Artykuł metodologiczny

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

DOI:

10.3791/59538

⸱

15 maja 2019

 ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus i inne patogeny Gram-dodatnie wprowadzają kwasy tłuszczowe z otoczenia do fosfolipidów błonowych. Podczas infekcji większość egzogennych kwasów tłuszczowych jest obecna w cząsteczkach lipoprotein gospodarza. Pozostaje niepewność co do rezerwuarów kwasów tłuszczowych gospodarza i mechanizmów, za pomocą których bakterie ekstrahują kwasy tłuszczowe z cząstek lipoprotein. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z żółtka jaja kurzego i określania, czy LDL służą jako rezerwuary kwasów tłuszczowych dla S. aureus. Metoda ta wykorzystuje bezstronną analizę lipidomiczną i LDL kurczaka, skuteczny i ekonomiczny model do badania interakcji między LDL a bakteriami. Analiza integracji S. aureus egzogennych kwasów tłuszczowych z LDL jest przeprowadzana przy użyciu spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości/dokładności i tandemowej spektrometrii mas, co umożliwia scharakteryzowanie składu kwasów tłuszczowych błony bakteryjnej i bezstronną identyfikację nowych kombinacji kwasów tłuszczowych, które powstają w lipidach błon bakteryjnych po ekspozycji na LDL. Te zaawansowane techniki spektrometrii mas oferują niezrównaną perspektywę włączania kwasów tłuszczowych poprzez ujawnienie specyficznych egzogennych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów. Przedstawione tutaj metody można dostosować do badania innych patogenów bakteryjnych i alternatywnych źródeł złożonych kwasów tłuszczowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) jest główną przyczyną zakażeń związanych z opieką zdrowotną, a związana z tym oporność na antybiotyki stanowi poważne wyzwanie kliniczne1,2,3. W związku z tym opracowanie nowych strategii terapeutycznych ma wysoki priorytet. Obiecującą strategią leczenia patogenów Gram-dodatnich jest hamowanie syntezy kwasów tłuszczowych, co jest wymogiem do produkcji fosfolipidów błonowych, które w S. aureus obejmują fosfatydyloglicerol (PG), lizylo-PG i kardiolipinę4. U bakterii produkcja kwasów tłuszczowych odbywa się za pośrednictwem szlaku syntezy kwasów tłuszczowych II (FASII)5, który znacznie różni się od eukariotycznego odpowiednika, co czyni FASII atrakcyjnym celem dla rozwoju antybiotyków5,6. Inhibitory FASII są przede wszystkim ukierunkowane na FabI, enzym niezbędny do wydłużenia łańcucha węglowego kwasów tłuszczowych7. Inhibitor FabI, triklosan, jest szeroko stosowany w towarach konsumpcyjnych i medycznych8,9. Dodatkowe inhibitory FabI są opracowywane przez kilka firm farmaceutycznych do leczenia <zakażenia S. aureus class="xref">10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Jednak wiele patogenów Gram-dodatnich, w tym S. aureus, jest zdolnych do wymiatania egzogennych kwasów tłuszczowych w celu syntezy fosfolipidów, omijając hamowanie FASII27,28,29. Tak więc potencjał kliniczny inhibitorów FASII jest dyskutowany ze względu na znaczne luki w naszej wiedzy na temat źródeł kwasów tłuszczowych gospodarza i mechanizmów, za pomocą których patogeny ekstrahują kwasy tłuszczowe z host27,28. Aby wypełnić te luki, opracowaliśmy bezstronną metodę analizy lipidomicznej w celu monitorowania włączania egzogennych kwasów tłuszczowych z cząstek lipoprotein do fosfolipidów błonowych S. aureus.

Podczas sepsy cząsteczki lipoprotein gospodarza stanowią potencjalne źródło kwasów tłuszczowych pochodzących od gospodarza w obrębie układu krwionośnego, ponieważ większość kwasów tłuszczowych gospodarza jest związana z cząsteczkami30. Lipoproteiny składają się z hydrofilowej powłoki złożonej z fosfolipidów i białek, które otaczają hydrofobowy rdzeń z trójglicerydów i estrów cholesterolu31. Cztery główne klasy lipoprotein - chylomikron, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości, lipoproteiny o dużej gęstości i lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) - są wytwarzane przez gospodarza i działają jako nośniki transportu lipidów, dostarczając kwasy tłuszczowe i cholesterol do iz komórek gospodarza przez układ naczyniowy. LDL są bogate w estryfikowane kwasy tłuszczowe, w tym trójglicerydy i estry cholesterolu31. Wcześniej wykazaliśmy, że wysoce oczyszczone ludzkie LDL są realnym źródłem egzogennych kwasów tłuszczowych do syntezy PG, zapewniając w ten sposób mechanizm obejścia inhibitora FASII32. Oczyszczanie ludzkich LDL może być technicznie trudne i czasochłonne, podczas gdy komercyjne źródła oczyszczonych ludzkich LDL są zbyt drogie w rutynowym stosowaniu lub przeprowadzaniu badań przesiewowych na dużą skalę. Aby rozwiązać te problemy, zmodyfikowaliśmy procedurę wzbogacania LDL z żółtka jaja kurzego, bogatego źródła cząsteczek lipoprotein33. Z powodzeniem zastosowaliśmy nieukierunkowaną, wysokorozdzielczą/dokładną spektrometrię mas i tandemową spektrometrię mas do monitorowania wprowadzania ludzkich kwasów tłuszczowych pochodzących z LDL do błony S. aureus32. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, podejście to może określić ilościowo poszczególne izomery kwasów tłuszczowych dla każdego z trzech głównych typów fosfolipidów gronkowcowych. Kwas oleinowy (18:1) jest nienasyconym kwasem tłuszczowym obecnym we wszystkich cząsteczkach lipoprotein gospodarza, który jest łatwo włączany do fosfolipidów S. aureus29,30,32. S. aureus nie jest zdolny do syntezy kwasu oleinowego29; W związku z tym ilość kwasu oleinowego inkorporowanego fosfolipidami określa obecność kwasów tłuszczowych pochodzących z lipoprotein gospodarza w błonie gronkowcowej29. Te gatunki fosfolipidów można zidentyfikować za pomocą opisanej tutaj najnowocześniejszej metody spektrometrii mas, oferującej niespotykaną rozdzielczość składu błonowego S. aureus hodowanego w obecności źródła kwasów tłuszczowych, z którym prawdopodobnie spotyka się podczas infekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższy protokół wzbogacania cząsteczek LDL z żółtka jaja kurzego pochodzi od Moussa et al. 200233.

1. Przygotowanie żółtka jaja kurzego do wzbogacenia w cząsteczki LDL

  1. Zdezynfekuj dwa duże jaja kurze, myjąc skorupki 70% roztworem etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  2. Zdezynfekuj separator jaj za pomocą 70% roztworu etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przymocuj separator do jaj na krawędzi średniej wielkości zlewki.
  3. Wbij każde jajko z osobna do separatora jaj i pozwól, aby białko spłynęło do zlewki. Nienaruszone żółtko jaja zostanie zatrzymane przez separator.
  4. Żółtko jaja przemyć dwukrotnie 30 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia resztek białka.
  5. Delikatnie umieść żółtko na bibule filtracyjnej.
  6. Nakłuć błonę witelinową sterylną końcówką pipety i spuścić zawartość błony do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wyrzuć membranę i bibułę filtracyjną.

2. Frakcjonowanie osocza zawierającego LDL z żółtka jaja kurzego

  1. Dodać około dwóch objętości 0,17 M NaCl o pH 7,0 do żółtka jaja i energicznie wymieszać. Następnie mieszać ten roztwór w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
  2. Odwirować rozcieńczenie żółtka jaja w temperaturze 10 °C przy 10 000 x g przez 45 minut. Usunąć frakcję osocza (supernatant) z frakcji granulowanej (osadu) do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  3. Powtórz krok 2.2.

3. Izolacja cząsteczek LDL z osocza

  1. Mieszać frakcję osocza z 40% siarczanem amonu (w/v) w temperaturze 4 °C przez 60 min.
  2. Dostosować pH frakcji osocza za pomocą 420 mM roztworu NaOH do 8,7.
  3. Odwirować rozcieńczenie żółtka jaja w temperaturze 4 °C przy 10 000 x g przez 45 minut. Usunąć górną półstałą frakcję żółtą do rurki dializacyjnej o wielkości porów 7 kDa. Zapewnij miejsce w rurce, aby umożliwić jej pęcznienie.
  4. Dializować przez noc w temperaturze 4 °C w 3 litrach ultraczystej wody w celu usunięcia siarczanu amonu. Delikatnie wymieszaj wodę za pomocą mieszadła.
  5. Przenieść dializowany roztwór do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować roztwór w temperaturze 4 °C przy 10 000 x g przez 45 minut. Ostrożnie usunąć górną półstałą frakcję żółtą do sterylnej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Ocena LDL kurczaka jako źródła kwasów tłuszczowych

  1. Subkulturuj komórki S. aureus w 5 ml wolnego od kwasów tłuszczowych 1% bulionu tryptonowego i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (225 obr./min). W przypadku auksotrofów kwasów tłuszczowych uzupełnij kultury źródłem kwasów tłuszczowych.
  2. Rozcieńczyć kultury przez noc do gęstości optycznej (OD) przy 600 nm (OD600) 0,1 w 1% bulionu tryptonowego. Odpipetować 50 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na okrągłodennej 96-dołkowej płytce.
    UWAGA: Podczas pracy z auksotrofami kwasów tłuszczowych należy umyć nocne kultury w dwóch objętościach bulionu tryptonowego i ponownie zamieszać w 5 ml bulionu tryptonowego, aby ograniczyć przenoszenie kwasów tłuszczowych przed określeniem OD kultury.
  3. W przypadku studzienek zawierających niepoddane działaniu substancji kontrolne dodać 50 μl 1% bulionu tryptonowego na studzienkę.
  4. Do studzienek zawierających eksperymentalne zawiesiny komórkowe dodać 50 μl 1% bulionu tryptonowego uzupełnionego 10% LDL pochodzącym z żółtka jaja, 2 μM triklosanu lub mieszaniny 10% LDL pochodzącego z żółtka jaja i 2 μM triklosanu.
    UWAGA: W tym momencie każda studzienka będzie zawierała 100 μL, a końcowe stężenie LDL i triklosanu pochodzącego z żółtka jaja na studzienkę wyniesie odpowiednio 5% i 1 μM.
  5. Zmierz OD600 w czasie, używając czytnika mikropłytek ustawionego na 37 °C z ciągłym, liniowym wstrząsaniem w celu monitorowania wzrostu.

5. Inkubacja S. aureus z LDL do analizy lipidów błonowych.

  1. Wyhodować izolowaną kolonię w 5 ml wolnego od kwasów tłuszczowych 1% bulionu tryptonowego i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (225 obr./min).
  2. Rozcieńczyć kultury przez noc w stosunku 1:100 do sterylnej kolby z przegrodami o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml 1% bulionu tryptonowego. Inkubować do środkowej fazy logarytmicznej (około 4 h) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  3. Przenieś 25 ml kultury do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i zagnieźdź komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 750 μl 1% bulionu tryptonowego.
  4. Połączyć zawieszone komórki i podwielokrotność 300 μl zawiesiny komórek w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać LDL do pożądanego stężenia końcowego i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (225 obr./min) przez 4 godziny.
  6. Odwirować kultury w temperaturze 4 °C przy 16 000 x g przez 2 minuty i przemyć granulki komórek w dwóch objętościach sterylnego PBS, a następnie powtórzyć.
  7. Zapisać masę każdej mokrej granulki komórek. Zawiesić granulki komórek na suchym lodzie lub w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub przejść bezpośrednio do sekcji 6.

6. Ekstrakcja lipidów błony złocistej

  1. Umieść zamrożone granulki komórek S. aureus na suchym lodzie. Dodaj kulki tlenku cyrkonu o średnicy 0,5 mm na wierzch każdej granulki komórkowej, używając objętości kulek w przybliżeniu równej objętości osadu komórkowego.
    UWAGA: Jako alternatywę dla tej metody ekstrakcji lipidów, badacze mogą użyć dobrze znanych metod Bligha i Dyera lub Folcha do pobierania lipidów z komórek bakteryjnych34.
  2. Dodać 740 μl 75% metanolu (klasa HPLC) schłodzonego do temperatury -80 °C bezpośrednio do granulek komórek.
  3. Dodać 2 μl 50 μM dimyrystoylfosfatydylocholiny (przygotowanej w metanolu) na 1 mg komórek jako wzorzec wewnętrzny. Zamknij probówkę i umieść probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml zawierające każdą próbkę w dostępnym porcie w homogenizatorze tkankowym Bullet Blender. Homogenizować próbki na niskich obrotach, ustawiając 2-3, przez 3 minuty.
  4. Przeprowadzić wzrokową kontrolę próbek pod kątem jednorodności. Jeśli widoczne są grudki komórek, kontynuuj homogenizację w Bullet Blender w odstępach 2-minutowych.
  5. Wyjmij próbki z Bullet Blendera i przenieś do dygestorium chemicznego.
  6. Dodać 270 μl chloroformu do każdej probówki z próbką. Energicznie wirować próbki przez 30 min.
    UWAGA: Chloroform jest możliwym czynnikiem rakotwórczym.
  7. Próbki należy odwirować w wirówce stołowej przez okres do 30 minut przy minimalnej sile 2 000 g. Większe prędkości mogą być stosowane z kompatybilnymi probówkami wirówkowymi, a czas wirowania może zostać skrócony do 10 minut.
  8. W dygestorium chemicznym zebrać monofazowy supernatant i przenieść do nowej probówki, ostrożnie unikając osadu białkowego na dnie probówki ekstrakcyjnej.
  9. Dodać 740 μl 75% metanolu (klasa HPLC) i 270 μl chloroformu do osadu białkowego i ponownie wyekstrahować każdą próbkę zgodnie z opisem w krokach 6.6-6.8 powyżej. Połączyć supernatant z drugiej ekstrakcji z poprzednio pobranym supernatantem dla każdej próbki.
  10. Odparować rozpuszczalniki ekstrakcyjne pod strumieniem gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon, lub w próżni za pomocą koncentratora wirówki (tabela materiałów).
  11. Przepłukać wysuszone ekstrakty lipidowe trzykrotnie 1,0 ml wodnego roztworu wodorowęglanu amonu o stężeniu 10 mM i ponownie wysuszyć próbki, jak w kroku 6.10.
  12. Zawiesić wysuszone ekstrakty lipidowe w odpowiednim rozpuszczalniku niepolarnym, takim jak izopropanol. Zawiesić próbki, stosując 20 μl na 1 mg masy świeżych komórek, oznaczoną w kroku 5.7 Alternatywnie, jeżeli masa osadków komórek jest nieznana, ponownie zawiesić próbki w 200 μl izopropanolu i przejść do sekcji 7.

7. Analiza profili lipidowych S. aureus przy użyciu wysokiej rozdzielczości/dokładnej spektrometrii mas

  1. Przed przeprowadzeniem pełnej analizy lipidów należy wybrać reprezentatywne próbki testowe z grupy eksperymentalnej (grup) eksperymentalnej (grup eksperymentalnych) i przeanalizować je w zakresie współczynników rozcieńczenia próbki w celu określenia zakresów rozcieńczenia próbki, w których całkowite stężenia lipidów mieszczą się w liniowym zakresie odpowiedzi detektora dla spektrometru masowego, jak opisano wcześniej35.
  2. Odparować podwielokrotności każdej próbki ekstraktu lipidowego, która ma być poddana analizie lipidowej, poprzez suszenie podwielokrotności w gazie obojętnym lub w próżni w koncentratorze wirówkowym (tabela materiałów).
  3. Zawiesić każdy wysuszony ekstrakt lipidowy w chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) klasy izopropanol:metanol (2:1, v:v) zawierającej 20 mM mrówczanu amonu, stosując objętości odpowiadające optymalnemu współczynnikowi rozcieńczenia próbki, jak określono w kroku 7.1.
  4. W przypadku nieukierunkowanej analizy lipidów próbki mogą być wprowadzane bezpośrednio do platformy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości/dokładności bez użycia chromatografii poprzez wtryskiwanie przepływowe lub bezpośrednią infuzję ekstraktów35,36. Przenieść rozcieńczone ekstrakty lipidowe przygotowane w kroku 7.3 do odpowiedniej fiolki z autosamplerem lub na płytkę 96-dołkową.
  5. W przypadku analizy opartej na wtryskiwaniu przepływu należy umieścić fiolki automatycznego podajnika próbek w automatycznym podajniku próbek o kontrolowanej temperaturze (15 °C) systemu HPLC zdolnym do zastosowań kapilarnych/o niskim przepływie, takim jak HPLC (Tabela Materiałów) wyposażonym w elektroniczny system dozowania przepływu i monitorowania przepływu.
  6. Napełnić zbiorniki rozpuszczalnika HPLC izopropanolem:metanolem klasy LC-MS (2:1, v:v) zawierającym 20 mM mrówczanu amonu.
  7. Korzystając z oprogramowania Agilent Chemstation, zaprogramuj automatyczny podajnik próbek HPLC tak, aby wykonywał iniekcje o pojemności 5 μl. Z menu Instrument wybierz opcję Set Up Injector (Konfiguracja wtryskiwacza) i wpisz 5.0 w polu Injection Volume (Objętość wtrysku). Jednostki podawane są w mikrolitrach. Upewnij się, że HPLC jest ustawiona na przepływ izokratyczny przy 1 μl na minutę izopropanolu:metanolu w proporcji 2:1 (v:v) zawierającego 20 mM mrówczanu amonu.
  8. Z menu Chemstation Instrument (Instrument do podgrzewania) wybierz opcję Set Up Pump... (Konfiguracja pompy), a następnie wybierz przełącznik trybu Micro Flow.
  9. W polach Rozkład jazdy wprowadź: Czas 0.00, 100% B, Przepływ 1.0. Naciśnij Enter i utwórz drugi wiersz w Harmonogramie, wprowadzając Czas 10.0, 100% B, Przepływ 1.0. Wybierz przycisk OK u dołu menu Konfiguracja pompy. Te ustawienia umożliwią wykonanie 10 serii analitycznych przy natężeniu przepływu 1,0 μl na minutę.
  10. Wprowadzić eluat z linii przesyłowej HPLC do spektrometru mas za pomocą źródła jonizacji elektronrozpylającej wyposażonego w metalową igłę o niskim przepływie (34 G).
  11. Korzystając z oprogramowania sterującego instrumentem Thermo Tune Plus, wybierz menu Setup (Ustawienia) i wybierz Heated ESI Source (Podgrzewane źródło ESI). Ustaw napięcie jonizacji na 4000 V, a gaz osłonowy na 5 (dowolne jednostki), wpisując te wartości w odpowiednich polach okna dialogowego. Podobnie ustaw temperaturę kapilarną na 150 °C, a soczewkę S na 50%.
    UWAGA: Wartości te należy zoptymalizować dla każdej platformy spektrometrii mas.
  12. W przypadku nieukierunkowanej analizy lipidów jako detektora należy użyć platformy MS o wysokiej rozdzielczości/dokładnej masie MS (Tabela Materiałów).
  13. Korzystając z oprogramowania Thermo Tune Plus, kliknij przycisk Define Scan (Definiuj skanowanie), a następnie w menu Analyzer (Analizator) wybierz FTMS. W polu Zakres masy ustaw wartość Normalny, a następnie w polu Rozdzielczość wybierz wartość 100 000. Upewnij się, że opcja Scan Type (Typ skanowania) jest ustawiona na Full(Pełny). W menu Scan Ranges (Zakresy skanowania) wprowadź wartość 200 w polu First Mass (m/z) (Pierwsza masa (m/z), a w polu Ostatnia masa (m/z) wprowadź wartość 2000.
  14. Upewnij się, że ujemna polaryzacja jest wykorzystywana do wykrywania najobficiej występujących lipidów S. aureus.
  15. Powtórzyć analizę próbki, stosując tandemową spektrometrię mas z mapowaniem jonów (MS/MS), fragmentację wszystkich jonów lipidowych w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania w celu potwierdzenia struktur lipidowych i składników kwasów tłuszczowych. Alternatywnie, wybrane jony lipidowe będące przedmiotem zainteresowania można poddać analizie MS/MS po przypisaniu wstępnych identyfikacji lipidów w sekcji 8.

8. Przeszukiwanie bazy danych w celu identyfikacji endogennych S. aureus i egzogennych lipidów pochodzących z LDL

  1. Użyj oprogramowania Thermo Xcalibur, aby jeszcze bardziej udoskonalić dokładność obserwowanej masy. W Xcalibur, w menu Narzędzia, wybierz opcję Ponowna kalibracja offline. Po otwarciu okna Ponowna kalibracja offline załaduj plik widma masowego, który ma zostać ponownie skalibrowany, wybierając menu Plik i wybierając opcję Otwórz.
  2. Otwórz interesujący Cię plik, przełącz przycisk Wstaw wiersz w górnej części okna widoku, aby wyświetlić chromatogram jonów całkowitych dla przebiegu MS. Uśrednij uzyskane sygnały MS, klikając lewym przyciskiem myszy komputerowej na jednej krawędzi obserwowanego piku sygnału w chromatogramie jonów całkowitych i przeciągając myszą po najszerszej części piku.
  3. W menu Filtr skanowania wybierz filtr odpowiadający danym MS pełnego skanowania. Załadować plik referencyjny zawierający teoretyczne masy monoizotopowe co najmniej trzech znanych endogennych lipidów S. aureus, wybierając przycisk Załaduj ref... i wybierając plik referencyjny. Zaznacz pole Użyj obok każdej monoizotopowej masy lipidowej.
  4. Kliknij przycisk Szukaj u dołu okna wyświetlania. Ponownie uśrednić sygnał MS w poprzek piku sygnału na chromatogramie jonów całkowitych, tak jak zrobiono to wcześniej.
  5. Kliknij przycisk Konwertuj w dolnej części okna wyświetlania. Po otwarciu okna dialogowego Konwertuj kliknij przycisk OK. Pomiń ten krok, jeśli dane zostały zebrane na platformach spektrometrii mas od dostawców innych niż Thermo Scientific.
  6. Korzystając z oprogramowania Xcalibur, wyeksportuj ponownie skalibrowane, dokładne listy pików masowych dla każdej próbki niepoddanej działaniu LDL do oddzielnych arkuszy pliku Excel. Wybierz ikonę Qual Browser. Otwórz ponownie skalibrowany plik, który Cię interesuje, wybierając menu Plik i wybierając opcję Otwórz.
  7. Uśrednić sygnał przez szeroki pik na chromatogramie jonów całkowitych, jak opisano w kroku 8.2.
  8. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masowego i wybierz Widok | Lista widm. Z tego samego menu wybierz Opcje wyświetlania, a następnie pole przełączania Wszystkie szczyty w menu Wyświetlanie. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno podglądu.
  9. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę pinezki w oknie podglądu widma masowego i wybierz opcję Eksport | Schowek (dokładna masa). Wklej wyeksportowaną komórkę danych A1 pierwszego arkusza do nowego arkusza kalkulacyjnego programu Excel.
  10. Usuń pierwsze 8 wierszy tekstu w wyeksportowanym pliku danych, tak aby komórka A1 arkusza kalkulacyjnego programu Excel zawierała pierwszy punkt danych masowych ze spektrum mas. Powtórz eksportowanie każdego ponownie skalibrowanego pliku MS, używając nowego arkusza w pliku Excel dla każdej wyeksportowanej listy szczytów.
  11. Korzystając z oprogramowania do analizy spektralnej mas lipidów (LIMSA)37 Add-In for Excel, skonstruuj bazę danych zawierającą wzory molekularne znanych gatunków lipidów S. aureus zgodnie z opisem Hewelt-Belka et al. 201438, a także formuły reprezentujące gatunki lipidów, które hipotetycznie mogą być obecne w LDL.
    UWAGA: Ponadto należy zwrócić uwagę na włączenie do bazy danych potencjalnych wzorów molekularnych dla hipotetycznych lipidów bakteryjnych, które zawierają główne kwasy tłuszczowe LDL, takie jak kwasy tłuszczowe oleinowy (18:1) i linolowy (18:2)32.
  12. Aby skonstruować bazę danych, otwórz pusty arkusz kalkulacyjny programu Excel. W komórce A1 pierwszego arkusza wpisz teoretyczną/obliczoną masę monoizotopową gatunków lipidów, które mają zostać dodane do bazy danych, odpowiadającą masie gatunków lipidów w stanie jonowym zaobserwowanej w spektrometrze mas. W komórce B1 wprowadź nazwę gatunku lipidu, na przykład PG(34:0).
  13. W komórce C1 wprowadź wzór cząsteczkowy dla gatunku lipidów, odpowiadający stanowi jonowemu lipidu obserwowanemu w spektrometrze masowym. W komórce D1 wprowadź ładunek form lipidów obserwowany w spektrometrze mas. Przejdź do komórki A2, aby rozpocząć nowy wpis dla następnego gatunku lipidów, który ma zostać wprowadzony do bazy danych z możliwością wyszukiwania.
  14. Powtarzać kroki 8.12 i 8.13, aż wszystkie pożądane gatunki lipidów zostaną wprowadzone do bazy danych. Zapisz plik bazy danych i pozostaw go otwartym w programie Excel.
  15. W programie Excel wybierz menu Dodatki w. Wybierz LIMSA, aby uruchomić oprogramowanie LIMSA. W menu głównym kliknij przycisk Biblioteka złożona. W nowym oknie, które się pojawi, kliknij Importuj związki. Spowoduje to przesłanie złożonej bazy danych do użycia przez oprogramowanie LIMSA.
  16. Wykonuj dokładne identyfikacje lipidów na podstawie masy na wszystkich widmach MS za pomocą dodatku LIMSA do programu Excel zgodnie z instrukcjami dostawcy35. Z menu głównego LIMSA wybierz opcję Peak List (Lista szczytów) w menu Spectrum type (Typ widma). Wybierz tryb dodatni lub tryb ujemny, aby odpowiadać polaryzacji, w której uzyskano dane MS.
  17. W oknie Peak fwhm (m/z) wprowadź żądane okno wyszukiwania masowego w celu znalezienia szczytu. Okno wyszukiwania tolerancji masy 0,003-0,005 m/z jest zalecane dla danych masowych MS o wysokiej rozdzielczości.
  18. W oknie Czułość wprowadź żądaną linię odcięcia linii bazowej (na przykład 0,01% względnej obfitości). W menu Korekcja izotopów wybierz algorytmy dopasowania liniowego lub Odejmuj, z których każdy może być używany z danymi z listy pików.
  19. Zaznacz związki lipidowe, które mają zostać uwzględnione w wyszukiwaniu w bazie danych, klikając na żądane gatunki lipidów w oknie Dostępne związki. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać wyróżnione gatunki lipidów do grupy wyszukiwania.
  20. Zdefiniuj wzorce wewnętrzne, klikając na dodane związki, a następnie zmieniając okno Stężenie na odpowiednie stężenie wybranego wzorca wewnętrznego.
  21. Upewnij się, że wzorzec wewnętrzny i wybrane gatunki lipidów, które mają być oznaczone ilościowo, należą do tej samej nazwy klasy, wybierając każdy dodany gatunek lipidu i wzorzec wewnętrzny, a następnie wpisując nazwę klasy (np. PG lub Lipid) w polu Klasa.
  22. Aby zapisać przeszukiwalną grupę związków lipidowych do wykorzystania w przyszłości, kliknij przycisk Zapisz obok menu Grupy.
  23. Upewnij się, że plik Excel zawierający wszystkie wyeksportowane listy pików MS jest otwarty na arkuszu odpowiadającym pierwszemu przebiegowi MS S. aureus, a następnie kliknij przycisk Szukaj w menu głównym LIMSA.
    UWAGA: Dane wyjściowe wyszukiwania w bazie danych LIMSA będą zawierać listę cech widma mas dopasowanych do lipidów obecnych w bazie danych skonstruowanej w krokach 8.12-8.13, a także stężenia dla każdej dopasowanej cechy po normalizacji do jednego lub więcej wybranych wzorców wewnętrznych.
  24. Użyj oprogramowania Xcalibur do zbadania dokładnych widm masowych MS/MS dla m/z odpowiadających jonom lipidowym będącym przedmiotem zainteresowania w celu potwierdzenia składników kwasów tłuszczowych obecnych w każdym zidentyfikowanym gatunku molekularnym lipidów. Wybierz ikonę Qual Browser. Otwórz interesujący Cię plik MS/MS, wybierając menu rozwijane Plik i wybierając opcję Otwórz.
  25. Wybierz filtr skanowania odpowiadający analizie MS/MS interesującego nas lipidu m/z, klikając prawym przyciskiem myszy na ikonę pinezki w oknie podglądu widma mas i wybierz z menu Zakresy. W nowym oknie, które się pojawi, wybierz menu Filtr, aby wybrać skanowanie.
  26. Uśrednić sygnał z całego chromatogramu jonów zgodnie z opisem w kroku 8.2. Skorzystaj z oprogramowania MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) do wykonania odpowiednich testów statystycznych. Oceń statystycznie istotną różnicę w składzie lipidowym S. aureus, porównując znormalizowaną obfitość lipidów w stanach nieleczonych i leczonych LDL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wzbogacania LDL z żółtka jaja kurzego jest zilustrowany w Rysunek 1. Proces ten rozpoczyna się od rozcieńczenia całego żółtka jaja solą fizjologiczną i oddzielenia stałych części żółtka jaja, określanych jako granulki, od frakcji rozpuszczalnej lub osococza zawierającej LDL (Rysunek 1)33. Zawartość LDL we frakcji osocza jest dodatkowo wzbogacana przez wytrącanie β-żywych ~ 30-40 kDa (Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus włącza egzogenne kwasy tłuszczowe do swoich fosfolipidów błonowych 27,32,43. Synteza fosfolipidów przy użyciu egzogennych kwasów tłuszczowych omija hamowanie FASII, ale także zmienia właściwości biofizyczne błony 27,32,44. Chociaż włączenie egzogennych kwasów tłuszczowych do fosfolipidów patogenów Gram-dodatnich jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Hammera za ich krytyczną ocenę manuskryptu i wsparcie tej pracy. Dr Alex Horswill z University of Colorado School of Medicine uprzejmie dostarczył AH1263. Dr Chris Waters z laboratorium Michigan State University dostarczyło odczynniki. Prace te były wspierane przez grant American Heart Association 16SDG30170026 oraz fundusze na rozpoczęcie działalności zapewnione przez Michigan State University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan amonuFisherBP212R-1≥
Inkubator do hodowli komórkowychoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Płytka testowa CostarCorning378896 well
Bibuła filtracyjnaSchleicher & Schuell597
Duże jajo kurzeN/AN/APowszechnie kupione jajko
Spektrofotometr mikropłytkowyBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
Szczep S. aureus AH1263N/AN/ADostarczone przez Alexa Horswilla z University of Colorado
Rurki do dializyPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
kulki z tlenku cyrkonu 0,5 mmNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
Metanol (klasa LC-MS)FisherA4561
Chloroform (klasa odczynnika)FisherMCX10559
Isopropanol (klasa LC-MS)FisherA4611
Dimyristoyl fosfatydylocholinaAvanti Polar Lipids850345C-25mg
Wodorowęglan amonuSigma9830≥ Oprogramowanie
Sigma70221-25G-F
ThermoScientificOPTON-30801
Spektrometr masowy LTQ-Orbitrap VelosThermo Scientificwysoka rozdzielczość/dokładna masa MS
Agilent 1260 kapilarna HPLCAgilent
SpeedVac Koncentratory próżniThermo Scientific
czystości 99,5% Thermo Xcalibur o czystości 99,5%

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195(2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300(2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406(1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja LDLStaphylococcus aureusspektrometria masanaliza lipidomicznawytr canie siarczanem amonumembrana dializacyjnaanaliza z wtryskiem przep ywowym

Powiązane artykuły