Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59535

⸱

3 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

W tym artykule

Podsumowanie

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Streszczenie

W ostatnich latach pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wszystkie organizmy i środowisko są narażone na działanie hormonopodobnych substancji chemicznych, znanych jako substancje zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC). Te chemikalia mogą zmieniać normalną równowagę układów hormonalnych i prowadzić do niekorzystnych skutków, a także do rosnącej liczby zaburzeń hormonalnych w populacji ludzkiej lub zaburzonego wzrostu i zmniejszonej reprodukcji gatunków dzikich zwierząt. W przypadku niektórych EDC istnieją udokumentowane skutki zdrowotne i ograniczenia dotyczące ich stosowania. Jednak w przypadku większości z nich nadal nie ma dowodów naukowych w tym sensie. Aby zweryfikować potencjalne skutki endokrynologiczne substancji chemicznej w całym organizmie, musimy przetestować ją w odpowiednich systemach modelowych, a także u muszki owocowej Drosophila melanogaster. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły in vivo do badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność/płodność, czas rozwoju i długość życia muchy. W ciągu ostatnich kilku lat wykorzystaliśmy te cechy życiowe Drosophila do zbadania skutków ekspozycji na 17-α-etynyloestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) i bisfenol AF (BPA F). W sumie testy te objęły wszystkie etapy życia Drosophila i umożliwiły ocenę zaburzeń endokrynologicznych we wszystkich procesach za pośrednictwem hormonów. Testy płodności/płodności i czasu rozwoju były przydatne do pomiaru wpływu EDC odpowiednio na wydajność reprodukcyjną muszki i na etapy rozwojowe. Wreszcie, test długości życia obejmował przewlekłe narażenie na EDC u dorosłych i mierzył ich przeżywalność. Jednak na te cechy życiowe może mieć również wpływ kilka czynników eksperymentalnych, które musiały być dokładnie kontrolowane. Dlatego w tej pracy sugerujemy szereg procedur, które zoptymalizowaliśmy pod kątem prawidłowego wyniku tych testów. Metody te pozwalają naukowcom ustalić zaburzenia endokrynologiczne dla dowolnego EDC lub dla mieszaniny różnych EDC u Drosophila, chociaż aby zidentyfikować mechanizm endokrynologiczny odpowiedzialny za ten efekt, potrzebne mogą być dalsze eseje.

Wprowadzenie

Działalność człowieka uwalnia do środowiska ogromne ilości substancji chemicznych, które stanowią poważny problem dla organizmów i naturalnych ekosystemów1. Szacuje się, że spośród tych zanieczyszczeń około 1000 różnych substancji chemicznych może zmienić normalną równowagę układów hormonalnych; zgodnie z tą właściwością są klasyfikowane jako substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC). W szczególności, w oparciu o niedawną definicję Towarzystwa Endokrynologicznego, EDC są "egzogenną substancją chemiczną lub mieszaniną substancji chemicznych, która może zakłócać dowolny aspekt działania hormonów"2. W ciągu ostatnich trzech dekad pojawiło się coraz więcej dowodów naukowych na to, że EDC mogą wpływać na reprodukcję i rozwój zwierząt i roślin3,4,5,6,7,8. Co więcej, narażenie na EDC jest związane z rosnącym występowaniem niektórych chorób u ludzi, w tym raka, otyłości, cukrzycy, chorób tarczycy i zaburzeń zachowania9,10,11.

Ogólne mechanizmy EDC

Ze względu na swoje właściwości molekularne, EDC zachowują się jak hormony lub prekursory hormonów3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. W tym sensie mogą wiązać się z receptorem hormonu i zakłócać układy hormonalne, naśladując aktywność hormonów lub blokując wiązanie hormonów endogennych. W pierwszym przypadku, po związaniu się z receptorem, mogą go aktywować tak, jak zrobiłby to jego naturalny hormon. W drugim przypadku wiązanie EDC z receptorem zapobiega wiązaniu się jego naturalnego hormonu, więc receptor jest zablokowany i nie może być już aktywowany, nawet w obecności jego naturalnego hormonu3. W konsekwencji EDC mogą wpływać na kilka procesów, takich jak synteza, wydzielanie, transport, metabolizm lub obwodowe działanie endogennych hormonów, które są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy, reprodukcję, rozwój i/lub zachowanie organizmu. Wiązanie z receptorem nie jest jedynym opisanym do tej pory sposobem działania EDC. Teraz jest jasne, że mogą one również działać poprzez rekrutację koaktywatorów lub korepresorów w szlakach enzymatycznych lub poprzez modyfikację markerów epigenetycznych deregulujących ekspresję genów10,11,12,13,14, z konsekwencjami nie tylko dla obecnego pokolenia, ale także dla zdrowia przyszłych pokoleń8.

Hormony Drosophila

Potencjalne efekty wybranych EDC były szeroko badane, zarówno u dzikich gatunków, jak i w kilku systemach modelowych, w których mechanizmy endokrynologiczne są dość dobrze znane. W przypadku bezkręgowców układy hormonalne, które wpływają na wzrost, rozwój i rozmnażanie, zostały szeroko scharakteryzowane u owadów z kilku powodów, w tym ich szerokiego zastosowania w dziedzinie badań biologicznych, ich znaczenia ekonomicznego, a wreszcie rozwoju insektycydów, które mogą specyficznie ingerować w układ hormonalny szkodników.

Szczególnie wśród owadów, muszka owocowa D. melanogaster okazała się bardzo potężnym systemem modelowym do oceny potencjalnych skutków endokrynologicznych EDC. U D. melanogaster, podobnie jak u kręgowców, hormony odgrywają ważną rolę w całym cyklu życiowym. W tym organizmie istnieją trzy główne układy hormonalne, które obejmują hormon steroidowy 20-hydroksyekdyzon (20E)15,16, seskwiterpenoidowy hormon juchwenilowy (JH)17 oraz neuropeptydy i hormony peptydowe/białkowe18. Ta trzecia grupa składa się z kilku peptydów odkrytych niedawno, ale wyraźnie zaangażowanych w ogromną różnorodność procesów fizjologicznych i behawioralnych, takich jak długowieczność, homeostaza, metabolizm, reprodukcja, pamięć i kontrola lokomotoryczna. 20E jest homologiczny do hormonów steroidowych pochodzących z cholesterolu, takich jak estradiol, podczas gdy JH ma pewne podobieństwa z kwasem retinowym; oba są bardziej znanymi hormonami w Drosophila19,20. Ich równowaga jest niezbędna w koordynowaniu linienia i metamorfozy, a także w kontrolowaniu kilku procesów porozwojowych, takich jak reprodukcja, długość życia i zachowanie21, oferując w ten sposób różne możliwości testowania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila. Co więcej, hormony ekdysteroidowe i JH są głównymi celami tak zwanych insektycydów trzeciej generacji, opracowanych w celu zakłócania rozwojowych i reprodukcyjnych procesów endokrynologicznych u owadów. Agonistyczny lub antagonistyczny sposób działania tych substancji chemicznych jest dobrze znany, a zatem mogą one służyć jako wzorce referencyjne do oceny wpływu potencjalnych EDC na wzrost, rozmnażanie i rozwój owadów22. Na przykład metopren, który jest szeroko stosowany w zwalczaniu komarów i innych owadów wodnych23,24, działa jako agonista JH i hamuje indukowaną przez 20E transkrypcję i metamorfozę genu.

Oprócz hormonów, nadrodzina receptorów jądrowych (NR) u Drosophila jest również dobrze znana; składa się z 18 ewolucyjnie zachowanych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w kontrolowanie zależnych od hormonów ścieżek rozwojowych, a także reprodukcji i fizjologii25. Te hormony NR należą do wszystkich sześciu podtypów nadrodziny NR, w tym tych zaangażowanych w neurotransmisję26, dwa dla NR kwasu retinowego i te dla steroidowych NR, które u kręgowców stanowią jeden z głównych celów EDCs27.

Drosophila jako modelowy system do badania EDC

Obecnie, na podstawie właściwości molekularnych, kilka agencji środowiskowych na całym świecie przypisuje potencjał ingerencji w układy hormonalne różnym substancjom chemicznym wytworzonym przez człowieka. Biorąc pod uwagę, że EDC są globalnym i wszechobecnym problemem dla środowiska i organizmów, ogólnym celem badań w tej dziedzinie jest zmniejszenie obciążenia nimi chorobowymi, a także ochrona organizmów żywych przed ich niekorzystnym skutkiem. Aby pogłębić wiedzę na temat potencjalnych skutków endokrynologicznych substancji chemicznej, konieczne jest jej przetestowanie in vivo. W tym celu D. melanogaster reprezentuje prawidłowy system modelowy. Do tej pory muszka owocowa była szeroko stosowana jako model in vivo do oceny skutków kilku środowiskowych EDC; doniesiono, że narażenie na kilka EDC, takich jak ftalan dibutylu (DBP)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylofenol (4-NP), 4-tert-oktylofenol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31,32, ftalan bis-(2-etyloheksylu) (DEHP)33 i 17-α-etynyloestradiol (EE2)34, wpływa na metabolizm i funkcje hormonalne, jak w modelach kręgowców. Do wykorzystania go jako modelu w tej dziedzinie badań skłoniło kilka powodów. Poza doskonałą znajomością układów hormonalnych, dalsze zalety to krótki cykl życia, niski koszt, łatwy do manipulowania genom, długa historia badań i kilka możliwości technicznych (zobacz stronę internetową FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster dostarcza również potężnego modelu do łatwego badania efektów międzypokoleniowych i reakcji populacji na czynniki środowiskowe8 i unika kwestii etycznych istotnych dla badań in vivo na zwierzętach wyższych. Ponadto muszka owocowa ma wysoki stopień zachowania genów z ludźmi, co może umożliwić testom Drosophila EDC pomoc w przewidywaniu lub sugerowaniu potencjalnych skutków tych chemikaliów dla zdrowia ludzkiego. Oprócz poszerzania wiedzy na temat wpływu na zdrowie ludzkie, Drosophila może pomóc w ocenie ryzyka narażenia środowiska na EDC, takiego jak utrata różnorodności biologicznej i degradacja środowiska. Wreszcie, muszka owocowa ma tę dodatkową zaletę, że jest wykorzystywana w laboratoriach, gdzie czynniki potencjalnie wpływające na jej rozwój, rozmnażanie i długość życia mogą być kontrolowane w celu przypisania wszelkich zmian badanej substancji.

Mając to na uwadze, zoptymalizowaliśmy proste i solidne testy sprawnościowe do określenia wpływu EDC na niektóre cechy hormonalne Drosophila, takie jak płodność/płodność, czas rozwoju i długość dorosłego życia. Testy te są szeroko stosowane w niektórych EDC23,24,25,26,27. W szczególności zastosowaliśmy następujące protokoły do oceny skutków ekspozycji na syntetyczny estrogen EE234 oraz na BPA i bisfenol AF (BPA F) (dane niepublikowane). Protokoły te mogą być łatwo modyfikowane w celu zbadania skutków danego EDC na raz, a także łącznych efektów wielu EDC u D. melanogaster.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie posiłków

  1. Do utrzymania stada i wzrostu larw należy użyć pożywki z mąki kukurydzianej zawierającej 3 % drożdży w proszku, 10 % sacharozy, 9 % wstępnie ugotowanej mąki kukurydzianej, 0,4 % agaru, zwanej dalej pożywką z mąki kukurydzianej (CM).
    1. Wsyp 30 g drożdży do 100 ml wody z kranu, doprowadź do wrzenia i gotuj przez 15 minut.
    2. Oddzielnie dobrze wymieszaj 90 g wstępnie ugotowanej mąki kukurydzianej, 100 g cukru i 4 g agaru z 900 ml wody z kranu.
    3. Doprowadź roztwór do wrzenia, zmniejsz ogień i gotuj przez 5 minut, ciągle mieszając.
    4. Po 5 minutach dodaj gorący roztwór drożdży i gotuj na wolnym ogniu przez kolejne 15 minut.
    5. Wyłączyć źródło ciepła i pozostawić roztwór do ostygnięcia do około 60 °C.
    6. Dodać 5 ml/l 10% 4-hydroksybenzoesanu metylu do etanolu, dokładnie wymieszać i odstawić na 10 minut.
      nuta: Należy uważać na ilość 4-hydroksybenzoesanu metylu, ponieważ wysokie stężenie fungicydu może być śmiertelne dla larw.
    7. Dozować pożywkę do fiolek/butelek: 8 ml do każdej fiolki na muchy (25 mm x 95 mm), 3 ml do każdej fiolki na muchy (22 mm x 63 mm) i 60 ml do każdej butelki na muchy (250 ml).
    8. Przykryj fiolki gazą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 godziny przed przechowywaniem.
    9. Skalibruj eksperymentalnie odpowiednią konsystencję i uwodnienie CM, modyfikując ilość użytego agaru i/lub czas chłodzenia/suszenia.
      Uwaga: odłączone, zapakowane i opakowane fiolki są stabilne przez około 15 dni w temperaturze 4 °C.
  2. W przypadku dorosłych osobników Drosophila należy użyć pożywki zawierającej 10% drożdży w proszku, 10% sacharozy, 2% agaru, zwanej dalej pożywką dla dorosłych (AM).
    1. Wymieszaj 10 g drożdży w proszku, 10 g sacharozy, 2 g agaru ze 100 ml wody destylowanej.
    2. Doprowadź tę mieszaninę do wrzenia dwa razy, w odstępie 3 minut, lub do momentu rozpuszczenia agaru, za pomocą kuchenki mikrofalowej.
    3. Gdy roztwór ostygnie do 60 °C, dodać 5 ml/l 10% 4-hydroksybenzoesanu metylu do etanolu, dokładnie wymieszać i rozlać do fiolek (10 ml na fiolkę).
    4. Przykryj fiolki gazą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed przechowywaniem.
      UWAGA: odłączone, zapakowane i opakowane fiolki są stabilne przez około 15 dni w temperaturze 4 °C.
  3. Do oznaczania płodności/płodności użyj pożywki z soku pomidorowego i mąki kukurydzianej Drosophila.
    1. Wlej 70 ml ciepłego pokarmu z mąki kukurydzianej do zlewki o pojemności 100 ml i dodaj 30 ml soku pomidorowego (30% v/v).
    2. Dokładnie wymieszać za pomocą robota kuchennego i odpipetować 3 ml do małych fiolek.
    3. Przykryj fiolki gazą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed przechowywaniem.
      UWAGA: odłączone, zapakowane i opakowane fiolki są stabilne przez około 15 dni w temperaturze 4 °C.
  4. Do pobierania zarodków należy używać płytek agarowych zawierających 3% agaru, 30% sosu pomidorowego i 3% cukru.
    UWAGA: należy uważać, aby nie tworzyć bąbelków podczas nalewania pożywki do talerzy.

2. Dawkowanie Drosophila EDC

  1. Przygotować odpowiedni roztwór podstawowy, rozpuszczając wybrane EDC w odpowiednim rozpuszczalniku. Dla EE2 (masa cząsteczkowa 296,403) rozpuścić 1,48 g w 10 ml 100% etanolu, aby uzyskać 0,5 M roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    ostrożność: EDC są uważane za zanieczyszczenia środowiska i należy zachować środki ostrożności podczas obchodzenia się z nimi.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy EE2 w 10% etanolu w wodzie (v/v) w celu uzyskania roztworu o stężeniu 100 mM. Następne rozcieńczenia (0,1 mM, 0,5 mM i 1 mM) w żywności CM, zaczynając od najniższego stężenia i stosując to samo końcowe stężenie rozpuszczalnika dla każdej grupy poddanej działaniu substancji. Do fiolek kontrolnych należy użyć tej samej objętości samego rozpuszczalnika.
    Uwaga: zaleca się, aby końcowe stężenie rozpuszczalnika było jak najniższe, pamiętając, że końcowe stężenie etanolu w pokarmie dla much nie powinno przekraczać 2%.
  3. Dodać roztwór zawierający odpowiednie rozcieńczenie wybranego EDC do żywności na bazie mąki kukurydzianej przed zestaleniem, dokładnie wymieszać robotem kuchennym, rozlać 10 ml do fiolek, przykryć gazą bawełnianą i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 16 godzin przed użyciem.
    UWAGA: należy stosować to podłoże natychmiast po jego przygotowaniu.
  4. Dla odchowu osobników dorosłych należy przygotować różne robocze roztwory EE2 (odpowiednio 10 mM, 50 mM i 100 mM) w 10% etanolu w wodzie (v/v) i nałożyć 100 μl każdego z nich na powierzchnię AM, w celu uzyskania pożądanego stężenia EE2 (0,1 mM, 0,5 mM i 1 mM). Do kontroli należy użyć tej samej objętości samego rozpuszczalnika.
    UWAGA: alternatywnie, dodać roztwór zawierający odpowiednie rozcieńczenie wybranego EDC do niewielkiej ilości AM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, dokładnie odwirować i rozwarstwić 1 ml na powierzchni fiolek AM.
    1. Przykryj fiolki bawełnianą gazą, pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 12-16 godzin pod delikatnym mieszaniem i natychmiast zużyj.
      UWAGA: proces suszenia powinien być dostosowany eksperymentalnie, ponieważ zależy od wilgotności otoczenia.
  5. Do testu żywieniowego dodać do CM zarówno roztwór zawierający odpowiednie rozcieńczenie wybranego EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM i 1 mM), jak i barwnik spożywczy (np. czerwony barwnik nr 40 o stężeniu 1 mg/ml)35 do CM, mocno wymieszać z robotem kuchennym, a następnie przelać do fiolek.

3. Hodowla much

  1. Użyj wytrzymałego szczepu izogenicznego, takiego jak Oregon R, utrzymywanego przez kilka generacji w laboratorium.
  2. Muchy należy trzymać w wilgotnym inkubatorze o kontrolowanej temperaturze, z naturalnym fotoperiodem 12 godzin światła: 12 godzin ciemnego światła w temperaturze 25 °C w fiolkach zawierających pokarm CM.
  3. W każdym teście należy używać fiolek o temperaturze pokojowej.

4. Test żywieniowy

UWAGA: Ten test jest zalecany do sprawdzenia, czy obecność wybranego EDC w pożywce może wpłynąć na karmienie much.

  1. Umieść 15 młodych much w fiolkach zawierających CM uzupełnionych różnymi stężeniami wybranego EDC i pokarmem barwiącym. Pozwól muchom żerować na pożywce przez 1 dzień.
    UWAGA: na przykład użyj czerwonego barwnika nr 4035 (1 mg / ml).
  2. Umieścić 15 młodych much w fiolkach zawierających CM uzupełnionych samym rozpuszczalnikiem i barwiącym pokarmem do kontroli. Pozwól muchom żywić się pożywką przez 1 dzień.
  3. Znieczulenie każdej grupy much należy przeprowadzić indywidualnie za pomocą eteru.
    1. Przenieś muchy z każdej grupy do cylindrycznego szklanego pojemnika (eteryzatora) z lejkiem włożonym do otwartego końca, odwracając fiolkę nad lejkiem i delikatnie stukając dwoma pojemnikami o siebie, aby muchy wpadły do eterizera.
      UWAGA: Lejek uniemożliwi im wydostanie się z eteryzatora.
    2. Powal muchy, delikatnie stukając eteryzatorem w miękką powierzchnię, taką jak podkładka pod mysz, i szybko zastąp lejek nasączoną eterem zatyczką z bawełny i gazy.
    3. Odczekaj około 1 minuty, aż muchy opadną na dno i przestaną się poruszać.
      UWAGA: nie przekraczaj tego czasu, bo muchy umrą.
  4. Umieść unieruchomione muchy pod mikroskopem stereoskopowym i porównaj zabarwienie jamy brzusznej każdej grupy leczonej w odniesieniu do grupy kontrolnej.

5. Test płodności/płodności

  1. Dla każdego stężenia EDC przygotować 3 fiolki z muchami, zwane dalej fiolkami rodzicielskimi, z 8 samicami i 4 samcami w 10 ml CM/EDC pokarmu; do kontroli przygotować 6 fiolek much z 8 samicami i 4 samcami w 10 ml CM pokarmu uzupełnionego rozpuszczalnikiem. Tylne muchy w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: unikaj przeludnienia larw podczas ich rozwoju i staraj się stosować stałe zagęszczenie larw we wszystkich zabiegach.
  2. Po 4 dniach należy usunąć rodziców i umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze na kolejne 5 dni.
  3. Późnym popołudniem dnia 9 należy usunąć wszystkie młode muchy z fiolek i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 18 °C na noc.
    nuta: To usuwanie należy wykonać bardzo ostrożnie, dobrze sprawdzając powierzchnię podłoża.
    1. Rankiem 10 dnia, dla każdej grupy leczonej, zebrać dziewicze samice i młode samce w dwie grupy, w lekkim znieczuleniuCO2. Losowo podzielić każdą grupę much na małe podgrupy (10 samic i 20 samców na fiolkę) w niezależnych fiolkach wypełnionych świeżymi odpowiednimi CM.
      1. Powtórzyć krok 5.3.1, zwracając uwagę zarówno na ostrożne usunięcie wszystkich much z fiolek na 8-10 godzin przed pobraniem, jak i pozostawienie fiolek w temperaturze 18 °C, aż do uzyskania co najmniej 30 dziewiczych samic i 30 samców dla każdego stężenia EDC oraz co najmniej 90 dziewiczych samic i 90 samców dla kontroli.
    2. Przechowywać te grupy much w temperaturze 25 °C do momentu, gdy osiągną wiek dojrzały 4 dni po ekluzji, przenosząc je co dwa dni do nowych fiolek zawierających świeżą odpowiednią pożywkę.
      Uwaga: 4 dni to wystarczający czas, aby muchy osiągnęły dojrzałe osobniki dorosłe, ale jest to bardzo daleko od początku starzenia.
    3. Po dwóch dniach upewnij się, że w fiolkach samic nie ma larw. Jeśli tak się stanie, muchy nie nadają się do użytku, ponieważ nie są dziewicami i należy je wyrzucić.
  4. Użyć 20 pojedynczych much każdej płci dla każdej grupy badanej, aby ustawić 20 pojedynczych krzyżówek do małych fiolek zawierających świeżą pożywkę pomidorową CM bez EDC, jak opisano poniżej.
    1. Każdej grupie poddanej działaniu należy przypisać inną serię kolejnych numerów, które jednoznacznie ją identyfikują i oznaczają odpowiednie fiolki, np. grupa 1 (sam rozpuszczalnik) od 1 do 20, grupa 2 (stężenie EDC x) od 20 do 40 i tak dalej.
    2. Sporządź arkusz kalkulacyjny dotyczący płodności, aby zapisać różne serie, z których każda odpowiada grupie leczonej.
    3. Dla każdej płci znieczulić wszystkie muchy należące do każdej grupy leczonej pod wpływem światła CO2 i losowo przenieść je w następujący sposób.
      1. Przenieść jedną samicę poddaną działaniu rozpuszczalnika do małej fiolki zawierającej świeżą pożywkę pomidorową CM bez EDC i dodać jednego samca poddanego działaniu rozpuszczalnika do krzyżówki kontrolnej.
        Uwaga: sok pomidorowy należy dodawać do podłoża podczas jego przygotowywania, ponieważ ciemne podłoże zwiększa kontrast z białymi zarodkami.
      2. Przenieść jedną samicę poddaną działaniu EDC do małej fiolki zawierającej świeżego pomidora CM bez EDC i dodać jednego samca poddanego działaniu rozpuszczalnika do każdego zabiegu.
      3. Przenieść jednego samca poddanego działaniu EDC do małej fiolki zawierającej świeżą pożywkę pomidorową CM bez EDC i dodać jedną samicę poddaną działaniu rozpuszczalnika do każdego zabiegu.
    4. Umieść wszystkie te pojedyncze krzyże w temperaturze 25°C.
  5. Każdą parę kryjącą należy przenosić do świeżych fiolek z pomidorami CM bez EDC codziennie przez kolejne dziesięć dni. Oznaczyć kolejno zreplikowane fiolki z każdej serii; np. 1-a, 1b, 1c......20a, 20b, 20c i podaj te liczby w arkuszu kalkulacyjnym płodności.
  6. Codziennie sprawdzaj wzrokowo każdą fiolkę pod kątem komórek jajowych i podaj ich liczbę w arkuszu kalkulacyjnym płodności.
  7. Zachowaj każdą fiolkę, a gdy zaczną pojawiać się nowe muchy, zapisz również dzienną liczbę dorosłych potomków w okresie 10 dni. Po 10 dniach od pierwszego krycia usuń rodziców.
    UWAGA: wyrzucić fiolkę, w której zmarło jedno lub oboje rodzice; W przypadku ucieczki jednego lub obojga rodziców, należy uwzględnić w analizie wszystkie dane do dnia, w którym zaginęły.
  8. Zsumować dzienną liczbę jaj i dzienną liczbę dorosłych potomstwa z każdej grupy poddanej działaniu substancji, aby uzyskać całkowitą płodność/płodność, średnią produkcję jaj i dorosłego potomstwa przez muchę w ciągu dziesięciu dni oraz stosunek całkowitego potomstwa do całkowitej liczby złożonych jaj. Obliczyć różnice procentowe w każdej wartości poddawania działaniu substancji w odniesieniu do kontroli.
  9. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty dla każdej grupy much, używając co najmniej 10 much na każdą grupę badaną.
  10. Wykonaj analizę statystyczną, aby porównać różne grupy.

6. Czas rozwoju

UWAGA: W dwóch następujących alternatywnych protokołach czas rozwoju jest oceniany poprzez zliczanie zarówno liczby poczwarek, które tworzą się w ciągu dnia, jak i liczby dorosłych potomstwa zamykających się w ciągu dnia.

  1. Protokół testu eklozyjnego 1
    1. Dla każdej grupy leczonej należy ustawić 10 fiolek z młodymi (<2 dni), zdrowymi muchami, każda z 6 samicami i 3 samcami w 10 ml pokarmu z mąki kukurydzianej bez EDC.
    2. Pozwól muchom na pokarmie przez 24 godziny i pozwól im się kojarzyć.
    3. Przygotować 10 równoległych fiolek na grupę badaną po 10 ml świeżego pokarmu z mąki kukurydzianej uzupełnionego różnymi stężeniami EDC lub samym rozpuszczalnikiem do kontroli. Przenieść sparowane muchy do tych nowych fiolek.
      UWAGA: każdej grupie poddawanej działaniu należy przypisać inną serię kolejnych numerów, które jednoznacznie ją identyfikują i oznaczyć odpowiednie fiolki.
    4. Zrób rozwojowy arkusz kalkulacyjny, aby nagrać różne serie.
    5. Pozwól muchom złożyć jaja przez 16 godzin. Następnie wyjąć rodzice z fiolek.
      nuta: Muszki rodzicielskie mogą być użyte do powtórzenia kroku 6.1.5, przenosząc je do innych odpowiednich fiolek.
    6. Inkubować fiolki przez 3-4 dni w temperaturze 25 °C lub do momentu, gdy przestaną tworzyć się poczwarki. Każdego dnia policz liczbę nowo pobranych poczwarek w każdej fiolce i zgłoś to w rozwojowym arkuszu kalkulacyjnym. Aby uniknąć dwukrotnego liczenia tej samej poczwarki, należy napisać kolejno liczbę przy każdej poczwarce za pomocą trwałego markera na zewnątrz fiolki.
    7. Począwszy od 9 dnia, licz codziennie liczbę pojawiających się dorosłych, aż do momentu, gdy nie pojawi się więcej dorosłych, i zgłaszaj to w rozwojowym arkuszu kalkulacyjnym.
    8. Na podstawie tych surowych danych należy obliczyć średni okres larwalny, średni okres poczwarki, a także różnice w procentowej zawartości każdego produktu w odniesieniu do kontroli.
    9. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty dla każdej grupy much, używając co najmniej 5 fiolek dla każdej grupy poddawanej działaniu substancji.
    10. Wykonaj analizę statystyczną, aby porównać różne grupy.
  2. Protokół testu eklozji 2
    1. Młode i zdrowe samice (około 150) i samce (około 50) much chowają się na klatce zbiorczej (tabela materiałów) z podłożem agarowo-pomidorowym uzupełnionym świeżą pastą z drożdży piekarskich (3 g drożdży piekarskich w 5 ml wody), zwanym następnie tacą do składania niosek, przez 2 dni w temperaturze 25 °C.
    2. W ciągu tych 2 dni pozwól muchom zaaklimatyzować się w klatce w ciemnym, cichym miejscu, przed rozpoczęciem zbierania jaj i zmieniaj tacę do składania jaj dwa razy dziennie.
    3. Trzeciego dnia zmień tacę do układania wcześnie rano. Po 1 godzinie wymień tacę nioską, odrzucając złożone jaja.
    4. Pozwól muchom złożyć jaja przez 2 godziny i zastąp świeżą tacą do składania jaj.
      nuta: Do 3 dnia dobra taca nioska powinna wyprodukować 100-200 jaj w ciągu 2 godzin.
    5. Dla każdej grupy poddanej działaniu substancji należy przygotować serię trzech szalek o średnicy 60 mm zawierających pokarm z mąki kukurydzianej z pomidorów uzupełniony odpowiednim stężeniem EDC lub samym rozpuszczalnikiem i podać każdą serię w arkuszu kalkulacyjnym czasu rozwoju. Alternatywnie, jeśli wolisz, użyj fiolek zamiast naczyń.
    6. Delikatnie podnieś jajka pod mikroskopem za pomocą pędzla lub sondy i przenieś je na wierzch pożywki w każdym naczyniu/fiolce. Aby ułatwić liczenie, na tacy niosek ułóż jajka w 5 grupach po 10 sztuk każda i przenoś je pojedynczo.
      nuta: Powtórzyć krok 6.2.4 tyle razy, ile jest konieczne do uzyskania wystarczającej liczby zarodków.
    7. Wszystkie te szalki/fiolki należy przechowywać w temperaturze 25 °C. Przechowywać również każdą tacę do składania jaj w temperaturze 25 °C i policzyć całkowitą liczbę złożonych jaj.
    8. Po 24-30 godzinach sprawdź każdą szalkę/fiolkę pod mikroskopem stereoskopowym i policz zarówno liczbę białych, niezapłodnionych jaj, jak i liczbę ciemnych, martwych zarodków.
    9. Odejmij liczbę białych, niezapłodnionych komórek jajowych od wartości 50 przeniesionych komórek jajowych, aby uzyskać wartość "całkowitej liczby zarodków" na miskę/fiolkę. Liczba ciemnych, martwych zarodków może być wykorzystana do określenia potencjalnych skutków toksycznych EDC podczas embriogenezy.
    10. Powtórzyć kroki 6.1.6-6.1.10 protokołu 1 testu eklozji.

7. Protokół długości życia

  1. Ustawić 20 fiolek much z 8 samicami i 4 samcami i trzymać w temperaturze 25 °C w CM (10 ml każda).
  2. Po 4 dniach wyrzuć muchy i umieść fiolki z powrotem w inkubatorze.
    UWAGA: te muchy mogą być użyte do ponownego rozpoczęcia w celu uzyskania innych kohort much zsynchronizowanych pod względem wieku.
  3. Późnym popołudniem dnia 9 należy wyjąć wszystkie młode muchy z fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze.
    Uwaga: kilka osób dorosłych powinno zacząć się zamykać już dziewiątego dnia; Odrzucenie tych much pozwala na zebranie maksymalnej liczby zsynchronizowanych much, unikając nieostrożnej selekcji wcześnie wschodzących.
  4. 16-24 godziny później przenieś dorosłe muchy (1 dzień) obu płci do czterech grup butelek o pojemności 250 ml zawierających pokarm AM uzupełniony trzema różnymi stężeniami EDC i jednym z samym rozpuszczalnikiem. W razie potrzeby zbierz kolejną partię następnego dnia.
  5. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C przez 2-3 dni, aby umożliwić im kopulację.
    UWAGA: dzień przeniesienia do fiolek z żywnością AM odpowiada pierwszemu dniu dorosłości.
  6. Po dwóch-trzech dniach posortuj każdą kohortę much według płci na dwie grupy w lekkim znieczuleniu CO2. Losowo podzielić każdą płeć na pięć fiolek na dawkę w gęstości 20 osobników na fiolkę, aż na każdą dawkę przypadną trzy powtórzone po 5 równoległych fiolek dla każdej płci.
    nuta: Pracuj z małymi grupami much, aby zapobiec ewentualnym długotrwałym problemom zdrowotnym spowodowanym długim czasem ekspozycji na CO2 .
  7. Przygotuj arkusz kalkulacyjny długości życia, w którym liczba martwych much jest odejmowana od liczby much, które przeżyły do poprzedniego transferu, w taki sposób, aby automatycznie uzyskać liczbę ocalałych przy każdym transferze.
  8. Przenieść muchy do nowych fiolek zawierających odpowiedni pokarm co 3 dni o tej samej porze i sprawdzić, czy nie padły.
    UWAGA: transfer musi odbyć się bez znieczulenia, które może mieć długotrwały negatywny wpływ na długowieczność much.
    1. Przy każdym transferze zapisuj wiek much i liczbę martwych much.
      UWAGA: liczba much, które przeżyły, jest automatycznie obliczana w arkuszu kalkulacyjnym, ale zaleca się sprawdzenie jej wizualnie. Muchy, które przypadkowo uciekają lub umierają podczas przenoszenia, nie powinny być brane pod uwagę. Uważaj, aby nie liczyć dwa razy martwych much przeniesionych do nowej fiolki, zgłaszając tę notatkę w arkuszu kalkulacyjnym.
    2. Powtarzaj kroki 7.8 i 7.8.1, aż wszystkie muchy umrą.
  9. Dla każdej grupy leczonej należy utworzyć krzywą przeżycia, jak pokazano na rysunku Rysunek 6, aby wyświetlić prawdopodobieństwo przeżycia muchy w dowolnym momencie.
  10. Wykonaj trzy niezależne eksperymenty dla każdej grupy badanych much, używając 100 nowo zamkniętych much do każdego eksperymentu.
  11. Przygotuj tabelę, w której podasz średnią długość życia (średnią liczbę dni przeżycia wszystkich much dla każdej grupy), czas połowicznego zgonu (okres w dniach wymagany do osiągnięcia 50% śmiertelności) i maksymalną długość życia (maksymalna liczba dni potrzebna do osiągnięcia 90% śmiertelności).
  12. Obliczyć różnice procentowe między każdą grupą badaną w stosunku do grupy kontrolnej.
  13. Wykonaj analizę statystyczną w celu porównania różnych grup leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji kluczowe kroki powyższych protokołów przedstawiono w formie uproszczonych schematów. Ze względu na to, że muchówki mają tendencję do unikania związków o nieprzyjemnym smaku, w pierwszej kolejności należy zbadać smak wybranego EDC. Można to zrobić, mieszając barwnik spożywczy (na przykład czerwony barwnik spożywczy nr 40)35 z pożywką uzupełnionej o wybrany EDC w różnych dawkach lub z samym rozpuszczalnikiem. Muchówki karmione na tych podłożach bada się pod stereomikroskopem, a pobór po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Muszka owocowa D. melanogaster została szeroko wykorzystana jako system modelowy in vivo do zbadania potencjalnego wpływu środowiskowych EDC, takich jak DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31,32, DEHP33 i EE234. Kilka powodów skłoniło go do wykorzystania go jako modelu w tej dziedzinie badań. Oprócz niekwestionowanych zalet jako syst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Orsolinie Petillo za wsparcie techniczne. Autorzy dziękują dr Mariarosarii Alettie (CNR) za wsparcie bibliograficzne. Autorzy dziękują dr. Gustavo Damiano Mita za wprowadzenie ich w świat EDC. Autorzy dziękują Leica Microsystems i Pasquale Romano za ich pomoc. Badania te były wspierane przez Projekt PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 KAMPANIA; Projekt PO FESR Kampania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
17&alfa;-etynyloestradiolSigmaE4876-1G
Agar do Drosophila pożywkaBIOSIGMA789148
Bisfenol ASigma239658-50G
Bisfenol AFSigma90477-100MG
Mąka kukurydzianaCA' BIANCA
Eter dietylowySigma
Fiolki DrosophilaBIOSIGMA78900825 mm x 95 mm
Fiolki DrosophilaBIOSIGMA78900929 mm x 95 mm
Fiolki DrosophilaKaltek18722 mm x 63 mm
Klatka do pobierania zarodkówRzemiosłoCylinder z pleksiglasu (12,5 mm x 7 cm) z otwartym końcem i drugim końcem zamkniętym prostokątną podstawą, w której znajduje się szczelina umożliwiająca włożenie specjalne tace do układania
etanoluFLUKA2860
EtherizerCraftscylindryczny szklany pojemnik z bawełnianą zatyczką
Szklana butelka250 ml Butelki
Fiolki szklaneMicrotechST 10024Rura z płaskim dnem 100 x 24
Blender ręczny Robot kuchenny PimmyAriete
Natychmiastowy Sukcesdrożdży ESKADrożdże w proszku
Taca do układaniaRzemiosłotace z pleksi (11 cm x 2,6 cm), do których wlewa się podłoże do układania
Metylo4-hydroksybenzoesanSIGMAH5501
Szalka PetriegoSokół35101660x5
Czerwony barwnik nr 40SIGMA16035
Mikroskop stereoskopowy ze światłami LEDLeicaS4E
SacharozaHIMEDIAMB025
Sos pomidorowyCirio

Bibliografia

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38(2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068(2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test p odno citest czasu rozwojutest d ugo ci yciaekspozycja na EDCwydajno rozrodczastadia rozwojowekrzywa prze ywalno ciczynniki eksperymentalne
Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.