Tutaj prezentujemy protokół pobierania próbek krwi z żyły podobojczykowej myszy.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie krwi przez nakłucie żyły podobojczykowej u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysz jest najważniejszym modelem ssaków do badania ludzkich chorób i ludzkiego zdrowia. Jednak pobieranie próbek krwi od myszy jest wyzwaniem w pracach badawczych. Pobieranie krwi z ogona jest popularną metodą, gdy potrzebna jest niewielka ilość próbki krwi. Tętnica oczodołowa może być brana pod uwagę, jeśli potrzebna jest duża ilość krwi, ale ta metoda pobierania krwi wiąże się z problemami etycznymi. Dawniej wykazaliśmy wykonalność i bezpieczeństwo pobierania próbek krwi poprzez nakłucie żyły podobojczykowej u szczurów, a tutaj badamy, czy tę metodę można zastosować u myszy. Donosimy, że ta metoda jest bezpieczna i praktyczna w pobieraniu krwi u myszy. Pobieranie krwi przez nakłucie żyły podobojczykowej u myszy może być wygodną metodą w codziennych pracach badawczych.
Wprowadzenie
Pobieranie próbek krwi od myszy jest niezbędne w większości laboratoriów badawczych. Konwencjonalne metody pobierania krwi u myszy polegają na obcinaniu ogona, gdy potrzeba mniej niż 100 μl próbki1. Jednakże, jeśli wymagane jest więcej niż 100 μl krwi w nieterminalnym punkcie czasowym, najczęściej rozważanymi technikami są krwawienie zaoczodołowe, podżuchwowe lub podskórne pobieranie krwi2. W niektórych przypadkach cewnikowanie żyły szyjnej przez nacięcie chirurgiczne było stosowane jako metoda alternatywna3.
Mimo to, powyższe metody są szkodliwe dla myszy. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, metoda retroorbitalna nie jest powszechnie akceptowana ze względu na potencjalne ryzyko powikłań4,5. Uraz związany z operacją ma miejsce nie tylko w obszarze widzialnym6,7, ale także głęboko w orbicie6. Poza tym pobieranie krwi podżuchwowej jest stresujące8 i może wiązać się z nadmiernym krwawieniem2,9. Opierając się na naszych wcześniejszych badaniach10,11, przedstawiamy nową strategię pobierania krwi z żyły podobojczykowej u myszy. Przedstawiono i omówiono bezpieczeństwo, wykonalność i uzyskaną objętość krwi za pomocą tej techniki.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Centralnego Południowego ds. Badań na Zwierzętach z Drugiego Szpitala Xiangya (Changsha, Chiny). Manuskrypt został przygotowany zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)12.
1. Materiał i zwierzę
- Przygotuj wymagane materiały: 75% etanol, taśmę klejącą, środek do depilacji, tubkę 2 ml, strzykawkę 1,0 ml połączoną z igłą (26G), wagę elektroniczną, heparynę i sól fizjologiczną (patrz tabela materiałów).
- Zwierzęta: Przygotuj 10 myszy Kunming w wieku 6-8 tygodni i o wadze 21,6-28,3 g (patrz tabela materiałów). Utrzymuj myszy zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych13.
2. Znieczulenie i ułożenie zwierząt
- Zważ mysz, aby obliczyć wymaganą dawkę środka znieczulającego.
- Wstrzyknąć pentobarbital sodu (60 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe w celu wywołania znieczulenia ogólnego14 (Rysunek 1). Na początku zabiegu nałóż sterylną maść nawilżającą oczy, aby zapobiec uszkodzeniu odsłoniętych oczu.
UWAGA: Myszy uważa się za wystarczająco znieczulone, gdy nie wykazują reakcji motorycznej na testy odruchu wycofania pedału, uszczypnięcia ogona lub uszczypnięcia skóry brzucha. - Umieść mysz na stole operacyjnym w pozycji leżącej na plecach i w odległości 2-4 cm od krawędzi stołu, aby ułatwić nakłucie żyły (Rysunek 2). Ustaw kończyny w wygodnej pozycji, jak pokazano na Rysunek 2. W całym zabiegu nie jest wymagana intubacja ani wentylacja mechaniczna.
- Nałóż środek do depilacji wokół przestrzeni podobojczykowej za pomocą bawełnianego wacika.
- Trzy minuty później umyj środek do depilacji wilgotnym wacikiem, aby usunąć sierść i wszelkie widoczne zabrudzenia.
- Wysterylizuj przestrzeń podobojczykową 75% etanolem, a następnie osusz czystą gazą.
3. Nakłucie żyły podobojczykowej i pobranie krwi
- Zidentyfikuj palcem położenie kości obojczyka i górnego dołu mostka.
- Zlokalizuj miejsce nakłucia blisko środka kości obojczyka i ogonowo do niego. Przyłóż lewy palec wskazujący bokiem do miejsca nakłucia, aby przymocować skórę i tkankę podskórną (Ryc. 3).
- Przesuń igłę w górę i czaszkowo w kierunku górnego dołu mostka. Gdy igła wejdzie w tkankę podskórną, przesuń palec serdeczny prawej ręki do tyłu, aby wytworzyć podciśnienie (Rysunek 3).
UWAGA: Na tym etapie pozycja prawej ręki operatora powinna być nieco niższa niż stół operacyjny, aby igła poruszała się w górę i znajdowała się powyżej płaszczyzny poziomej. Dlatego zwierzę umieszcza się w pobliżu krawędzi stołu. - Przesunąć strzykawkę do przodu o 3-4 mm, ale przerwać, jeśli nie ma odpływu krwi do strzykawki. Następnie powoli odciągnij strzykawkę i utrzymuj w niej podciśnienie. W większości przypadków krew dostałaby się do strzykawki podczas cofania.
- Gdy krew dostanie się do strzykawki, zamocuj strzykawkę i utrzymuj podciśnienie do momentu, aż do zebrania w strzykawce wymaganej objętości (200 μl) krwi.
- Po pobraniu krwi wyjmij igłę do nakłucia i lekko dociśnij miejsce nakłucia wacikiem przez 1-2 minuty, aby zatrzymać krwawienie. Następnie zwróć myszy do klatki.
UWAGA: Zdarzało się, że nie udawało się pobrać krwi za pierwszym razem. Wyreguluj kierunek igły na boki i powtórz kroki 3.3-3.5. Jeśli 3 próby pobrania krwi nie powiodą się, przejdź na drugą stronę. - Przenieść próbkę krwi do probówki z heparyną.
4. Odzyskiwanie myszy
- Podczas działania znieczulenia pentobarbitalowego przyspiesz regenerację, zapewniając wsparcie cieplne, dopóki mysz nie zacznie się ponownie poruszać.
Wyniki
Procedurę tę powtórzono u 10 myszy rasy Kunming (samce n = 5, samice n = 5, masa ciała 25,4 ± 2,0 g). Dziewięć procedur zakończyło się sukcesem po stronie prawej. W jednym przypadku nie udało się przeprowadzić nakłucia po 3 próbach po stronie prawej, jednak pobranie krwi zakończyło się sukcesem po stronie lewej. Czas trwania zabiegu (od nakłucia do uzyskania wymaganej objętości krwi) wynosił od 35 do 126 s (średnio 68,4 ± 26,4 s). Objętość pobieranej krwi ustalono na około 200 µL (średnio 203 ± 11,6 µL). Pobranie krwi zakończyło się sukcesem w ciągu od 1 do 4 prób. Pobranie krwi udało się za pierwszą próbą u dwóch myszy i po 4 próbach u jednej myszy; u pozostałych myszy pobranie wymagało 2-3 prób. Wszystkie dane przedstawiono w Tabeli 1. Wszystkie zwierzęta przeżyły i powróciły do stanu prawidłowego w ciągu 30 minut po pobraniu krwi. Nie stwierdzono istotnych różnic między płciami we wszystkich obserwowanych parametrach (Tabela 1).
Rysunek 1: Znieczulenie ogólne poprzez wstrzyknięcie doszprowadzinowe Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 2: Pozycja grzbietna myszy. Należy zwrócić uwagę, że odległość między krawędzią a myszą wynosi 2-4 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Miejsce nakłucia i ułożenie dłoni operatora. Należy zwrócić uwagę, że palec serdeczny prawej ręki przesuwa się do tyłu, aby wytworzyć podciśnienie. Lewa ręka jest umieszczona bocznie względem miejsca nakłucia, aby unieruchomić skórę i tkanki podskórne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Lokalizacja żyły podobojczykowej, obojczyka i dołka nadmostkowego. Żyła podobojczykowa przebiega pod obojczykiem i odpływa do żyły głównej górnej pod dołkiem nadmostkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Relacja między ścianą naczynia a igłą podczas procedury. (A) Ściany żyły podobojczykowej przylegają do siebie podczas posuwania igły do przodu, przez co krew nie może zostać pobrana. (B) Podczas wycofywania igły do tyłu ściany rozdzielają się, co umożliwia pobranie krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| zmienna | Suma (n=10) | Samce (n=5) | Kobiety (n=5) | Wartość p |
| Masa ciała (g) | 25.3 ± 2.2 | 25.3 ± 3.0 | 25.4 ± 1.3 | 0.926 |
| Objętość krwi (μL) | 203.0 ± 11.6 | 208 ± 13.0 | 198 ± 8.4 | 0.187 |
| Przebieg czasowy (s) | 68.4 ± 26.4 | 70.6 ± 35.1 | 66.2 ± 18.0 | 0.809 |
| Wycofania | 2.3 ± 0.9 | 2.4 ± 1.1 | 2.2 ± 0.8 | 0.760 |
| Nie stwierdzono istotnych różnic ze względu na płeć dla wszystkich obserwowanych parametrów, wszystkie wartości P >0.05. | ||||
Tabela 1: Obserwowane parametry w zależności od płci
Dyskusja
Niniejszy raport stanowi rozszerzenie wcześniejszych badań nad pobieraniem próbek krwi przez nakłucie żyły podobojczykowej u szczurów11. Ponieważ mysz jest najczęściej wykorzystywanym zwierzęciem badawczym, warto byłoby sprawdzić, czy tę technikę można również zastosować u myszy. Wyzwanie wynika ze stosunkowo mniejszej średnicy żyły podobojczykowej.
W niniejszych badaniach stwierdziliśmy, że nakłucie podobojczykowe u myszy jest wykonalnym i niezawodnym sposobem pobierania krwi. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, takimi jak przecięcie żyły ogonowej lub pobranie krwi z oczodołu, obecna metoda nie budzi żadnych problemów etycznych. Wszystkie zwierzęta przeżyły po tej procedurze bez płynnych suplementów po około 200 μl ekstrakcji krwi, a zwierzęta mogły być wykorzystane do dalszych badań eksperymentalnych. Teoretycznie całkowita objętość próbki nie może za każdym razem osiągnąć więcej niż 10% całkowitej objętości krwi krążącej, a całkowita objętość dorosłego zwierzęcia wynosi od 55 do 70 ml/kg masy ciała5. Dla myszy użytych w tym badaniu (21,6-28,3 g) maksymalna ekstrakcja objętościowa powinna wynosić około 200 μL. W ten sposób ustalamy ilość próbki krwi na około 200 μl dla każdej myszy. Brak możliwości zmierzenia ciśnienia krwi, tętna i innych parametrów stresu to główne ograniczenia tego raportu.
Odpowiednią kwestią jest również odpowiednie znieczulenie ogólne, które gwarantuje powodzenie nakłucia. Myszy powinny zachować ciszę podczas zabiegu nakłuwania, aby uniknąć ryzyka zranienia naczynia przez igłę. Stwierdziliśmy, że pentobarbital sodu w dawce 60 mg/kg do znieczulenia ogólnego może zaspokoić idealną głębokość znieczulenia. Minusem tego środka jest stosunkowo długi czas rekonwalescencji (średnio około 30 minut). W niektórych instytutach stosuje się inhalację izofluranu w celu skrócenia czasu rekonwalescencji i należy ją rozważyć jako alternatywny wybór znieczulenia15.
Lokalizacja żyły podobojczykowej pokazano na rycinie 4. Ze względu na cienką ścianę i niskie ciśnienie w żyle, przednia i tylna ściana żyły podobojczykowej przyczepiają się do siebie pod naciskiem igły, podczas gdy igła porusza się do przodu (ryc. 5A). Podczas powolnego wycofywania tłoka do tyłu, przymocowane ścianki rozdzielą się samoistnie, a końcówka igły może wejść do prawdziwej jamy naczynia, a krew może spłynąć do strzykawki pod stałym podciśnieniem (ryc. 5B). Korzystanie z próżniowego systemu pobierania krwi16 może również sprzyjać pobieraniu krwi. Ze względu na stosunkowo małą średnicę żyły podobojczykowej myszy nawet doświadczony operator może dojść do awarii. Dla nowicjusza zalecamy nakłucie żyły podobojczykowej u szczurów, jak podano11. Po kilku udanych próbach nakłucia u szczurów, wskaźnik powodzenia nakłucia żyły podobojczykowej u myszy może zostać znacznie zwiększony. Upewnij się, że dokładne miejsce nakłucia znajduje się tylko od ogona do środka kości obojczyka. Igła poruszająca się w górę i czaszkowa do górnego dołu mostka to inne kluczowe punkty gwarantujące udane nakłucie.
Podsumowując, nakłucie żyły podobojczykowej jest bezpieczną i skuteczną metodą pobierania krwi u myszy. Oprócz przecięcia żył ogonowych i pobrania krwi ze splotu zaoczodołowego, metoda ta jest wykonalna, bezpieczna i odpowiednia do badań obserwacyjnych w kilku punktach czasowych u myszy.
Oświadczenia
Żaden nie zadeklarował.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin nr 81670269, nr 81500355 i nr 81500226.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1,0 ml | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, prowincja Shandong, Chiny) | 20163151593 | |
| 75% etanolu | Wydział Farmacji, Drugi Szpital Xiangya Uniwersytetu Środkowo-Południowego | wykonany na Wydziale Farmacji, Drugi Szpital Xiangya Uniwersytetu Środkowo-Południowego | |
| klejąca | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Niemcy) | 1534-1 | |
| płócienne rękawiczki | do anestezjologii | ||
| waga elektroniczna | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, prowincja Guangdong, Chiny) | KP-3000 | |
| France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny) | 8281744 heparyna | ||
| (stosowane stężenie 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, prowincja Jiangsu, Chiny) | H32025851 | |
| myszy | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, prowincja Hunan, Chiny) | Igła Kunming spcies | |
| , 26G, 0,45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, prowincja Shandong, Chiny) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodu (używany roztwór 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| sól fizjologiczna, 100 ml | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, prowincja Hunan, Chiny) | H43020454 | |
| oprogramowanie | statyczneMiędzynarodowe maszyny biznesowe | SPSS Statistics 25 | |
| probówek, 2 ml | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (prowincja Wuhan Hubei, Chiny) | MCT-150-C |
Bibliografia
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904(2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. fL. A. Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academies Press. Washington (DC). (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
Przedruki i uprawnienia
