Artykuł metodologiczny

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

DOI:

10.3791/59549

⸱

2 maja 2019

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces siRNA jako celowanego leku molekularnego zależy od jego efektywnego cytozolowego dostarczania do komórek w tkance patologicznej. Osiągnięto sukces kliniczny w leczeniu siRNA wcześniej "nieuleczalnych" celów choroby wątroby. Jednak skuteczne dostarczanie siRNA do guza wymaga dodatkowych rozważań farmakokinetycznych dotyczących projektowania, w tym długiego czasu krążenia, unikania klirensu narządów (np. wątroby i nerek) oraz penetracji i zatrzymywania guza. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i fizykochemiczną/biologiczną charakterystykę in vitro nanocząstek polimerowych przeznaczonych do efektywnego dostarczania siRNA, szczególnie do tkanek niewątrobowych, takich jak nowotwory. Nanocząstki siRNA są otrzymywane przez elektrostatyczne kompleksowanie siRNA i kopolimeru diblokowego poli(glikol etylenowy-b-[2-(dimetyloamino)metakrylan etylu-ko-butyl metakrylan]) (PEG-DB) w celu utworzenia kompleksów polijonowych (polipleksów), w których siRNA jest sekwestrowane w rdzeniu polipleksu, a PEG tworzy hydrofilową, neutralnie naładowaną koronę. Co więcej, blok DB staje się błonowo-lityczny, gdy pęcherzyki szlaku endolizosomalnego zakwaszają się (< pH 6,8), wywołując ucieczkę endosomalną i cytozolowe dostarczanie siRNA. Opisano metody charakterystyki fizykochemicznej nanocząstek siRNA, takie jak wielkość, ładunek powierzchniowy, morfologia cząstek i obciążenie siRNA. Bioaktywność nanocząstek siRNA mierzy się przy użyciu lucyferazy jako genu modelowego w szybkim i wysokoprzepustowym teście wyciszania genów. Projekty, które przejdą te wstępne testy (takie jak polipleksy na bazie PEG-DB) są uważane za odpowiednie do przełożenia do przedklinicznych badań na zwierzętach oceniających dostarczanie siRNA do guzów lub innych miejsc patologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ siRNA hamują translację białek z sekwencji mRNA, teoretycznie mogą być używane do leczenia wszystkich znanych patologii1,2,3,4,5. Zastosowanie siRNA w medycynie jest jednak ograniczone przez całkowicie słaby profil farmakokinetyczny cząsteczek siRNA6,7. Po wstrzyknięciu dożylnym siRNA są szybko usuwane przez nerki i/lub degradowane przez nukleazy8,9. Ze względu na duży rozmiar i ładunek ujemny, siRNA nie może dostać się do komórek ani uciec ze szlaku endolizosomalnego, aby uzyskać dostęp do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC), który znajduje się w cytozolu10,11,12,13. W związku z tym szeroko zakrojone wysiłki skupiły się na projektowaniu i wdrażaniu strategii dostarczania siRNA14. Wysiłki te w dużej mierze skupiły się na opracowaniu nanocząstek na bazie lipidów i polimerów, które pakują siRNA, chronią je przed klirensem i degradacją in vivo oraz inicjują wychwyt komórkowy i ucieczkę endosomalną przez jonizowalne kationowe grupy aminowe. Odnotowano wiele sukcesów przedklinicznych, a ostatnio odnotowano pierwszy sukces kliniczny dotyczący dostarczania wątrobowego siRNA na bazie nanocząsteczek w leczeniu dziedzicznej amyloidozy za pośrednictwem transtyretyny (hATTR)15.

Istnieje wiele genów powodujących raka, które są obecnie "nieuleczalne" przez konwencjonalną farmakologię (np. leki małocząsteczkowe), co motywuje do projektowania polimerowych nanocząsteczek siRNA (si-NPs) do leczenia raka16. Istnieje jednak osobny zestaw parametrów projektowych, które należy wziąć pod uwagę w przypadku dostarczania siRNA bez wątroby. System dostarczania musi osłaniać ładunek kationowy polipleksu, który powoduje aglutynację w krążeniu ogólnoustrojowym17,18,19. W szczególności w przypadku dostarczania guza, stabilność si-NP jest niezbędna do zapewnienia długiego krążenia, a tym samym zwiększonej akumulacji w guzach dzięki efektowi zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)20,21. Co więcej, kontrola nad rozmiarem si-NP jest niezbędna, ponieważ tylko nanocząstki o średnicy około 20 – 200 nm wykorzystują EPR22, a mniejsze si-NP (~20 – 50 nm średnicy) wykazują lepszą penetrację guza w porównaniu z większymi nanocząstkami i mikrocząstkami23.

Aby rozwiązać te dodatkowe ograniczenia projektowe dotyczące systemowego dostarczania siRNA do guza po podaniu dożylnym, opracowano neutralnie naładowane, reagujące na pH si-NP (Rysunek 1)24. Te si-NP są PEGylowane, lub ostatnio Zwitterionated25, dla neutralnego ładunku powierzchniowego i odporności na adsorpcję i opsonizację białek w obiegu. Ponieważ nie mogą polegać wyłącznie na charakterze kationowym w celu napędzania dostarczania wewnątrzkomórkowego, niezwykle skuteczna ucieczka endosomalna jest niezbędna do osiągnięcia silnego wyciszenia genów. W związku z tym rdzeń tych si-NP składa się z wysoce endosomolitycznego rdzenia, który jest obojętny przy pH zewnątrzkomórkowym (7,4), ale jest wyzwalany w sposób podobny do przełącznika w zakwaszonych warunkach szlaku endolizosomalnego [pH 6,8 (wczesne endosomy) – 5,0 (lizosomy)]. Wreszcie, mieszanina kationów i hydrofobowości w rdzeniu si-NP zapewnia zarówno siły elektrostatyczne, jak i stabilizacyjne van der Waalsa, poprawiając stabilność si-NP we krwi w porównaniu z układami czysto kationowymi.

Integracja wielu funkcji w stosunkowo prostym projekcie jest możliwa dzięki kontrolowanej polimeryzacji z odwracalnym transferem łańcucha dodawania i fragmentacji (RAFT) do produkcji polimerów o złożonej architekturze i precyzyjnym składzie. Aby wytworzyć si-NP o neutralnym ładunku powierzchniowym, reakcji pH i stabilności NP, RAFT stosuje się do syntezy poli(metakrylanu glikolu etylenowego-b-[2-(dimetyloamino)etylometakrylanu-ko-butylu]) (PEG-DB; Rysunek 1A). PEG-DB jest elektrostatycznie skompleksowany z siRNA, tworząc si-NP z koroną PEG i rdzeniem DB/siRNA (Rysunek 1B). PEG tworzy obojętną, neutralnie naładowaną warstwę hydrofilową na koronie si-NP. Blok DB składa się ze stosunku molowego 2-(dimetyloamino)etylu metakrylanu (DMAEMA) i metakrylanu butylu (BMA) w stosunku 50:50. Kationowe DMAEMA elektrostatycznie kompleksuje ujemnie naładowane siRNA. BMA samoasocjuje się w rdzeniu NP poprzez oddziaływania van der Waalsa, zwiększając stabilność NP. Razem, DMAEMA i BMA nadają zależnemu od pH dwuwarstwowe zachowanie lityczne lipidów blokowi polimerowemu DB. Przy zewnątrzkomórkowym pH blok DB jest sekwestrowany do rdzenia si-NP i jest obojętny na dwuwarstwy lipidowe. W warunkach kwaśnych, takich jak te w obrębie szlaku endolizosomalnego, jonizowalny DMAEMA w bloku DB ułatwia efekt gąbki protonowej, gdzie buforowanie endosomalne prowadzi do obrzęku osmotycznego i pęknięcia26. Dodatkowo, hydrofobowe ugrupowania BMA w bloku DB aktywnie integrują się z dwuwarstwami lipidowymi i lizują je, co powoduje silną endosomolizę. W ten sposób siRNA jest skompleksowane z PEG-DB w celu wytworzenia si-NP, które są neutralnie naładowane i wysoce stabilne przy pH zewnątrzkomórkowym, ale które rozbijają dwuwarstwy lipidowe przy kwaśnym pH, zapewniając cytozolowe dostarczanie ładunku siRNA.

Tutaj opisane są eksperymentalne procedury produkcji si-NPs z PEG-DB. Przedstawiono i omówiono metody charakterystyki parametrów fizykochemicznych i bioaktywności si-NP. W celu szybkiej oceny bioaktywności si-NP lucyferazy stosuje się jako gen modelowy do badań knockdown. Lucyferazy świetlików to białko odpowiedzialne za "poświatę" świetlików27. W związku z tym komórki ssaków transfekowane genem lucyferazy świetlików wytwarzają bioluminescencyjną "poświatę", którą można uchwycić za pomocą luminometru w celu ilościowego określenia poziomów ekspresji lucyferazy. Tutaj używamy lucyferazy do oceny bioaktywności si-NP poprzez dostarczanie siRNA przeciwko lucyferazy i ilościowe określenie odpowiedniego zmniejszenia bioluminescencji w komórkach eksprymujących lucyferazy w porównaniu z komórkami, które otrzymują zaszyfrowane siRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i charakterystyka si-NPs

  1. Preparat si-NP
    1. Rozpuścić polimer w 10 mM buforze kwasu cytrynowego (pH 4,0) w stężeniu 3,33 mg/ml. Polimer można najpierw rozpuścić w etanolu o 10-krotnym stężeniu, aby zapewnić rozpuszczenie.
      UWAGA: Polimer można rozpuścić w niższych stężeniach, ale stosowanie w stężeniach powyżej 3,33 mg/ml może zapobiec tworzeniu się jednorodnego NP.
    2. Dodaj siRNA (50 μM w diH2O), aby uzyskać stosunek N+:P- 10. Dokładnie wymieszać roztwory polimerów i siRNA za pomocą pipetowania i pozostawić do inkubacji na 30 minut. Stosunek N+:P- reprezentuje liczbę dodatnio naładowanych grup aminowych na polimerze do liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych na siRNA i oblicza się go według poniższego wzoru:
      figure-protocol-1
      gdzie mol Pol to molowa ilość polimeru, amina RU to liczba powtarzających się jednostek dodatnio naładowanych amin na polimer, mol siRNA to molowa ilość siRNA, a bp siRNA to liczba par zasad na cząsteczkę siRNA.
    3. Dodać 5-krotny nadmiar 10 mM buforu fosforanowego (pH 8,0) i delikatnie wymieszać, pipetując lub odwracając probówkę. Aby potwierdzić, że końcowe pH jest neutralne (~7,2-7,5), odpipetuj 10 μl roztworu si-NP na paski testowe pH.
      UWAGA: kwasu cytrynowego i fosforanu są przygotowywane zgodnie z wykresami centrum referencyjnego Millipore Sigma.
  2. Charakterystyka fizykochemiczna si-NP
  3. Zapisać rozmiar i ładunek powierzchniowy powstałych si-NP za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Przygotować próbkę DLS, filtrując 1 ml si-NPs (0,1 – 1,0 mg/ml) przez filtry strzykawkowe o wielkości porów 0,45 μm do kwadratowej kuwety kwarcowej lub polistyrenowej. Rejestruj pomiary wielkości i ładunku powierzchniowego za pomocą przyrządu DLS zgodnie ze specyfikacją producenta.
    1. Potwierdź wielkość i morfologię si-NP poprzez analizę obrazową za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
      1. Dodać 5 μl roztworu si-NP o stężeniu 1 mg/ml do siatek TEM i inkubować przez 60 s. Osuszyć na sucho przez 3 s.
      2. Dodać 5 μl 3% roztworu octanu uranylu i inkubować przez 20 s. Osuszać na sucho przez 3 s. Suszyć kratki przez noc pod wysuszeniem.
      3. Siatki obrazu zgodnie z protokołem ustalonym dla konkretnego mikroskopu, który ma być używany.
    2. Scharakteryzuj obciążenie siRNA w si-NP w różnych proporcjach N+:P- za pomocą opóźnienia żelu agarozowego.
      1. Aby wyprodukować 2% żel agarozowy, dodaj 2 g proszku agarozy klasy elektroforetycznej do 100 ml 1x buforu TAE (Tris-acetate-EDTA) o pH 8,0. Wymieszaj, aby zawiesić agarozę. Podgrzewaj bez przykrycia w kuchence mikrofalowej, aż cała agaroza się rozpuszczą (1-3 min).
      2. Po schłodzeniu dodać 5 μl bromku etydyny (10 mg/ml w H2O) i dobrze wymieszać. Wlej agarozę do tacki na żel i umieść grzebień, aby uzyskać dołki, pozostawiając do wyschnięcia na 30 minut. Ostrożnie wyjmij grzebień, aby pozostawić studzienki załadowcze i napełnij tackę na żel do linii maksymalnego napełnienia buforem 1x TAE.
      3. Wygeneruj si-NP (zgodnie z powyższą procedurą) w proporcjach 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 i 40 N+:P-. Umieścić 2 μl podwielokrotności barwnika ładującego (bez SDS i środków redukujących) na folii parafinowej dla każdego preparatu si-NP. Wymieszać pipetą 10 μl roztworu si-NP z barwnikiem nasadowym na folię parafinową.
      4. Dodaj si-NP/roztwory barwników ładujących do studzienek żelu agarozowego. Uruchomić źródło napięcia pod napięciem 100 V przez 35 minut (lub do momentu, gdy próbki przejdą 80% długości żelu).
      5. Wizualizacja pasm siRNA na transiluminatorze UV zgodnie ze specyfikacją producenta.

2. Określanie in vitro bioaktywności si-NPs

  1. Knockdown modelowej genu lucyferazy
    1. Wygeneruj lucyferazy si-NP (zgodnie z powyższą procedurą) za pomocą lucyferazy siRNA i zakodowanych si-NP przy użyciu zakodowanej sekwencji siRNA jako kontroli. Uformuj oba si-NP w tym samym końcowym stosunku N+:P- i w optymalnym stosunku określonym w badaniach opóźnienia żelu agarozowego. Przykładowe sekwencje siRNA znajdują się w Tabeli Materiałów.
    2. Nasiona komórek eksprymujących lucyferazy [stabilne komórki MDA-MB-231 / Lucyferazy (Bsd)] w 96-dołkowych płytkach o czarnych ściankach o gęstości 2,000 komórek na dołek. Pozostawić na noc do przylegania w pełnych pożywkach (DMEM, 10% FBS) w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
    3. Rozcieńczyć si-NP w pełnej pożywce surowicy do końcowej objętości 100 μl na studzienkę i stężenia siRNA 100 nM. Traktuj komórki przez 24 godziny si-NPs.
    4. Po 24 godzinach usuń leczenie i zastąp pożywkę pełną pożywką surowicy zawierającą 150 μg/ml D-lucyferyny. Inkubować komórki przez 5 minut przed pomiarem luminescencji na czytniku płytek lub systemie obrazowania optycznego in vivo zgodnie ze specyfikacją producenta.
    5. Zastąp pożywkę zawierającą lucyferynę świeżą, pełną pożywką surowicy i inkubuj jeszcze 24 godziny. Powtórz powyższy krok, usuwając pożywkę i zastępując ją pełną pożywką surowicy zawierającą 150 μg/ml D-lucyferyny, a następnie 5-minutową inkubację przed pomiarem luminescencji w punkcie czasowym 48 godzin.
    6. W przypadku badań podłużnych utrzymuj komórki w sterylnych warunkach podczas pomiaru luminescencji. Kontynuuj hodowlę w świeżych, pełnych pożywkach między pomiarami po wymianie lucyferyny zawierającej lucyferynę.
      UWAGA: Odpowiednie stężenie siRNA będzie się różnić w zależności od różnych cząsteczek si-NP i siRNA. W przypadku stosowania neutralnie naładowanych polipleksów z rdzeniem endosomolitycznym (np. PEG-DB), 100 nM jest zwykle dobrze tolerowane przez komórki i powoduje >75% knockdown lucyferazy. Stosunek masowy PEG-DB do siRNA przy stosunku 10 N+:P- i 100 nM siRNA (przy założeniu 26 pz siRNA) wynosi 23,3, tj. dodać 23,3 ng PEG-DB na każde 1,0 ng siRNA. Na przykład dodaj 1,16 μl polimeru 3,33 mg / ml na 166,5 ng siRNA, aby potraktować jeden dołek przy 100 nM na 96-dołkowej płytce (100 ml objętości pożywki na basenik).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre podstawowe cechy skutecznych si-NP do dostarczania siRNA in vivo to odpowiedni rozmiar (~20 – 200 nm średnicy), opakowanie siRNA i bioaktywność wyciszania genów. Chociaż nie jest to wyczerpująca lista (omówiona w dyskusji), te podstawowe cechy powinny zostać potwierdzone przed rozważeniem dalszych badań preparatu.

Rysunek 2 ilustruje charakterystykę wielkości si-NP i ładunku powierzchnioweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj si-NP powstają w wyniku elektrostatycznego asocjacji anionowego siRNA i polimerów kationowych w kompleksy polijonowe (polipleksy). Kompleksowanie elektrostatyczne siRNA i kationowego bloku DB polimerów PEG-DB jest ułatwione przez mieszanie przy niskim pH (4,0). Przy pH 4,0 DMAEMA jest silnie protonowana, w wyniku czego blok DB jest silnie naładowany. Gwarantuje to, że polimery rozpuszczają się jako unimery w roztworze, a nie tworzą miceli, a DB skutecznie kompleksuje się z siRNA. Następnie pH roztworu dosto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni doktorom Craigowi Duvallowi i Rebecce Cook za dostęp do danych i zasobów laboratoryjnych do przeprowadzenia tych badań. Autorzy są wdzięczni Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) za dostęp do instrumentów DLS i TEM (NSF EPS 1004083). Autorzy są wdzięczni Narodowej Fundacji Nauki za wsparcie programu stypendialnego Graduate Research Fellowship Program (NSF#1445197). Autorzy są wdzięczni National Institutes of Health za wsparcie finansowe (NIH R01 EB019409). Autorzy są wdzięczni Programowi Badań Medycznych Kierowanych przez Kongres Departamentu Obrony za wsparcie finansowe (DOD CDMRP OR130302).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m Filtry strzykawkowe o wielkości porówThermo Fisher ScientificF25133Średnica 17 mm, membrana PTFE
0-14 Paski testowe pHMillipore SigmaP4786
10x bufor TAEThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7,7Millipore SigmaP3536
96-dołkowe płytki o czarnych ściankachCorning3603Agaroza w proszku poddana hodowli tkankowej
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Kwas cytrynowy jednowodnyMillipore SigmaC1909
dwuzasadowy fosforan sodu dwuwodnyMillipore Sigma71643
D-lucyferynaThermo Fisher Scientific88294Sól monopotasowa
DMEMGibco11995065Wysoka zawartość glukozy i pirogronianu
EtanolMillipore Sigma459836
bromek etydynyThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
barwnik ładującyThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Lucyferazy siRNAIDTNie dotyczySekwencja nici antysensownej: GAGGAGUUCAUUUUUCAGUGC
AAUUGUU
Sekwencja nici Sense: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *Zasady DNA
MDA-MB-231 / Stabilne komórki lucyferazy (Bsd)GenTarget IncSC059-BsdKomórki eksprymujące lucyferazy pozwane do oceny bioaktywności si-NP
monozasadowy monohydrat fosforanu soduMillipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/ Sekwencjanici antysensownej: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA podstawy
kwadratowe kuwety z polistyrenuFisher Scientific14-955-129o pojemności 4,5 ml
Ted Pella, Inc.1GC50 PELCOSiatki oznaczone centralnie, 50 oczek, 3,0 mm OD, dwuwodny
cytrynian trisodowyMillipore SigmaS1804
octan uranyluPolysciences, Inc.21447-25
Paski testowe pH Siatka TEM miedzi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
  3. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
  4. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244(2002).
  5. Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
  6. Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543(2015).
  7. Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
  8. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
  9. Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
  10. Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
  11. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638(2013).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
  14. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  15. Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
  16. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502(2017).
  17. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
  18. Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
  19. Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
  20. Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20(2016).
  21. Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
  22. Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347(2003).
  23. Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
  24. Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
  25. Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
  26. Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
  27. de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  28. Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
  29. Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249(2007).
  30. Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
  31. Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
  32. Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
  33. Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
  34. Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21(2018).
  35. Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166(2013).
  36. Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
  37. Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
  38. Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamiczne Rozpraszanie wiat aTransmisyjna Mikroskopia ElektronowaRetardacja na elu AgarozowymUcieczka z Endosom wPolimer pH responsywnyDostarczanie do CytozoluTest Wyciszania Gen w

Powiązane artykuły