od neuromodulacji poprzez aktywację receptorów β-adrenergicznych i D117.

Rysunek 1: Schemat systemu 2pFLIM. 2pFLIM można zaimplementować w konwencjonalnym mikroskopie dwufotonowym poprzez dodanie podświetlonych na żółto elementów sprzętowych: modułu zliczania czasu fotonów, niskoszumowej lampy szybkiego fotopowielacza (PMT), fotodiody (potrzebnej tylko wtedy, gdy laser nie ma sygnalizacji wyjściowej do pomiaru czasu laserowego) oraz opcjonalnego rozdzielacza sygnału. Ten rysunek został zmodyfikowany z Ma et al.17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Projekt specjalnie zbudowanej bieżni z napędem silnikowym. (A) Schemat projektu bieżni z przodu (u góry po lewej), z boku (u góry po prawej) i z góry (na dole po lewej). Oś bieżni (kulka piankowa) jest połączona z enkoderem obrotowym i silnikiem, które są wspólnie zamontowane na dwóch słupkach na solidnej aluminiowej płycie chlebowej. Uchwyt kompatybilny z głowicą czołową na wsporniku kątowym jest przymocowany do solidnego słupka i umieszczony nad bieżnią. Rysunki schematyczne nie są skalowane. Widok z przodu (B) i z boku (C) na zdjęcia bieżni. Prawidłowe ustawienie myszy na bieżni jest pokazane w panelu C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja danych 2pFLIM. (A) Obraz FLIM, w którym każdy piksel jest pseudokolorowy, aby reprezentować średni czas życia (LT), w stosunku do czasu lasera, wszystkich fotonów w tym pikselu. (B) Czasy nadejścia fotonów w obrębie pojedynczego piksela (fioletowy kwadrat w panelu A) zostały wykreślone na histogramie (lewy panel). Granice całkowania wyznaczono w celu wyznaczenia zakresu zliczania pojedynczych fotonów (SPC, kolor szary). W zakresie SPC całka czasu fotonów została podzielona przez całkowitą liczbę fotonów, a następnie odjęta przez t0 (1,65 ns, linia przerywana), co dało średni czas życia (LT, odległość między liniami przerywanymi i przerywanymi) wynoszący 1,74 ns. Kwantyfikacja średniego czasu życia całego pola widzenia (jasnoniebieski kwadrat w panelu A) polegała na zintegrowaniu czasu trwania fotonów zebranych we wszystkich pikselach (prawy panel), w wyniku czego średni czas życia wynosił 1,7 ns. Wstawki pokazują te same dane w skali półlogarytmicznej. (C oraz D) Kwantyfikacja średniego czasu życia dla każdego regionu zainteresowania (ROI). (C) Reprezentatywny przykład obrazu 2pFLIM. Wokół dwóch somatów w warstwie 2/3 kory ruchowej narysowano dwa ROI. (D) Rozkłady taktowania fotonów zintegrowane we wszystkich pikselach w każdym ROI (lewy panel). Zwrot z inwestycji w komórkę oznaczono kolorem (jak pokazano w panelu C) na czerwono, komórka 1; niebieski, komórka 2. Znormalizowane zliczanie fotonów pozwala na porównanie rozkładów czasowych fotonów między dwoma ROI (prawy panel, średni czas życia; komórka 1, 1,33 ns; komórka 2, 1,73 ns). Wstawki pokazują te same dane w skali półlogarytmicznej. (E) Wykres rozkładu średnich podstawowych czasów życia z 254 zobrazowanych komórek w powierzchownych warstwach kory ruchowej. Komórki L1 (n = 186 komórek/11 zwierząt, lewy panel), znajdujące się w promieniu 100 μm poniżej pia, wyrażały tAKARα po stereotaktycznym wstrzyknięciu AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE, oraz komórki piramidalne L2/3 (n = 68 komórek/4 zwierzęta, prawy panel), znajdujące się co najmniej 150 μm poniżej pia, wyrażały tAKARα po IUE konstruktu DNA CAG-tAKARα-WPRE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: tAKARα śledzi wymuszone czynności PKA wywołane lokomocją, w korze ruchowej. (A) Reprezentatywne obrazy intensywności (lewy panel) i czasu życia (środkowy i prawy panel) trzech komórek L1 w korze ruchowej. Zwrot z inwestycji w komórkę oznaczono kolorami: pomarańczowy, komórka 1; niebieski, komórka 2; żółty, komórka 3. (B) Rozkłady czasowe fotonów mierzone w komórce 1 (górny panel) w stanie podstawowym (pomarańczowy ślad, mierzony w środkowym panelu Α) i wymuszonej lokomocji (loco., jasnopomarańczowy ślad, mierzony w prawym panelu A). Znormalizowana liczba fotonów pozwoliła na bezpośrednie porównanie rozkładu czasowego fotonów (dolny panel, średni czas życia: podstawowy, 1,72 ns; lokomocja, 1,42 ns). Wstawki pokazują te same dane w skali półlogarytmicznej. (C) Δczas życia/czas życia0 (ΔLT/LT0) ślady odpowiednich komórek (górny panel, patrz panel A) z wymuszoną prędkością lokomocji (dolny panel). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.