Artykuł metodologiczny

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

DOI:

10.3791/59528

⸱

6 maja 2019

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te protokoły zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki korowej, integralności strukturalnej szwów soczewki danio pręgowanego w soczewkach stałych i żywych oraz do pomiaru położenia jądra soczewki danio pręgowanego wzdłuż osi przednio-tylnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest wyjątkowo przystosowany do manipulacji genetycznych i obrazowania in vivo, co czyni go coraz bardziej popularnym modelem do odwrotnych badań genetycznych i do generowania transgeników do obrazowania in vivo. Te unikalne możliwości sprawiają, że danio pręgowany jest idealną platformą do badania rozwoju i fizjologii soczewek ocznych. Nasze ostatnie odkrycia, że akwaporyna-0, Aqp0a, jest wymagana do stabilności szwu przedniej soczewki, a także do przesunięcia jądra soczewki do środka soczewki wraz z wiekiem, skłoniły nas do opracowania narzędzi specjalnie nadających się do analizy właściwości soczewek danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy szczegółowe metody preparacji soczewek, które można zastosować zarówno do soczewek larwalnych, jak i dorosłych, aby przygotować je do analizy histologicznej, immunohistochemii i obrazowania. Koncentrujemy się na analizie integralności szwów soczewki i morfologii komórek korowych oraz porównujemy dane wygenerowane z wypreparowanych soczewek z danymi uzyskanymi z obrazowania in vivo morfologii soczewki, które było możliwe dzięki nowej transgenicznej linii danio pręgowanego z genetycznie kodowanym markerem fluorescencyjnym. Analiza wypreparowanych soczewek prostopadłych do ich osi optycznej pozwala na ilościowe określenie względnego położenia jądra soczewki wzdłuż osi przednio-tylnej. Ruch jądra soczewki od początkowej pozycji przedniej do środka jest wymagany dla normalnej optyki soczewki u dorosłego danio pręgowanego. Tak więc ilościowa miara położenia jądra soczewki bezpośrednio koreluje z jej właściwościami optycznymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badania rozwoju soczewki i fizjologii ze względu na anatomiczne podobieństwa do soczewek ssaków, względną łatwość manipulacji genetycznej i farmakologicznej, szybkość rozwoju embrionalnego oka, mały rozmiar i przezroczystość we wczesnych stadiach pozwalających na obrazowanie in vivo. Opisane tutaj metody zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki danio pręgowanego w stadium embrionalnym i dorosłym, ze szczególnym uwzględnieniem integralności szwów, morfologii błony korowej in vitro i in vivo oraz lokalizacji położenia jądra soczewki wzdłuż osi przednio-tylnej ex vivo. Metody te służą jako punkt wyjścia do badań funkcjonalnych nad rozwojem i fizjologią soczewki, a także do odwróconych badań genetycznych fenotypów soczewek u danio pręgowanego.

Obrazowanie morfologii soczewki danio pręgowanego

Akwaporyna 0 (AQP0) jest najobficiej występującym białkiem błony soczewki i ma kluczowe znaczenie zarówno dla rozwoju soczewki, jak i jej przejrzystości, ze względu na wiele podstawowych funkcji u ssaków. Danio pręgowany ma dwa Aqp0 (Aqp0a i Aqp0b), a my opracowaliśmy metody analizy utraty ich funkcji zarówno w soczewkach embrionalnych, jak i dorosłych. Nasze badania pokazują, że mutanty aqp0a-/- rozwijają zmętnienie bieguna przedniego z powodu niestabilności szwu przedniego, a podwójne mutanty aqp0a/b rozwijają nieprzezroczystość jądrową1. Wykazano, że AQP0 odgrywa rolę w transporcie wody2, adhesion3,4, cytoszkielet anchoring5 i generowanie gradientu indeksu załamania światła6, ale badania te zostały w dużej mierze przeprowadzone in vitro. Danio pręgowany daje wyjątkową okazję do zbadania, w jaki sposób utrata funkcji lub zaburzona funkcja Aqp0a lub Aqp0b wpłynęłaby na morfologię i funkcję żywej soczewki. Aby ocenić morfologię komórek soczewki i integralność szwów podczas rozwoju, zmodyfikowaliśmy istniejące metody immunohistochemiczne in vitro7 do stosowania w soczewkach embrionalnych i dorosłych, a także wygenerowaliśmy transgeniczne w celu monitorowania tego procesu in vivo.

Analiza immunohistochemiczna struktury błony plazmatycznej i integralności szwów została przeprowadzona w całych zarodkach i soczewkach dorosłych. Soczewki danio pręgowanego są niezwykle małe (średnica soczewki wynosi ~100 μm u zarodków i do 1 mm u dorosłych) w porównaniu z ich odpowiednikami ssaków i mają szwy punktowe8, które są rzadko wychwytywane w kriosekcjach. W związku z tym całe soczewki są niezbędne do analizy integralności szwów. Do analizy in vivo tworzenia szwów przednich i obrazowania precyzyjnej architektury komórek soczewki, wygenerowaliśmy transgeniczne ekspresje mApple specyficznie znakujące błony soczewek.

Zalety obrazowania na żywo transgenicznych błon soczewek obejmują: 1) unikanie artefaktów fiksacji, 2) badanie dynamicznych zmian morfologicznych w filmach poklatkowych, oraz 3) umożliwienie badań podłużnych, w których wcześniejsze zdarzenia mogą być skorelowane z późniejszymi fenotypami. Pigmentacja tęczówki zwykle uniemożliwia wyraźne obrazowanie obrzeży soczewki. Dodatek 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU) przed etapem primordia-5 (prim-5) 9 zapobiega melanogenezie i pigmentacji oczu do około 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Jednak po 4 dpf obrzeża soczewki są zasłonięte in vivo, szczególnie w starszych stadiach. Co więcej, gęstość samej soczewki zasłania obrazowanie jej tylnego bieguna. Dlatego, aby zbadać morfologię obwodu soczewki lub szwu tylnego, po 4 dpf soczewki należy wyciąć i utrwalić.

Transgeniczne linie danio pręgowanego zostały wykorzystane do analizy struktury błony soczewki embrionalnej in vivo10. Transgeniczny Q01 ulega ekspresji cyjanowego białka fluorescencyjnego połączonego z sekwencją ukierunkowaną na błonę, Gap43, napędzaną przez promotor EF1α i heksamer elementu wzmacniającego DF4 pax6 wszechobecny w komórkach światłowodowych soczewki11. Q01 ma ekspresję pozasoczewkową, w tym komórki amakrynowe w siatkówce, które dodają sygnał tła, jeśli głównym zainteresowaniem jest soczewka. Opracowaliśmy nowatorską linię transgeniczną, która wyraża mApple na uwięzi błonowej w soczewce, w celu uniknięcia jakiegokolwiek sygnału pozasoczewkowego.

Lokalizacja jądra soczewki

Odkryliśmy, że jądro soczewki przesuwa się z początkowej przedniej lokalizacji u larw danio pręgowanego do centralnego miejsca na osi przednio-tylnej u dorosłych soczewek. Uważa się, że to przesunięcie położenia jądra soczewki o wysokim współczynniku załamania światła jest wymogiem normalnego rozwoju optyki soczewki danio pręgowanego1. Nasze metody pozwalają na ilościowe określenie centralizacji jądrowej soczewki w stosunku do promienia soczewki. Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że Aqp0a jest wymagane do centralizacji jądra soczewki1, a ta prosta metoda może być zastosowana do innych badań nad rozwojem i fizjologią soczewki oraz jej właściwościami optycznymi w modelu danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu są zgodne z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.

1. Hodowla danio pręgowanego i eutanazja

  1. Hoduj i utrzymuj danio pręgowanego (szczep AB) w standardowych warunkach laboratoryjnych12. Hoduj zarodki na pożywce dla zarodków (EM)12. Dodać 0,003% PTU do EM po 20-24 godzinach od zapłodnienia (przed fazą prim-5), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu w zarodkach12 używany do obrazowania w stadiach embrionalnych9. Wychowuj larwy od 6-30 dni po zapłodnieniu (dpf) na diecie żywych wrotków do 14 dpf, a żywa artemia po 14 dpf12.
    ostrożność: PTU jest bardzo toksyczny
  2. Znieczulaj ryby za pomocą tricainy, aż przestaną reagować na dotyk.
    1. Przygotować bulion z tricainą, łącząc 400 mg estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego z 2,1 ml 1 M Tris (pH 9) w 100 ml ddH2O. Dostosować do pH 7,0 i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      ostrożność: Trikaina jest toksyczna.
    2. Rozcieńczyć 4,2 ml bulionu trikainy w 100 ml wody w zbiorniku w celu znieczulenia larw/dorosłych osobników lub w EM w celu znieczulenia zarodków (końcowe stężenie trikainy przy 0,0165% w/v).

2. Utrwalanie zarodków i larw

UWAGA: Protokoły immunohistochemiczne zostały zaadaptowane z wcześniej opublikowanych materiałów7.

  1. Utrwalić zdekorionowane zarodki lub larwy do 2 tygodni po zapłodnieniu w 4% (v/v) paraformaldehydzie (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez noc w temperaturze 4 °C na bujaku.
    ostrożność: PFA jest palny i rakotwórczy.
  2. Umyć zarodki trzy razy przez 10 minut w PBS i przepuścić w PBS 10% Triton i 1% DMSO (PBS-T) przez noc w temperaturze 4 °C.
    ostrożność: DMSO jest toksyczny, jest szkodliwy po spożyciu lub wchłanianiu przez skórę, przenosi niebezpieczne materiały przez skórę i jest palny. Tryton jest toksyczny, i niebezpieczny dla środowiska wodnego.

3. Sekcja soczewek larw i dorosłych ryb danio pręgowanego

  1. Znieczulaj ryby od 6 dpf larw do dorosłości tricainą, aż przestaną reagować na dotyk, ale nadal będą wykazywać silne bicie serca. Zmierz standardową długość ryby zgodnie z Schillingiem (2002) dla inscenizacji13.
  2. Natychmiast wyciąć oczy za pomocą nożyczek do mikropreparacji i umieścić w naczyniu separacyjnym w PBS (Rysunek 2 pokazany dla oczu dorosłych).
    1. Zrób niestandardową miskę 35 mm wypełnioną silikonem do sekcji soczewek. Po związaniu silikonu należy wyciąć wgłębienie o średnicy około 2-3 mm i głębokości 0,5 mm w celu unieruchomienia oczu/soczewek dorosłych podczas sekcji.
  3. Sekcja soczewek dorosłego danio pręgowanego
    1. Umieść dorosłe oko w naczyniu divot tylną stroną do góry wypełnioną PBS. Unieruchomij oko, wprowadzając kleszcze pod kątem <45° przez tarczę nerwu wzrokowego. Uważaj, aby nie naciąć ani nie ścisnąć obiektywu. Wykonaj dwa lub trzy promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę od tarczy nerwu wzrokowego do strefy rzęskowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.
    2. Oderwij siatkówkę i twardówkę jak płatki kwiatów i odwróć oko, rogówką do góry. Unieruchomić soczewkę pośrednio poprzez manipulację twardówką i rogówką płaską stroną nożyczek, jednocześnie odciągając siatkówkę i przyczepione tkanki za pomocą kleszczy. Ostrożnie odetnij nadmiar tkanki z soczewki.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby dokładnie przeanalizować, aby uzyskać niezmiennie zdrowe soczewki.
  4. Sekcja soczewek larwalnych danio pręgowanego
    1. Umieść oko larwy tylną stroną do góry na płaskiej części silikonowego naczynia wypełnionego PBS i użyj zaostrzonej igły wolframowej, aby wykonać promieniste nacięcia przez siatkówkę i twardówkę, jednocześnie unieruchamiając oko inną igłą wolframową lub kleszczami.
      nuta: Uważaj, aby nie uszkodzić obiektywu.
      1. Naostrz elektrolitycznie końcówkę drutu wolframowego o długości 2,1 mm o długości 2 cm, zawieszając końcówkę drutu w 10% (w/v) NaOH i przykładając prąd przemienny o niskim napięciu14. Umieść igłę w pipecie Pasteura, topiąc szklany koniec za pomocą palnika Bunsena.
        nuta: Można również użyć alternatywnych narzędzi do drobnego rozwarstwiania.
        ostrożność: NaOH jest.
    2. Delikatnie wyjmij soczewkę z oka zdysocjowanego stroną igły i ostrożnie odciągnij przyczepioną chusteczkę.

4. Fiksacja wypreparowanych soczewek

  1. Natychmiast zamocuj wypreparowane soczewki w 1,5% (v/v) PFA w PBS przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Umyj soczewki trzy razy w PBS przez 10 minut każde.
  2. Soczewki przepuszczalne do analizy całego mocowania lub cryoprotect do kriosekcji (patrz punkt 8).
    1. Soczewki przepuszczalne w PBS-T przez noc w temperaturze 4 °C.

5. Immunohistochemia soczewek

  1. Oznaczyć błony utrwalonych soczewek zarodka/larwy lub dorosłego osobnika przez inkubację w Phalloidynie-Alexa Fluor 546 (1:200) i jądrach komórkowych za pomocą DAPI (1:1,000 z 5 mg/ml zapasu) w PBS-T przez noc w temperaturze 4 °C.
    ostrożność: DAPI działa drażniąco na skórę i oczy.
  2. Umyj trzy razy PBS-T przez 10 minut każdy. Oczyścić tkankę przez inkubację w 30%, 50% i 70% glicerolu w PBS-T (v/v) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Zamontuj ryby w 70% glicerolu w PBS-T (v/v) na szklanych szalkach mikrostudzienkowych o średnicy 35 mm, z oczami jak najbardziej płasko i prosto przylegającymi do szkiełka nakrywkowego. W przypadku młodszych ryb lekkie przechylenie przednio-boczne może pomóc w ustawieniu szwu soczewki tak, aby był równoległy do szkiełka nakrywkowego.

6. Analiza szwów przedniej soczewki danio pręgowanego za pomocą linii transgenicznej in vivo

  1. Wygeneruj linie Tg(βB1cry:mAppleCAAX) za pomocą Tol2 kit15. System elementów transpozycyjnych Tol215 umożliwia stabilną integrację konstrukcji, w której mApple jest napędzany przez 300 bp ludzkiego promotora βB1-krystaliny 16 przywiązanego do błony przez sekwencję CAAX, co skutkuje ekspresją specyficznie w błonach komórkowych włókien soczewkowych.
    nuta: Ten konstrukt (ID:122451) jest dostępny do zakupu.
    1. Rano w dniu wstrzyknięcia należy przygotować mieszaninę do wstrzykiwań i przechowywać ją na lodzie. Aby osiągnąć końcową objętość 10 μL zawierającegoH2Owolnego od RNaz i DNaz, należy dodać: 1,5 μL konstruktu DNA huβB1cry:mAppleCAAX DNA przy 50 ng/μL - [0,375-0,75 pg/ostatnie wstrzyknięcie], 1,5 μL mRNA transpozazy Tol2 przy 300 ng/μL (zestaw Tol2)15 [15-30 pg/ostatnie wstrzyknięcie], i 1 μl wskaźnika czerwieni fenolowej przy 1% w/v [1 x10-5% (w/v)/ostatnie wstrzyknięcie].
    2. Wstrzyknąć 50-100 pL mieszaniny do wstrzykiwań do zarodków w stadium 1-komórkowym12.
  2. Zmierz skuteczność transgenezy w zarodkach, którym wstrzyknięto F0, mierząc częstość zarodków z soczewkami mApple dodatnimi przy 3 dpf.
    nuta: Spodziewaj się, że przy użyciu tej metody uzyskasz >80% skuteczności transgenezy. Mozaiki F0 pozwalają na szczegółową analizę morfologii błon poszczególnych komórek. Różne poziomy mozaikowości pozwalają na obrazowanie morfologii pojedynczych lub małych grup komórek, podczas gdy bardziej globalna ekspresja soczewek umożliwia analizę struktur wielokomórkowych, takich jak szwy do soczewek in vivo.
  3. Krzyżuj ryby mozaikowe F0, aby wygenerować stabilne linie, które oznaczają wszystkie błony komórkowe włókien. Założyciele F0 z transgenem zintegrowanym z linią zarodkową będą generować potomstwo ze stabilnymi integracjami, które mogą być utrzymywane jako linie transgeniczne.

7. Analiza szwów przedniej soczewki danio pręgowanego za pomocą linii transgenicznej in vivo

  1. Znieczulić 3 dpf lub dorosłą mozaikę lub stabilną transgeniczną rybę i zamontować w 1% niskotopliwej agarozie (LMA) z trikainą z okiem płasko przylegającym do szkiełka nakrywkowego naczyń mikrostudzienkowych ze szklanym dnem.
    1. Rozpuścić 1 g LMA w 100 ml EM (bez błękitu metylenowego) w celu uzyskania 1% LMA. Przechowywać długoterminowo w postaci 15 ml bulionu w temperaturze 4 °C. Kuchenka mikrofalowa do rozpuszczenia bulionu i przechowywać w temperaturze 42 °C, aż do użycia każdej probówki.
  2. Przykryj ryby do 6 dpf EM z tricainą lub wodą ze zbiornika z tricainą dla dorosłych, gdy LMA jest ustawione.
    1. Zmieszać 5 ml EM bez błękitu metylenowego lub wody w zbiorniku z 250 μl bulionu trikainowego i 7 μl PTU w przypadku obrazowania ryb poddanych działaniu PTU.

8. Kriosekcja soczewek i immunohistochemia

  1. Cryoprotect utrwalone zarodki lub dorosłe soczewki, umieszczając je w 10% sacharozy w PBS (w/v), 20% sacharozy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C) i na noc w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C.
  2. Osadź tkankę w OCT w formach bazowych, a następnie zamroź na uchwytach za pomocą kriosekcji OCT. w temperaturze 12-14 μm i zbierz na szkiełka mikroskopowe Superfrost/Plus. Podgrzewaj sekcje na szkiełku przez 10 min na szkiełku podgrzewacz podgrzanym do ~35 °C.
  3. Przemyć sekcje trzykrotnie PBS przez 10 minut każda. Oznacz sekcje mąką Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) z DAPI (1:1,000) lub mąką WGA-Alexa 594 (1:200), a następnie trzykrotnie praj PBS. Zamontuj za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.

9. Obrazowanie

  1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Uzyskaj stosy z lub plastry optyczne za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie 60x N/A 1.2 lub podobnego w określonych obszarach od przedniego do tylnego bieguna soczewki. Użyj następujących ustawień akwizycji: 1,2 przewiewny dysk przy użyciu lasera 561 nm, czerwony filtr Texas dla phalloidyny-Alexa Flour 546 lub mApple lub laser 405 z filtrem UV dla DAPI.
  2. Dostosuj moc lasera o intensywności z, aby przeciwdziałać utracie sygnału wraz z głębokością w soczewce. Pozwala to na uzyskanie silnego sygnału na tylnym biegunie stałych i żywych zarodków 3 dpf oraz silnego sygnału w równikowych warstwach optycznych w soczewkach dorosłych ryb.
  3. Kompiluj i przeglądaj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

10. Pomiar lokalizacji jądra soczewki w osi przednio-tylnej

  1. Świeżo wycięte soczewki ustawić osiowo w PBS w czaszy 35 mm z dnem ze szkła nakrywkowego, z biegunami i szwami ustawionymi równolegle do płaszczyzny ostrości. Poszukaj różnicy we współczynniku załamania światła, który zwykle występuje na styku kory soczewki i jądra soczewki, aby zidentyfikować jądro soczewki.
    nuta: Zdrowe soczewki dorosłe typu dzikiego są niezwykle przezroczyste, co utrudnia dostrzeżenie szwów i jądra soczewki lub określenie orientacji soczewki. W tym przypadku lekkie nacięcie kleszczami do torebki soczewki powoduje niewielkie uszkodzenie, co sprawia, że szwy i jądro soczewki są widoczne w ciągu około 10 minut, pomagając zorientować soczewkę do tego pomiaru. Jednak soczewki stają się bezużyteczne do dalszych zastosowań, ponieważ są teraz uszkodzone.
  2. Rób zdjęcia soczewek z jądrem soczewki w ostrości w jasnym oświetleniu pola z optyką DIC lub bez niej, używając mikroskopu preparacyjnego z dołączoną kamerą. Wyobraź sobie mikrometr pod tym samym powiększeniem w celu kalibracji.
    1. Kliknij przycisk podglądu na żywo, dostosuj ustawienia ekspozycji, aby zobrazować jądro obiektywu i jego obrzeża, a następnie zrób zdjęcie, klikając przycisk robienia zdjęć. Zapisz jako plik tif.
    2. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby skalibrować uzyskane obrazy obiektywu. Wybierz narzędzie Linia prosta i narysuj linię o znanej długości na obrazie mikrometrycznym, kliknij przycisk Analizuj | Ustaw skalę. Wprowadź znaną odległość, jednostki i wybierz kalibrację "globalną", a następnie kliknij OK.
  3. Zmierz odległość środka jądra soczewki od bieguna przedniego (a - r).
    1. Użyj narzędzia linii prostej w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, aby narysować linię w poprzek obrazowanego środka jądra soczewki w orientacji osiowej. Przyjmij środek tej linii jako środek jądra soczewki.
    2. Narysuj kolejną linię od tego punktu do przedniego bieguna soczewki i wybierz "zmierz" w menu "analizuj", aby zmierzyć odległość (a - r), gdzie a to promień soczewki, a r to odległość od środka soczewki do środka jądra.
    3. Narysuj kolejną linię od przednich do tylnych biegunów i zmierz tę odległość jako średnicę soczewki (2a). Skopiuj te długości z okna "wyniki" i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego lub programu statystycznego.
      nuta: Łatwiej jest precyzyjnie zmierzyć od środka jądra do bieguna przedniego, niż mierząc od środka jądra soczewki do środka soczewki. Pomiar ten jest przeliczany za pomocą wzoru w kroku 10.3.5 w celu podania odległości od środka jądra soczewki do środka soczewki. Do pomiarów należy zawsze używać dorosłego jądra, nawet jeśli jądro embrionalne jest widoczne.
    4. Podziel średnicę przez 2, aby obliczyć promień soczewki, a.
    5. Oblicz r/a, jako figure-protocol-1, co jest znormalizowaną lokalizacją jądra soczewki w stosunku do promienia soczewki.
      UWAGA: Dla jądra umieszczonego bliżej bieguna przedniego, r/a będzie >0,0, podczas gdy jądro zlokalizowane centralnie będzie miało r/a 0,0.
  4. Wykres logarytmu znormalizowanego pomiaru jądra osiowego w funkcji standardowej długości, aby określić zmiany w lokalizacji jądra soczewki podczas rozwoju danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomia oka dorosłego danio pręgowanego bardzo przypomina anatomię ssaków (Rysunek 1A). Pomimo pewnych różnic między oczami danio pręgowanego i ssaków, takich jak strefa rzęskowa zamiast ciała rzęskowego17, różnice we właściwościach optycznych18, oraz różnice w morfogenezie podczas rozwoju embrionalnego19, oko danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badania rozwoju oka i zrozumienia choroby o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza morfologii soczewki danio pręgowanego jest pierwszym krokiem w zrozumieniu fenotypów mutantów, czyli efektów interwencji farmakologicznych mających na celu badanie biologii soczewki gałki ocznej. Przedstawiamy metody analizy szwów soczewkowych, morfologii komórek włókien korowych i aspektów jądra soczewki. Podejścia te stanowią połączenie metod in vitro i in vivo (porównanych w tabeli 1). Metody in vitro pozwalają na dokładniejsze poznanie morfologii komórek zewnętrznej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych ujawnień.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować naszemu źródłu finansowania: NIH R01 EY05661 J.E.H, Ines Gehring za pomoc w tworzeniu podwójnych mutantów aqp0a/b i hodowli danio pręgowanego, Dr Danielowi Dranowowi za dyskusje prowadzące do powstania transgeników, Dr Bruce'owi Blumbergowi i laboratoriom dr Kena Cho za użycie ich mikroskopów preparacyjnych, oraz dr Megan Smith za pomoc w analizie statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)SigmaP7629UWAGA – bardzo toksyczny
4% wodny roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa SciencesRT 157-4UWAGA – zagrożenie dla zdrowia, palny
Mikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050STemperatura obiektywu i komory ustawiona na -21 i Stopniach; C
DAPIInvitrogenD1306UWAGA – działa drażniąco na oczy i skórę
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificD128UWAGA – palny, przenika przez skórę 
Jednorazowa forma bazowaVWR Scientific15154-631
Jednorazowe szklane pipety PasteuraFisherbrand13-678-20A
Kleszcze Dumont #5Dumont & FilsUtrzymuj kleszcze zaostrzone
Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikaina)Sigma-AldrichA5040UWAGA - toksyczna
Szklana miska mikrostudzienkowa (szalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe #1,5)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlicerolSigmaG2025
huβ B1cry:mAppleCAAX DNA constructAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Agaroza niskotopliwa (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
Oprogramowanie NIS-Elements ARNikon
Olympus  z kontrolerem modelu 2.1.1.183Olympus CorpMikroskop DP70
Olympus Olympus CorpSZX12
Mąka Phalloidin-Alexa 546Thermo FisherA22283
Wskaźnik czerwieni fenolowej (1% w/v)Ricca Chemical Company5725-16
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Oprogramowanie PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WDobiektyw Nikon
Źródło zasilaniaWild HeerbruggMTr 22Lub równoważne źródło zasilania 
Podgrzewacz do slajdów nr 26020FSFisher Scientific12-594
Koraliki wodorotlenku soduFisher ScientificS612-3UWAGA - działa żrąco/drażniąco na oczy i skórę, narząd docelowy - układ oddechowy, działa żrąco na metale
Szkiełko mikroskopowe Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 silikon Dow CorningWorld Prevision Instruments
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284UWAGA – Toksyczne, niebezpieczne dla środowiska wodnego,
Nożyczki do mikropreparacji VannasTed Pella Inc1346Ostre/ostre proste końcówki
Vectashield antiblading mouting mediumLaboratoria wektoroweH-1000
Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA)-Alexa Mąka-594Life TechnologiesW11262
SYLG184

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68(2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szycie soczewkisekcja soczewkianaliza histologicznaimmunohistochemiaobrazowanie in vivomarker fluorescencyjnyo optycznarednica soczewki

Powiązane artykuły