Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59536

⸱

13 sierpnia 2019

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Klinicznie, niedobór estrogenu u kobiet w okresie menopauzy może nasilać występowanie zaburzeń lipidowych i miażdżycy. Ustaliliśmy model niedoboru estrogenu in vivo za pomocą obustronnej owariektomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-. Model mysi ma zastosowanie do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.

Streszczenie

Kobiety po menopauzie są bardziej narażone na rozwój chorób sercowo-naczyniowych niż kobiety przed menopauzą. Samice myszy poddane owariektomii (OVX) po odsadzeniu wykazują zwiększone zmiany miażdżycowe w aorcie w porównaniu z samicami myszy z nienaruszoną funkcją jajników. Brakuje jednak modeli laboratoryjnych z udziałem myszy z niedoborem estrogenu i skłonnymi do miażdżycy. Deficyt ten ma kluczowe znaczenie, ponieważ kliniczny niedobór estrogenów u kobiet w okresie menopauzy może nasilać częstość występowania istniejących lub trwających zaburzeń lipidowych i miażdżycy. W tym badaniu ustalamy model myszy z niedoborem estrogenu in vivo przez obustronną owariektomię poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apolipoproteiny E (apoE)-/-. Następnie porównujemy działanie 17β-estradiolu i pseudoprotodioscyny (PPD) (fitoestrogenu) podawanego doustnie przez pastę z orzechów laskowych. Stwierdzamy, że chociaż PPD wywiera pewien wpływ na zmniejszenie końcowej masy ciała i TG w osoczu u myszy OVX apoE-/-, ma zdolności przeciwmiażdżycowe i chroniące serce porównywalne z jego odpowiednikiem 17β-estradiolu. PPD to fitoestrogen, o którym doniesiono, że ma właściwości przeciwnowotworowe. W związku z tym proponowana metoda ma zastosowanie do badań przesiewowych fitoestrogenów podawanych doustnie w celu zastąpienia tradycyjnej hormonalnej terapii zastępczej u kobiet po menopauzie, która według doniesień ma potencjalnie szkodliwą zdolność nowotworową. Doustne podawanie w pastach z orzechów laskowych jest nieinwazyjne, dzięki czemu ma szerokie zastosowanie u wielu pacjentów. Ten artykuł zawiera demonstracje krok po kroku obustronnej jajnikomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/- i doustną wymianę 17β-estradiolu lub hormonu fitoestrogenowego za pomocą pasty z orzechów laskowych. Następnie przeprowadza się analizy stężenia lipidów w osoczu i funkcji układu sercowo-naczyniowego za pomocą echokardiografii.

Wprowadzenie

Badania epidemiologiczne i kliniczne wykazały, że kobiety po menopauzie są znacznie bardziej narażone na choroby sercowo-naczyniowe niż kobiety przed menopauzą1,2. Hormonalna terapia zastępcza (HTZ) może zmniejszyć względne ryzyko chorób sercowo-naczyniowych do 0,37-0,793. Wśród innych powikłań, miażdżyca spowodowana chorobami układu krążenia jest główną przyczyną zgonów na całym świecie4. Brakuje jednak modeli laboratoryjnych z udziałem myszy z niedoborem estrogenu, które mają skłonność do miażdżycy. Protokół ten zapewnia mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.

Poprzednie badania pokazują, że zastosowanie OVX u gryzoni z miażdżycą karmionych dietą o wysokiej zawartości cholesterolu może naśladować kobiety po menopauzie cierpiące na miażdżycę5,6,7,8. Powtarzalny i wygodny model zwierzęcy przypominający stan miażdżycowy u kobiet w okresie menopauzy jest podstawą badań nad egzogennymi estrogenami. W tym przypadku zastosowano podwójne grzbietowo-boczne nacięcie obustronnej jajnikomii u myszy z nokautem apolipoproteiny E podatnej na miażdżycę (apoE-/-)9,10. W porównaniu z nacięciem środkowym brzusznym lub grzbietowym, podwójne nacięcie grzbietowo-boczne jest łatwiejszą, mniej czasochłonną metodą, która pozwala uniknąć poważnego zrostu i stanu zapalnego jamy brzusznej. Doustne podawanie za pośrednictwem pasty z orzechów laskowych (patrz Tabela materiałów) jest nieinwazyjne i wygodne, dzięki czemu ma szerokie zastosowanie jako tryb podawania długoterminowego11. Popularna jest również implantacja granulek o powolnym uwalnianiu6. Jednak implanty mogą nasilać częstość występowania infekcji, zwłaszcza u myszy poddanych OVX. Inne nieinwazyjne sposoby podawania, takie jak podawanie przez zgłębnik doustny i wodę, również mają wiele wad. Zgłębnik w jamie ustnej zazwyczaj stresuje myszy i może powodować uszkodzenie przełyku. Podawanie hormonu przez wodę pitną jest bardzo korzystne; jednak dodanie DMSO jako emulgatora jest nieuniknione, ponieważ egzogenne estrogeny są nierozpuszczalne w wodzie. W tym przypadku wybraliśmy doustną wymianę 17β-estradiolu lub hormonu fitoestrogenowego za pomocą pasty z orzechów laskowych do długotrwałego podawania.

Ostatnio korzystny wpływ HTZ na układ sercowo-naczyniowy kobiet po menopauzie został zakwestionowany w próbach Women's Health Initiative (WHI)12. Z jednej strony sam egzogenny estrogen wywiera korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy; Z drugiej strony, może łączyć się z octanem metohydroksyprogesteronu, aby zwiększyć ryzyko zdarzeń sercowo-naczyniowych. Mówiąc poważniej, HTZ może prowadzić do progresji nowotworów piersi i macicy, a efekt ten znacznie ograniczył jej stosowanie13,14. Większe zainteresowanie skupiło się na chroniącym układ sercowo-naczyniowy działaniu egzogennych estrogenów pozbawionych aktywności mitotycznej w komórkach nowotworowych15,16,17. Liczne badania na ludziach i zwierzętach sugerują, że fitoestrogeny o strukturze podobnej do estrogenów mogą odgrywać korzystną rolę w ochronie układu krążenia15,18.

Tak więc, celem niniejszej pracy jest (i) zbudowanie in vivo mysiego modelu niedoboru estrogenu poprzez obustronną owariektomię poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/- oraz (ii) porównanie sercowo-naczyniowych efektów ochronnych podawanego doustnie 17β-estradiolu i pseudoprotodioscyny (PPD), poprzez pastę z orzechów laskowych. 17β-estradiol to jeden z rodzajów egzogennego estrogenu, który należy do żeńskich hormonów płciowych6,11,19. PPD, saponina steroidowa i fitoestrogen z roślin Dioscorea, została wcześniej zgłoszona do wywierania właściwości przeciwnowotworowych20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Chińskiej Akademii Nauk Medycznych i Peking Union Medical College (Nr pozwolenia: SYXK (Pekin) 2013-0023). Pochodzenie myszy apoE-/- to C57BL/6J9,10.

1. Obustronna owariektomia przez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-

  1. Po odsadzeniu (w wieku 28 dni) znieczulić samice myszy apoE-/- C57BL/6J awertyną (tribromoetanol; 200 mg/kg; dootrzewnowo).
    UWAGA: 32 myszy apoE-/- zostały losowo podzielone na 4 grupy: SHAM, OVX, OVX/E2 i OVX/PPD (n = 8 na grupę).
  2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Zastosuj lubrykant do oczu, aby chronić oczy podczas znieczulenia.
  3. Utrzymuj temperaturę ciała w granicach 36 ± 0,5 °C. Podawać 5 mg/kg masy ciała przeciwbólowego karprofenu podskórnie w boczną stronę szyi myszy.
  4. Ogol obszar myszy o wymiarach 3 x 5 cm2 głowowy od grzebienia biodrowego. Przed pokryciem zwierzęcia prześcieradłem chirurgicznym o wymiarach 3 x 5 cm2 otwory, dokładnie oczyść ogolony obszar jodem, a następnie 70% etanolem. Podczas eksperymentu używaj sterylnych narzędzi i rękawiczek.
  5. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać nacięcie 1 cm w bok od linii środkowej i 1 cm w bok od żeber żebrowych.
  6. Tępo wypreparuj tkankę podskórną za pomocą kleszczy.
  7. Użyj okularów preparacyjnych (patrz Tabela Materiałów), aby zidentyfikować białą tkankę tłuszczową w jamie brzusznej.
  8. Za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków wykonaj 0,5-1 cm nacięcie przez powięź, aż do dotarcia do jamy brzusznej.
    nuta: W przypadku grupy pozorowanej należy bezpośrednio zamknąć rany. Zszyj warstwę mięśniową i skórę oddzielnie za pomocą szwu monofilamentowego.
  9. Gdy widać białą tkankę tłuszczową w jamie brzusznej, chwyć tkankę tłuszczową za pomocą mikrokleszczy i delikatnie ją wyciągnij. Widać różowy jajnik w kształcie morwy owinięty tkanką tłuszczową w jamie brzusznej.
  10. Podwiązać naczynie proksymalne 0,5-1 cm i róg macicy za pomocą szwu monofilamentowego. Usuń jajnik za pomocą mikronożyczek i umieść pozostałą tkankę z powrotem w jamie brzusznej.
    nuta: Głównymi objawami niepożądanymi operacji OVX jest podwiązanie moczowodu, które prowadzi do wysokiej śmiertelności u myszy operowanych OVX. Można tego uniknąć, identyfikując tkanki za pomocą okularów preparacyjnych.
  11. Zamknij rany. Zszyj warstwę mięśniową i skórę oddzielnie za pomocą szwu monofilamentowego.
  12. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać kolejne nacięcie 1 cm w bok od linii środkowej i 1 cm w bok od żeber po drugiej stronie. Powtórzyć powyższą procedurę (1.5 do 1.11).
  13. Pozwól zwierzęciu obudzić się ze znieczulenia. Oddzielnie trzymaj mysz w pierwszej dobie po zabiegu.
  14. Często czyść lub wymieniaj klatkę w fazie rekonwalescencji.
  15. Po około 24 godzinach od zabiegu należy podać podskórnie kolejne 5 mg/kg masy ciała przeciwbólowego karprofenu.

2. Doustne podawanie 17β-estradiolu lub PPD za pośrednictwem pasty z orzechów laskowych

  1. Dokładnie rozpuść 17β-estradiol lub PPD w oleju sezamowym, a następnie wymieszaj olej sezamowy z pastą z orzechów laskowych (patrz Tabela Materiałów). Dzienna porcja na każde 30 g myszy zawiera 3 μg 17β-estradiolu lub 15 μg PPD, 4 μl oleju sezamowego i 60 mg pasty z orzechów laskowych. Przygotuj placebo na każde 30 g myszy zawierającej 4 μl oleju sezamowego i 60 mg pasty z orzechów laskowych.
    nuta: Codzienna porcja podawania 17β-estradiolu lub PPD była oparta na wcześniejszych badaniach6,11 i wstępnych eksperymentach.
  2. Tydzień po OVX karm myszy dietą wysokocholesterolową (1,25% cholesterolu, 0% cholanu) przez 12 tygodni. Typowy eksperymentalny schemat leczenia, zastosowany w tym badaniu, jest zilustrowany na Rysunek 1.
  3. 5 dni przed doustnym podaniem pasty z orzechów laskowych w 4 tygodniu należy trenować myszy, aby jadły placebo zawierające około 30 mg pasty z orzechów laskowych dla 2-5 myszy przez 5 dni. Trenuj myszy w grupach w ich domowych klatkach przez pierwsze 3 dni. Umieść myszy w oddzielnych klatkach w czwartym i piątym dniu treningu i podawaj dzienną porcję, aby przypominała sytuację eksperymentalną.
  4. W ciągu ostatnich 9 tygodni umieść myszy w oddzielnych klatkach, a następnie podawaj codzienną porcję pasty z orzechów laskowych na każdą okazję do karmienia.
    nuta: Podawać dzienną porcję zawierającą 17β-estradiol (0,1 mg·kg-1) lub PPD (0,5 mg·kg-1) w postaci pasty z orzechów laskowych odpowiednio w grupie OVX/E2 i OVX/PPD; podawać dzienną porcję zawierającą bezhormonalną pastę z orzechów laskowych w grupie SHAM i OVX.

3. Oznaczanie grubości błony wewnętrznej i środkowej oraz dysfunkcji serca za pomocą systemu mikroultrasonograficznego

  1. Biomikroskopia ultrasonograficzna
    1. Na dzień przed zakończeniem ciąży należy zbadać grubość błony wewnętrznej i środkowej oraz dysfunkcję serca za pomocą systemu mikroultrasonograficznego (patrz Tabela Materiałów), jak opisano wcześniej21.
    2. Przed badaniem należy podać każdej myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie 200 mg/kg awertyny (tribromoetanolu) w znieczuleniu (n = 8 myszy na grupę).
    3. Dokładnie ogol włosy na szyi każdej myszy. Nakładaj obficie ciepły żel do transmisji ultradźwięków, aby zapewnić optymalną jakość obrazu.
    4. Uzyskaj podstawowe obrazy ultrasonograficzne korzenia aorty i aorty wstępującej za pomocą głowicy skanującej 30 MHz przy ogniskowej 12,7 mm i rozdzielczości 40 μm.
    5. Do monitorowania należy stosować elektrokardiografię z konfiguracją odprowadzeń II.
    6. Uchwyć obrazy prawej osi przymostkowej o długiej osi aorty wstępującej, łuku aorty i gałęzi tętnicy ramienno-głowowej w jednej płaszczyźnie skurczu (Rysunek 3).
  2. Pomiary błony wewnętrznej i środkowej oraz maksymalnej grubości płytki nazębnej
    1. Łatwo dostosuj odległość między przetwornikiem a miejscem tętnicy, aby uzyskać wyraźne obrazy.
    2. Przechowuj cyfrowo 10-sekundową pętlę filmową do badania w trybie offline w systemie analizy obrazu.
    3. Ręcznie wybierz optymalny obraz ultrasonograficzny z zamrożoną klatką do dalszych pomiarów. Sprawdź obrazy w mniejszej krzywiźnie aorty wstępującej. Jeśli widoczna jest płytka nazębna w aorcie wstępującej, zmierz maksymalną grubość płytki nazębnej. Jeśli nie widać blaszki miażdżycowej w aorcie wstępującej, zmierz maksymalny IMT.
    4. Zmierz IMT (odległość między naczyniowym interfejsem luminalno-wewnętrznym a interfejsem przyśrodkowo-przybyszowym). Zmierz maksymalną grubość płytki nazębnej (najgrubsza odległość między granicą światła naczynia a warstwą przybyszową).
    5. Średnie dane z trzech miejsc zmian chorobowych (Rysunek 3).
  3. Oznaczanie dysfunkcji serca za pomocą echokardiografii
    UWAGA:     Zbadaj czynność serca za pomocą echokardiografii za pomocą systemu mikroultrasonograficznego, jak opisano wcześniej22.
    1. Skieruj wiązkę ultradźwięków w stronę serca, w pobliżu mięśni brodawkowatych.
    2. Uzyskaj dwuwymiarową wizualizację kilohercową opartą na elektrokardiogramie.
    3. Wykonać echokardiografię przezklatkową lewej komory ciała in vivo za pomocą głowicy skanującej 30 MHz.
    4. Cyfrowy pomiar parametrów związanych z czynnością serca na podstawie zapisów w trybie M.
    5. Uśrednić dane z trzech do pięciu cykli pracy serca (Tabela 1).
  4. Zmienność wewnątrz i między obserwatorami
    1. Aby sprawdzić poprawność zmienności wewnątrz obserwatora, przeanalizuj dane przez jednego operatora przy dwóch różnych okazjach.
    2. Aby ocenić zmienność między obserwatorami, przeanalizuj dane przez innego operatora.

4. Tygodniowy pomiar masy ciała i oznaczanie całkowitego cholesterolu (TC) i trójglicerydów (TG) w osoczu

  1. Tygodniowy pomiar masy ciała
    1. Mierz masę ciała raz w tygodniu od tygodnia -1 do tygodnia 12.
      UWAGA: n = 8 myszy na grupę.
  2. Przygotowanie osocza
    1. Przed pobraniem próbek krwi przez nakłucie dosercowe należy przygotować strzykawki i rurki. Użyj EDTA jako antykoagulantu. Dodaj 10 μl 0,5 M EDTA do każdej strzykawki o pojemności 2 ml i dodaj 8 μl 0,5 M EDTA do każdej probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. W 12 tygodniu, po całonocnym poście, znieczulij myszy awertyną (tribromoetanol; 200 mg/kg; dootrzewnowo).
      UWAGA: n = 3 myszy w grupie.
    3. Przygotuj brzuszną część klatki piersiowej za pomocą 70% etanolu.
    4. Użyj nożyczek i kleszczy, aby otworzyć klatkę piersiową i przeciąć żebra, aż bijące serce zostanie odsłonięte.
    5. Wprowadzić igłę 25 G do prawej komory. Zasysać powoli, aż krew zacznie napływać do strzykawki.
      nuta: Używamy jednorazowych strzykawek w stanie sterylnym z igłami 25 G (patrz Tabela Materiałów).
    6. Kontynuuj zasysanie ze stałym, równomiernym naciskiem. Jeśli krew nie jest widoczna, należy zmienić położenie igły i powtórzyć aspirację.
    7. Utrzymuj myszy głęboko znieczulone przed pobraniem wymaganej objętości krwi. Zwykle można pobrać do 1 ml krwi. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w tym głębokim stanie znieczulenia.
    8. Pobrać pipetować próbki krwi do probówek o pojemności 1,5 ml i dokładnie odwrócić krew, aby zapewnić wymieszanie EDTA z krwią. Następnie natychmiast umieść próbki krwi na lodzie.
    9. Odwirowywać próbki przez 20 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C w ciągu 30 minut od pobrania.
    10. Ostrożnie zebrać supernatant. Porcjować i przechowywać próbki osocza w temperaturze -80 °C.
  3. Konstruowanie krzywych standardowych do pomiaru zawartości TC lub TG
    1. Dla krzywej wzorcowej TC przygotuj różne stężenia wzorców cholesterolu: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L i 10,34 mmol/L. Zmierz OD dla każdego wzorca cholesterolu. Ustaw średnią średnicę zewnętrzną dla każdego standardu cholesterolu. Jako wartość osi pionowej (Y) ustaw koncentrację jako wartość osi poziomej (X). Utwórz krzywą standardową za pomocą oprogramowania statystycznego.
    2. Dla krzywej wzorcowej TG przygotuj różne stężenia wzorców TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L i 9,04 mmol/L. Zmierz OD dla każdego wzorca TG. Ustaw średnią średnicę zewnętrzną dla każdego standardu TG jako wartość osi pionowej (Y); ustawić stężenie jako wartość osi poziomej (X). Tworzenie krzywej standardowej przy użyciu oprogramowania statystycznego.
      nuta: W niniejszym badaniu zastosowano czteroparametrowe dopasowanie krzywej logistycznej (4-pl) do konstrukcji krzywej standardowej. Przed pomiarem próbek osocza należy sprawdzić krzywą wzorcową i upewnić się, że r2 jest większe niż 0,995.
  4. Pomiar zawartości TC
    1. Oznacz butelkę odczynnika barwnego (25 ml) z zestawu do oznaczania TC jako "Roztwór roboczy TC".
    2. Krótko przemieszaj schłodzone próbki. Przygotować rozcieńczenia: 20 μl osocza w 80 μl wody destylowanej. Krótko rozcieńczenia wirowe.
    3. Dodaj 2,5 μl wzorców cholesterolu (5,17 mmol/L) lub 2,5 μl rozcieńczonego osocza lub 2,5 μl wody destylowanej (ślepa próba) do odpowiednich studzienek 96-dołkowej płytki. Zaleca się potrojenie.
    4. Do wszystkich studzienek dodać 250 μl odczynnika barwiący.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    6. Włącz czytnik mikropłytek i pozwól mu się rozgrzać przez 10 minut.
    7. Wyjąć płytkę (płytki) z inkubatora i odczytać odczyt z czytnika mikropłytek przy długości fali 510 nm. Upewnij się, że w studzienkach do mikromiareczkowania lub na dnie płytki nie ma pęcherzyków ani pyłu.
    8. Obliczyć stężenie TC w następujący sposób:
      TC cont. = normy cholesterolu cd. × (próbka osocza OD -ślepa OD)/(wzory cholesterolu OD -ślepa OD)
  5. Pomiar zawartości TG
    1. Oznacz butelkę odczynnika barwnego (25 ml) z zestawu do oznaczania TG jako "roztwór roboczy TG".
    2. Krótko przemieszaj schłodzone próbki.
    3. Dodać 2,5 μl wzorców TG (2,26 mmol/l) do lub 2,5 μl rozcieńczonego osocza lub 2,5 μl wody destylowanej (ślepa próba) do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce. Zaleca się potrojenie.
    4. Do wszystkich studzienek dodać 250 μl odczynnika barwiący.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    6. Włącz czytnik mikropłytek i pozwól mu się rozgrzać przez 10 minut.
    7. Wyjąć płytkę (płytki) z inkubatora i odczytać odczyt czytnika mikropłytek przy 510 nm.
      nuta: Upewnij się, że w studzienkach do mikromiareczkowania lub na dnie płytki nie ma pęcherzyków ani kurzu.
    8. Obliczyć stężenie TG w następujący sposób:
      TG cd. = wzorce TG cd. × (próbka osocza OD-ślepa OD)/(Wzory TG OD-ślepa OD)

5. Analiza en face zmian miażdżycowych aorty

  1. Izolacja i wycięcie aorty
    1. W 12 tygodniu, po całonocnym poście, znieczulenie myszy awertyną (tribromoetanol; 200 mg / kg; dootrzewnowo). Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w tym głębokim znieczuleniu.
      nuta: Użyliśmy 3 myszy w grupie.
    2. Przygotuj brzuszną część klatki piersiowej za pomocą 70% etanolu. Użyj nożyczek i kleszczy, aby otworzyć klatkę piersiową i przeciąć żebra, aż bijące serce zostanie odsłonięte.
    3. Napełnić strzykawkę o pojemności 50 ml solą fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 (patrz tabela materiałów). Włóż igłę o wadze 25 G do lewej komory i przetnij prawy przedsionek, aby uniknąć wysokiego ciśnienia podczas perfuzji.
    4. Wykonać perfuzję in situ z natężeniem przepływu 0,05-0,08 ml/min. Wchłonąć płyn perfuzyjny z tkankami.
    5. Usuń żebra i płuca w klatce piersiowej za pomocą nożyczek i kleszczy. Następnie otwórz jamę brzuszną i usuń narządy znajdujące się w środku, aby uzyskać lepszy widok aorty.
    6. Usuń aortę, przytrzymując serce mikrokleszczami i oddzielając aortę od kręgosłupa grzbietowo za pomocą mikronożyczek, aż do rozwidlenia biodrów.
      nuta: Podczas preparowania w pobliżu gałęzi przedsionków nerkowych należy ciąć głęboko za pomocą mikronożyczek, aby uniknąć uszkodzenia aorty.
    7. Napraw serce i aortę na 48 godzin w 4% paraformaldehydzie. Przechowywać aorty w soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 2-8 °C przez kilka godzin.
      nuta: Ta procedura ułatwi czyszczenie.
  2. Przygotowanie aorty
    1. Usuń serce. Ostrożnie usuń tkanki przybyszowe z aort za pomocą mikrokleszczy i mikronożyczek pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj soli fizjologicznej, aby utrzymać wilgotność chusteczki podczas czyszczenia.
      nuta: Uważaj, aby nie rozerwać ani nie naciąć aorty i niektórych ważnych gałęzi, takich jak tętnica nienazwana, lewa tętnica szyjna wspólna i lewa tętnica podobojczykowa.
    2. Pozostaw 1 mm bezimiennej i lewej tętnicy szyjnej wspólnej i odetnij całą lewą tętnicę podobojczykową.
    3. Rozetnij zewnętrzną krzywiznę przez tętnicę bezimienną, następnie do lewej tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie do lewej tętnicy podobojczykowej.
    4. Rozciąć wzdłuż wewnętrznej krzywizny części wstępującej do dołu części brzusznej.
    5. Przypnij aortę płasko do czarnego plastikowego arkusza i nałóż sól fizjologiczną, aby zapobiec wyschnięciu aorty.
  3. Obraz okolicy wewnętrznej aorty
    1. Rób zdjęcia aort en face za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Dołącz linijkę w skali milimetrowej do obrazów, aby skalibrować pomiary.
    2. Uwzględnij obszar łuku i klatki piersiowej na tym samym obrazie, a obszar brzucha na innym. Zapisywanie obrazów w formacie JPEG lub TIFF.
      nuta: Obszar łuku znajduje się od połączenia mięśnia sercowego do 3 mm dystalnie od lewej tętnicy podobojczykowej, obszar piersiowy jest 3 mm dystalnie do lewej tętnicy podobojczykowej do ostatniej tętnicy międzyżebrowej, a obszar brzuszny jest ostatnią tętnicą międzyżebrową do rozwidlenia biodrowego.
  4. Kwantyfikacja zmian miażdżycowych metodą en face
    1. wzorcowanie
      1. Otwórz obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów), przejdź do Kalibracji przestrzennej i postępuj zgodnie z instrukcjami.
      2. Zmień jednostki odniesienia na mm, umieszczając linijkę nad linią.
    2. pomiar
      1. Ustaw poprawną kalibrację dla każdego obrazu.
      2. Zmierz 3 mm na linijce.
      3. Pomiar łuku i okolicy piersiowej: Nakreśl obszar łuku od połączenia mięśnia sercowego do 3 mm dystalnie od lewej tętnicy podobojczykowej i okolicy piersiowej od 3 mm dystalnie do lewej tętnicy podobojczykowej do ostatniej tętnicy międzyżebrowej. Śledź zmiany w łuku i okolicy piersiowej i spójrz na aortę przez mikroskop.
      4. Pomiar okolicy brzucha: Nakreśl obszar brzucha od końca okolicy piersiowej do rozwidlenia biodrowego. Śledź zmiany w okolicy brzucha i spójrz na aortę pod mikroskopem.
      5. Oblicz obszar zmiany w stosunku do wewnętrznej powierzchni aorty.
      6. Zweryfikuj kwantyfikację za pomocą drugiego obserwatora, który jest ślepy na grupy badane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowy schemat traktowania doświadczalnego, zastosowany w niniejszym badaniu, przedstawiono na Rysunku 1. W momencie odsadzenia (wiek 28 dni) samice myszy apoE-/- C57BL/6J zanieczulono avertinem (tribromoetanolem; 200 mg/kg; doglebowo). U myszy przeprowadzono obustronną OVX lub operację pozorowaną (sham) poprzez 1 cm nacięcie grzbietowe. Tydzień po obustronnej OVX myszy karmiono dietą wysokocholesterolową (1,25% cholesterolu, 0% cholanu) przez 12 t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metodologia to model mysi przypominający zaburzenia lipidowe i miażdżycę obserwowaną u kobiet w okresie menopauzy. Jest dobrze udokumentowane, że niedobór estrogenów u kobiet po menopauzie może nasilać częstość występowania wcześniej istniejącej lub trwającej hipercholesterolemii z postępującymi złożonymi i rozległymi zmianami miażdżycowymi1. Aby naśladować stan podatności na miażdżycę w klinice, zastosowano myszy z niedoborem apoE, powtarzalne i wygodne źródło zwierząt, z którymi mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81202526 do J.X.), Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (81302769 do B.S.), Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (47144226 do B.S.), Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (20110490325 do J.X.) oraz Fundację Programów Doktoranckich Ministerstwa Edukacji Chin (20121106120031 do B.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
17β-estradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGJednorazowe
strzykawki estrogenowe (z igłami 25 G)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0,5 * 19TWLBKrwawienie serca Dieta
myszy o wysokiej zawartości cholesteroluHuafukang Bio-TechnologyNie dotyczy1,25% cholesterolu, 0% cholanu
Systemmikroobrazowania In Vivo o wysokiej rozdzielczościVisualSonicsVevo® 770Pomiary grubości błony wewnętrznej i środkowej i dysfunkcji serca
2-metylo-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLPrzygotowanie avertin
Mikro kleszczy preparacyjnych, zakrzywione 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Mikro kleszcze preparacyjne, proste 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia
chirurgiczneNożyczki do mikropreparacji, zakrzywione/ostre 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Nożyczki do mikropreparacji, proste/ostre 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Szew monofilamentowy 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Szew i podwiązanie tkanek
Krem orzechowy (Nutella)FerreroNie dotyczyPodłoże do przezoralnej 17&beta-estradiolu lub PPD
OptiVisor szklana lupa lornetka optycznaDohegan Optical Company Inc.Nie dotyczyAsystent identyfikacji tkanek podczas owariektomii
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami o pH 7,4SIGMAP3813Przygotowanie 1 l soli
fizjologicznej Pro MultiLabel Czytnik mikropłytek TecanInfinite M1000Osocze TC i TG
PseudoprotodioscynaShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427Nr rejestru CAS 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mlPfizer Pharma GmbH462986Analgezja pooperacyjna po wycięciu jajników
Olej sezamowySigma-AldrichS3547-1LRozpuszczanie 17β-estradiolu lub PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Ochrona oczu podczas znieczulenia
Mikroskop stereoskopowyMCALONMCL-6STVObraz okolicy wewnętrznej aorty
Model stołowy wirówka szybkoobrotowaSIGMA1-14KPrzygotowanie osocza
Nożyczki, niewielka krzywa (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Nożyczki, proste płaskie (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Kleszczyki do tkanek, ząbkowane, lekkie Krzywa (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
Kleszczyki do tkanek, ząbkowane, proste Płaskie (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdNarzędzia chirurgiczne
TribromoetanolSigma-AldrichT48402-5G
do oznaczania triglicerydówInstytut Inżynierii Biologii w Nankinie JianchengA110-1Oznaczanie TG w osoczu
Zestaw do oznaczania cholesterolu całkowitego (TC)Instytut Nanjing Jiancheng Inżynieria BiologiiA111-1Oznaczanie TC w osoczu
Przygotowanie zestawu avertyny (TG)

Bibliografia

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obustronna owariektomiamyszy z nokautem genu ApoEpodanie doustnekrem orzechowy z laskowychanaliza lipid w w osoczuechokardiografiaocena zmian mia d ycowychprzesiewowe badanie fitoestrogen w
Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.