Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Summary

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4⁺ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Abstract

Opisana jest prosta, in vitro, oparta na rozcieńczaniu barwnika metoda pomiaru proliferacji limfocytów T CD4⁺ specyficznych dla antygenu w komórkach jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej (PBMC). Opracowanie stabilnych, nietoksycznych, fluorescencyjnych barwników, takich jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), pozwala na odróżnienie rzadkich, specyficznych dla antygenu limfocytów T od osób postronnych poprzez zmniejszenie barwienia fluorescencyjnego, wykrytego za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta ma następujące zalety w porównaniu z alternatywnymi podejściami: (i) jest bardzo wrażliwa na limfocyty T o niskiej częstotliwości, (ii) nie jest wymagana wiedza na temat antygenu lub epitopu, (iii) można analizować fenotyp reagujących komórek oraz (iv) żywotne, reagujące komórki można sortować i wykorzystywać do dalszej analizy, takiej jak klonowanie limfocytów T.

Introduction

Zdolność do wykrywania i badania limfocytów T specyficznych dla antygenu jest ważna w badaniach nad odpornością komórkową. Jest to jednak szczególnie trudne w przypadku odpowiedzi limfocytów ^T CD4+ specyficznych dla autoantygenu, które są bardzo słabe i trudne do wykrycia. Powszechną metodą stosowaną do wykrywania proliferacji limfocytów specyficznych dla antygenu jest [3H]-tymidyna, która jest znakowanym radioaktywnie nukleotydem wbudowanym w DNA proliferujących komórek. Chociaż test [3H]-tymidyny może wykryć syntezę DNA, metoda ta jest pośrednią miarą podziału komórki, ponieważ synteza DNA może rozpocząć się niezależnie od mitozy (tj. podczas duplikacji genów i apoptozy¹). Problem ten potęguje fakt, że specyficzna dla antygenu proliferacja komórek może skutkować znaczną apoptozą², co prowadzi do potencjalnego przeszacowania proliferacji specyficznej dla antygenu. Ponadto metoda [3H]-tymidyna nie dostarcza informacji fenotypowych dla proliferujących limfocytów, takich jak proliferacja linii CD4 ⁺ lub CD8 ⁺ w PBMC stymulowanych peptydami antygenowymi.

W 2003 roku opublikowaliśmy pierwszy test rozcieńczania barwnika przy użyciu CFSE, zwany testem proliferacji opartym na CFSE^3,4. CFSE to barwnik fluorescencyjny, który stabilnie wiąże się z białkami wewnątrzkomórkowymi, tworząc wiązanie kowalencyjne z wewnątrzkomórkowymi resztami lizyny. Ponieważ białka znakowane CFSE są równo dzielone między komórki potomne³, komórki, które się podzieliły, można odróżnić od komórek niepodzielonych za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala również na ilościowe fenotypowanie populacji limfocytów. Rzeczywiście, liczba podziałów, jakie przeszła komórka od czasu barwienia CFSE, może być do pewnego stopnia zmierzona⁵. Niedawno opracowano wiele podobnych barwników, takich jak barwnik proliferacyjny CellTrace Violet (VPD) i barwnik CytoTrack, które działają w podobny sposób⁶. Protokół ten koncentruje się na CFSE, ale zasady mają zastosowanie w równym stopniu do innych powiązanych barwników.

Barwienie tetramerem peptydowo-MHC jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania i klonowania limfocytów T CD8⁺ specyficznych dla antygenu. Jest to sprawdzona metoda^7,8,9,10; jednak klonowanie oparte na tetramerach wymaga istniejącej wiedzy na temat ograniczenia epitopu/MHC, a każdy epitop wymaga własnej klasy tetramer11, co ogranicza zakres odkrywania i klonowania nowych limfocytów T specyficznych dla epitopów. Proliferacja oparta na CFSE może być stosowana z peptydami, białkami lub lizatami komórkowymi. Opisany tutaj protokół jest zarówno prosty, jak i solidny, a odpowiadające limfocyty T CD4 ⁺ można sortować do wykorzystania w dalszych testach charakterystyki funkcjonalnej i biochemicznej^12,13.

Protocol

Wszyscy badani wyrazili świadomą zgodę przed pobraniem krwi obwodowej. Etyczna aprobata dla eksperymentów z użyciem PBMC została wydana przez St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08 i HREC-A 161/15).

1. Przygotowanie odczynnika

1. Pożywka dla ludzkich limfocytów T
   1. Przygotuj pożywkę RP-5 do hodowli PBMC, która składa się z RPMI 1640, 1x aminokwasów endogennych, dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (2 mM), penicyliny (100 U/ml)/streptomycyny (0,1 mg/ml) i 5% puli ludzkiej surowicy (PHS).
2. Roztwory podstawowe CFSE
   1. Przygotować główny zapas, rozpuszczając 25 mg CFSE w ~9 ml DMSO, aby uzyskać końcowy roztwór podstawowy o stężeniu 5 mM.
   2. Przygotować materiał roboczy, rozcieńczając go w PBS do uzyskania stężenia roboczego 10 μM.

2. Przygotowanie ludzkich PBMC z krwi pełnej

1. Na ogół jest to od 0,5 do 1,5 x 10⁶ PBMC / ml ludzkiej krwi obwodowej. Dlatego wymagana ilość krwi zależy od pożądanej liczby PBMC. Rozcieńczyć ludzką krew obwodową PBS w stosunku co najmniej 1:2. Oddziel PBMC, dodając 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki o pojemności 50 ml, a następnie nałóż 35 ml rozcieńczonej krwi pełnej.
2. Wirować przy 850 x g przez 15 minut bez zwalniania w temperaturze pokojowej (RT). W ten sposób powstaną trzy przezroczyste warstwy: dolna warstwa zawierająca osad czerwonych krwinek, środkowa warstwa pożywki o gradiencie gęstości z białymi krwinkami wyściełającymi jej górny interfejs oraz górna warstwa plazmy¹⁴.
3. Usunąć około 20 ml wierzchniej warstwy osocza. Zebrać warstwę białych krwinek, uważając, aby uniknąć czerwonych krwinek osadu. Przemyć 3x PBS i policzyć żywotne komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze. Rozcieńczyć do 1 x 10⁶ PBMCs/ml w PBS.
4. Komórki niebarwione CFSE
   1. Komórki te są używane jako kontrole kompensacyjne cytometrii przepływowej, składającej się z niebarwionych i pojedynczo barwionych komórek CD4⁺. Dodać 300 μl każdej zawiesiny PBMC próbki kontrolnej do probówki o pojemności 10 ml, przykryć PBS i odwirować przy 550 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy.
   2. Ponownie zawiesić 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce RP-5. Inkubować te nieznakowane komórki przez 7 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ z komórkami znakowanymi CFSE (krok 2.6.1).
5. Komórki barwione CFSE
   1. Przenieś komórki z kroku 2.3 do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 1,0 μl roboczego roztworu podstawowego CFSE (10 μM) na 1 ml zawiesiny komórek z boku probówki. Szybko wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Końcowe stężenie CFSE wynosi 10 nM.
   2. Inkubować przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO_{2 .} Aby zatrzymać barwienie, dodaj 5 ml pożywki RP-5, osadzaj komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 550 x g. Ponownie zawiesić PBMC w 1 x 10⁶/ml w pożywce RP-5.
   3. Dodać 1,0 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 10 ml. Do każdego testowanego antygenu należy użyć jednej probówki.
6. Stymulacja antygenowa ludzkich PBMC i hodowli komórkowych
   1. Hodowla ludzkich PBMC znakowanych CFSE z antygenami w pożywce RP-5 przez 7 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Hodowla 1 x 10⁵ komórek/basenik (100 μl) na 96-dołkowej płytce ze 100 μl/basenik pożywki RP-5 zawierającej rozcieńczony antygen.
      UWAGA: Zastosowane antygeny, w tym stężenia robocze, podsumowano w Tabeli 1.

3. Barwienie anty-CD4 do analizy FACS

1. Odpipetować 200 μl hodowanych komórek do probówek FACS, przepłukać komórki 1x w 1,0 ml PBS zawierającego 0,1% FCS i odwirować przez 5 minut przy 550 x g.
2. Barwienie anty-ludzkim CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 μg/ml) w 100 μl PBS/0,1% FCS. Trzymaj na boku próbkę komórek znakowanych CFSE, niebarwionych żadnymi innymi fluoroforami, do użycia do ustawienia kompensacji FACS CFSE. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem przez 20 minut.
3. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS/0,1% FCS, odwirować przy 550 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 100 μl PBS/0,1% FCS. Bezpośrednio przed analizą FACS dodać 1 μl jodku propidyny (PI, 0,1 mg/ml) do wszystkich probówek, aby umożliwić wykluczenie martwych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Konfiguracja cytometrii przepływowej i strategia bramkowania

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje konfigurację FACS, w tym kontrolę kompensacji i strategię bramkowania.

1. Bramka populacji rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszonego bocznego (SSC) (Rysunek 1A) w celu uwzględnienia wszystkich limfocytów.
2. Bramka populacji FSC vs. PI (Rysunek 1B) na komórkach ujemnych PI, aby wykluczyć komórki apoptotyczne.
3. Użyj niebarwionych komórek, aby ustawić linię bazową napięcia dla ogniw niefluorescencyjnych. Ustaw napięcia dla CD4-A647 i CFSE tak, aby sygnał fluorescencji był poniżej 1,000 dla każdego (Rysunek 1C). Użyj pojedynczych kontrolek kolorów CFSE (Rysunek 1D) i CD4-A647 (Rysunek 1E), aby potwierdzić dodatnie sygnały fluorescencyjne (~10 000) dla każdego koloru, używając napięć ustawionych dla niebarwionych komórek.
4. CFSE i PI mają pewne nakładanie się widmowe; dostosuj kompensację, aby odjąć fluorescencję PI od fluorescencji CFSE, aż próbka tylko CFSE nie da sygnału w kanale PI.
   nuta: Bramki te zastosowano do wszystkich analizowanych w niniejszym dokumencie próbek.

5. Obliczanie wskaźnika podziału komórek w celu wyliczenia specyficznej dla antygenu proliferacji limfocytów T CD4⁺

UWAGA: Indeks podziału komórki (CDI) odnosi się do liczby podzielonych komórek (^CD4+/CFSE dim) na 5 000 niepodzielonych komórek (CD4⁺/ CFSE^bright). Gdy liczba niepodzielonych komórek CD4 ⁺ nie wynosi dokładnie 5,000, liczba podzielonych komórek jest korygowana, aby wyrazić liczbę podzielonych komórek na 5,000 niepodzielonych komórek. Na przykład, używając proliferacji specyficznej dla toksoidu tężcowego (Rysunek 2D), było 4 930 niepodzielonych komórek (^{CFSE jasne}) i 3 268 podzielonych komórek (^{CFSE dim}); Dlatego skorygowana liczba podzielonych komórek wynosi (5 000/4 930) x 3 268 = 3 304,3.

1. Obliczyć CDI (Tabela 1), dzieląc liczbę podzielonych komórek/5 000 niepodzielonych komórek z grupy stymulowanej antygenem przez średnią liczbę podzielonych komórek (na 5 000 niepodzielonych komórek) z komórek hodowanych bez antygenu (Tabela 2).

Results

Stymulacja in vitro ludzkich PBMC białkiem toksoidu tężcowego: PBMC były barwione CFSE i stymulowane przez 7 dni w obecności toksoidu tężcowego. Prawie wszyscy dawcy wykazywali silną odpowiedź limfocytów T na toksoid tężcowy, ponieważ zostali zaszczepieni, co sprawia, że toksoid tężcowy jest użytecznym antygenem kontroli pozytywnej. Rysunek 2 pokazuje w trzech egzemplarzach, że proliferacja komórek T CD4⁺ w CFSE z niestymulowanych PBMC była minimal...

Discussion

Proliferacja oparta na CFSE jest prostą i solidną metodą wykrywania i zliczania ludzkich limfocytów T CD4 ⁺ specyficznych dla antygenu. Wcześniej wykazano, że stosowanie optymalnego stężenia CFSE jest niezbędne do uzyskania optymalnych wyników⁴. Zbyt duża ilość CFSE hamuje proliferację, podczas gdy zbyt mała nie pozwala na rozróżnienie komórek podzielonych i niepodzielonych. Natomiast stosunkowo wysokie stężenia (5,0 μM) CFSE są używane do znakowania oczyszczonych mysich limfocytów T

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anty-ludzki CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Karboksyfluoresceina succinimidylo ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Grypa A H1N1 (PR8) Białko macierzy 1	Sino Biologiczne	40010- V07E Aminokwasy
endogenne (1x)	Gibco	11140
Penicylina/Streptomycyna (1x)	Gibco	15070063
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Zbiorcza surowica ludzka	Australijski Czerwony Krzyż	N/A
Proinsulina C-peptyd PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom wykonany syntetyczny peptyd
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Białko toksoidu tężcowego	Statens Serum Intitut	N/A