Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół swobodnego pośredniego testu immunofluorescencyjnego na odcinkach biopsji skóry, który pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby wariantów konformacji alfa synukleiny związanej z chorobą Parkinsona i wielu białek obwodowego układu nerwowego.

Streszczenie

Do tej pory, dla większości chorób neurodegeneracyjnych dostępna jest tylko pośmiertna ostateczna diagnoza histopatologiczna. W przypadku choroby Parkinsona (PD) diagnoza nadal opiera się tylko na klinicznych objawach zajęcia motorycznego, które pojawiają się w późniejszym przebiegu choroby, kiedy większość neuronów dopaminergicznych jest już utracona. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na biomarker, który będzie w stanie zidentyfikować pacjentów na początku choroby lub w przypadku ryzyka jej rozwoju. W ciągu ostatnich kilku lat biopsja skóry okazała się doskonałym narzędziem badawczym i diagnostycznym w chorobach nerwów obwodowych, takich jak neuropatia drobnowłóknowa. Co ciekawe, neuropatia małych włókien i złogi nerwowe alfa synukleiny (αSyn) zostały wykazane przez biopsję skóry u pacjentów z chorobą Parkinsona. Rzeczywiście, biopsja skóry ma tę wielką zaletę, że jest łatwo dostępną, minimalnie inwazyjną i bezbolesną procedurą, która umożliwia analizę obwodowej tkanki nerwowej podatnej na patologię. Co więcej, możliwość powtórzenia biopsji skóry w trakcie obserwacji tego samego pacjenta pozwala na badanie podłużnej korelacji z postępem choroby. Opracowaliśmy ustandaryzowany, niezawodny protokół do badania obecności agregatów αSyn we włóknach nerwowych skóry pacjenta z chorobą Parkinsona. Protokół ten obejmuje kilka krótkich etapów fiksacji, cięcie kriotomiczne, a następnie podwójne barwienie immunofluorescencyjne z dwoma specyficznymi przeciwciałami: anty Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) do oznaczania włókien nerwowych skóry i anty 5G4 do wykrywania agregatów αSyn. Jest to wszechstronny, czuły i łatwy do wykonania protokół, który może być również stosowany do celowania w inne białka interesujące nerwy skórne. Możliwość oznaczania agregatów αSyn jest kolejnym krokiem naprzód w kierunku wykorzystania biopsji skóry jako narzędzia do ustalenia przedśmiertnej diagnozy histopatologicznej PD.

Wprowadzenie

Biopsja skóry zyskała ogromne znaczenie jako narzędzie diagnostyczne i badawcze w dziedzinie zaburzeń neurologicznych¹. Rzeczywiście, naskórek i skóra właściwa zawierają obfite somatyczne czuciowe włókna nerwowe (zmielinizowane i niezmielinizowane), nocyceptywne wolne zakończenia nerwowe, receptory czuciowe i autonomiczne unerwienie gruczołów potowych, naczyń krwionośnych, gruczołów łojowych i mięśni arrector pilorum².

W połowie XX wieku układ immunohistochemiczny przeciwciała PGP9.5 pozwolił na dowody rozległego unerwienia ludzkiego naskórka skóry ssaków³. PGP9.5 jest hydrolazą karboksylowo-końcową równomiernie rozmieszczoną wzdłuż aksonów zarówno ośrodka, jak i obwodowego układu nerwowego (PNS). Dostępność tego przeciwciała pozwoliła nie tylko na wyjaśnienie morfologii i anatomii PNS w skórze, ale także na przeprowadzenie badań nad chorobami z nim związanymi^3,4. Biopsja skóry przyczyniła się do zdefiniowania nowej jednostki klinicznej: neuropatii drobnowłókien. Kilka międzynarodowych grup wykazało związek między utratą śródnaskórkowych włókien nerwowych a objawami/oznakami neuropatii małych włókien⁵ za pomocą analizy biopsji skóry i dostarczyło standaryzowane protokoły morfometrii nerwów, a także normatywne wartości referencyjne do stosowania w praktyce klinicznej6^,7,8.

Ostatnio duża ilość dowodów wykazała, że choroby neurodegeneracyjne, charakteryzujące się nieprawidłowo pofałdowanymi nagromadzeniami białek w ośrodkowym układzie nerwowym, są patologiami wieloukładowymi⁹. Rzeczywiście, PD charakteryzuje się akumulacją αSyn w neuronie dopaminergicznym istoty czarnej, ale wykazano, że αSyn i jego patologiczna forma, fosforylowany αSyn (P-αSyn), można wykryć również w tkankach obwodowych. Błona śluzowa przewodu pokarmowego¹⁰, gruczoły ślinowe¹¹, autonomiczne włókna skóry otaczające gruczoły potowe i mięśnie pilomotoryczne^12,13,14, wykazują immunoreaktywność na patogenne formy αSyn, zgodnie z hipotezą Braaka, która intrygująco postuluje, że patologia αSyn może rozpocząć się w PNS z dużym wyprzedzeniem, zanim dojdzie do jej akumulacji w mózgu¹⁵. Ponadto wykazano obecność p-αSyn w nerwach skórnych pacjentów z zaburzeniami zachowania REM, które są uważane za prodromalne PD^16,17, dlatego patologiczny skóry αSyn można uznać za obiecujący wczesny obwodowy histopatologiczny marker synukleinopatii.

Związek neuropatii małych włókien w PD został już wcześniej wykazany i stwierdzono, że gęstość wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych odzwierciedla postęp choroby^18,19. W związku z tym biopsja skóry jest użytecznym narzędziem do badania neurodegeneracji w chorobie Parkinsona i do ustalenia przedśmiertnej diagnozy histopatologicznej choroby. Rzeczywiście, biopsja skóry ma tę wielką zaletę, że jest łatwo dostępną i mało inwazyjną procedurą, pozwalającą na analizę tkanki nerwowej podatnej na patologię. Wreszcie, możliwość powtórzenia biopsji skóry w toku obserwacji tych samych pacjentów pozwala na badanie podłużnej korelacji z postępem choroby.

W naszym laboratorium, wykorzystując podwójne barwienie immunologiczne za pomocą PGP9.5 i specyficznego dla konformacji przeciwciała monoklonalnego 5G4, które rozpoznaje specyficzne dla choroby formy αSyn, w tym małe agregaty^20,21, udało nam się wykazać obecność agregatów αSyn w nerwach skórnych z obiecującą wysoką skutecznością diagnostyczną¹⁹. Analiza immunofluorescencyjna biopsji skóry w chorobach konformacyjnych wyróżnia się jako obiecujące źródło biomarkerów, łącząc zarówno wykrywanie agregatów białkowych, jak i pomiar neurodegeneracji in vivo. Poniżej przedstawiono łatwy i wszechstronny protokół postępowania z biopsją skóry i wykonywania swobodnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia agregatów αSyn. Co więcej, protokół ten można dostosować do celowania w dowolne inne interesujące białko ulegające ekspresji w PNS skóry.

Poniższy protokół badania został wykorzystany do oceny użyteczności diagnostycznej zagregowanej analizy αSyn w PNS PD za pomocą biopsji skóry¹⁹. Kryteriami włączenia do PD były: jednoznaczna diagnoza kliniczna zgodnie z kryteriami diagnostycznymi brytyjskiego Banku Mózgu, czas trwania choroby co najmniej 3 lata, brak historii rodzinnej oraz brak poważnych zaburzeń poznawczych lub poważnych objawów dysautonomicznych w historii. Kryteriami wykluczenia były znane przyczyny neuropatii (hemoglobina glikowana, kreatynina, witamina B12, TSH, immunofiksacja surowicy, HIV, HCV, kiła i borelioza). Każdy pacjent został poddany biopsjom skóry o średnicy 3 mm w trzech anatomicznych miejscach (szyja na poziomie skóry C8, udo 10 cm powyżej kolana, noga 10 cm powyżej kostki bocznej) po stronie, która była klinicznie bardziej dotknięta. Ogólnie rzecz biorąc, poniższy protokół dotyczy postępowania z biopsją skóry oraz wykonywania barwienia i analizy immunofluorescencyjnej w swobodnym przepływie. Dzięki temu może być dostosowany i wykorzystany do wykrywania innych interesujących białek w tkance skórnej.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez Kantonalną Komisję Etyczną i wszyscy zapisani uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na badanie.

1. Kolekcja biopsji skóry

1. Pozwól wykwalifikowanemu lekarzowi wykonać biopsję skóry w odpowiednich warunkach klinicznych.
2. Wybierz obszar, w którym chcesz wykonać biopsję skóry i oczyść go wacikiem nasączonym alkoholem.
3. Przygotuj roztwór znieczulający z 1 ml lidokainy 2%.
4. Trzymając igłę równolegle do obszaru, wstrzyknąć znieczulenie miejscowe podskórnie.
5. Po sprawdzeniu efektu znieczulenia weź jednorazowy dziurkacz o średnicy 3 mm i delikatnie dociśnij rotacyjny i delikatny nacisk w dół, aby obrócić go w dół przez naskórek i skórę właściwą, aż do osiągnięcia podskórnej tkanki tłuszczowej.
6. Wycofaj stempel.
7. Użyj jednorazowych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć zatyczkę do skóry.
8. Za pomocą nożyczek wyciąć podstawę próbki na poziomie tkanki tłuszczowej.
9. Umieścić próbkę w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego lizynę i paraformaldehyd (PLP).
10. Zdezynfekuj obszar i przykryj go bandażem samoprzylepnym.

2. Utrwalanie i przechowywanie tkanek

1. Przygotować świeży roztwór utrwalający PLP (patrz Tabela 1).
2. Natychmiast po pobraniu biopsji skóry zanurzyć ją w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego PLP i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
3. Następnego dnia, pod wyciągiem, delikatnie usunąć utrwalacz PLP i w tej samej probówce przemyć biopsję 3 razy przez 5 minut 5 ml 0,1 M roztworu Sorensena (Tabela 1).
4. Odrzucić roztwór Sorensena i inkubować biopsję z 5 ml roztworu krioprotekcji O/N w temperaturze 4 °C.
5. Przechowywać biopsję w temperaturze 4 °C, jeśli cięcie kriotomem jest wykonywane w ciągu 1 tygodnia; przechowywać biopsję w temperaturze -20 °C, jeśli cięcie jest wykonywane w ciągu 3 miesięcy; umieścić biopsję w kriofordzie (kroki 3.2-3.4) i przechowywać ją w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.

3. Cięcie tkanek za pomocą kriotomii

1. Ustawić kriotom na -20 °C.
2. Weź kriomold i napełnij go podłożem do zatapiania w krio. Unikaj tworzenia bąbelków.
3. Za pomocą pęsety zanurz biopsję w podłożu do zatapiania w krioterapii z osią podłużną (naskórek - skóra właściwa) równoległą do dna krioformy.
4. Zatrzaskowo zamroź próbkę ciekłym azotem, aby uzyskać stałą kostkę pożywki do zatapiania w krio, zawierającą biopsję we właściwej orientacji.
5. Umieść próbkę w kriostacie i odczekaj 30 minut, aby biopsja mogła się zaaklimatyzować.
6. Umieścić próbkę na kriostacie i wyciąć odcinki o grubości 50 μm.
7. Za pomocą małego pędzelka przenieś kriosekcje na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 μl roztworu niezamarzającego w każdym dołku. Jedna sekcja na studzienkę.
8. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   nuta: Jeśli analiza całej biopsji nie jest analizowana, należy ją przeciąć tylko częściowo. W takim przypadku skrawki muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C, a pozostała część biopsji w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Napełnij 96-dołkową płytkę 100 μl roztworu myjącego.
2. Przenieść skrawki do analizy z płytki do przechowywania na nową zawierającą roztwór myjący. 1 sekcja na każdą studzienkę (4 sekcje na miejsce anatomiczne, na pacjenta: zwykle w sumie 12 sekcji na pacjenta).
3. Pozostaw sekcję w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przenieś sekcję do innej studzienki zawierającej ten sam roztwór i powtórz pranie.
4. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu blokującego i inkubować przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie 4 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała anty-PGP9.5 (poliklonalne królika, 1:1000) i anty-5G4 (monoklonalne myszy, 1:400) w roztworze roboczym.
6. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować je O/N w temperaturze pokojowej.
7. Zgodnie z punktem 4.3 przemyć sekcje 2 razy przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, przy użyciu 100 μl roztworu myjącego.
8. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (sprzężone z różnymi fluoroforami): kozi anty-królik w celu wykrycia PGP9.5 (1:700) i kozi anty-myszy w celu wykrycia 5G4 (1:700) w roztworze roboczym.
9. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Od tego momentu przykryj 96-dołkową płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z drugorzędowym przeciwciałem / przeciwciałami.
10. Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.
11. Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl DAPI (rozcieńczonego 1:5 000 w PBS 1x) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
12. Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.
13. Zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania.
14. Dodaj kilka kropel podłoża montażowego na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
15. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N przed użyciem mikroskopu konfokalnego/fluorescencyjnego.
16. Przechowywać preparaty w odpowiednim pudełku w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło. Przy dokładnym przechowywaniu sygnał będzie widoczny przez około 6 miesięcy.
    nuta: Przeniesienie fragmentu z płytki 96-dołkowej zawierającej nowo pokrojone plastry do płytki 96-dołkowej zawierającej roztwór płuczący (krok 4.1) odbywa się za pomocą małej szczoteczki, która pomaga pobrać biopsję. Po przeniesieniu sekcji do pierwszej studzienki, za każdym razem, gdy plaster musi być inkubowany z innym roztworem, przenieś go z dołka do dołka za pomocą pędzla.

5. Obrazowanie immunofluorescencyjne

1. Oglądaj przekroje pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym (powiększenie 20X, 40X lub większe, użyj kolejnych klatek z przyrostem 2 μm na planie Z-stack, aby uzyskać najlepsze wyniki).
2. Rejestrowanie obrazów za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu
3. Użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (tj. ImageJ) do analizy sygnałów dodatnich w sekcjach pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału. Aby to zrobić, wykonaj czynności wymienione poniżej.
   1. Otwórz plik za pomocą oprogramowania ImageJ.
   2. Kliknij Obraz > kolor > podziel kanały, aby przeanalizować każdy kanał koloru.
   3. Kliknij opcję Obraz > stos > projekt Z, aby uzyskać scalenie wielu przejęć sekcji.
   4. Kliknij opcję Obraz > kolor > scalić kanały, aby uzyskać scalenie różnych kanałów kolorów o tym samym pozyskaniu.

Roztwór przeciw zamarzaniu
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) 30% glicerolu
30% glikol etylenowy
30% dH₂O
10% 2x Bufor fosforanowy Roztwór blokujący
(przygotuj się w tej chwili) 4% normalna surowica kozia
1% Triton X-100
w Roztwór myjący Krio-protectant
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) 20% glicerol
80% roztwór Sorensena Wodorofosforan disodowy, roztwór
(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy) 0,45 M wodorofosforan disodowy (Na2HPO4) w dH2O
Filtr w sterylnej butelce Roztwór lizyny
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni) 50% 0,3M roztworu monochlorowodorku L-lizyny
50% 0,1 M roztworu Sorensena pH 7,6
pH 7,4, filtrować w sterylnej butelce Paraformaldehyd (PFA) 8%
(przygotować pod wyciągiem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca) 2,6 M PFA w dH2O (do 55°C_do nie przekraczać 60 °C, aby uniknąć tworzenia się kwasu mrówkowego)
filtr w sterylnej butelce Bufor fosforanowy 2x
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) 6% roztwór fosforanu sodu (NaH2PO4)
45% roztwór fosforanu disodowego (Na2HPO4) w_dH2O Roztwór utrwalający PLP
(przygotuj się w tej chwili, pod wyciągiem ) 25% Paraformaldehyd 8%
0,01 M (meta)periodynian sodu
75% roztwór lizyny< Diwodorofosforan sodu jednowodny
(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy) 0,52 M diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4*H2O) w dH2O
Przefiltrować w sterylnej butelce. Roztwór Sorensena
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca) 2,5% roztwór fosforanu monosodowego
18,7% Roztwór fosforanu disodowego
pH7,6, w dH2O Roztwór myjący
(przygotuj się w tej chwili) 0,25 M Trizma podstawa
0,26 mln NaCl
pH7,6, w dH2O Roztwór roboczy
(przygotuj się w tej chwili) 50% roztwór blokujący
50% roztwór myjący

Tabela 1: Wymagane rozwiązania. Lista wymaganych rozwiązań do protokołu oraz krótki opis sposobu jego przygotowania.

Wyniki

Zgodnie z opisaną procedurą (Rysunek 1), wykryliśmy agregaty αSyn, oznaczone przeciwciałem 5G4, w pęczkach nerwów skórnych unerwiających struktury autonomiczne pacjentów z PD. Morfologia złogów alfa-synukleiny pojawia się jako kropkowany sygnał wzdłuż aksonów nerwów skórnych (Ryc. 2). Rzeczywiście, wykorzystując ten protokół u 19 pacjentów z PD i 17 osób z grupy kontrolnej w biopsjach skóry w trzech anatomicznych miejscach (szyjka macicy, udo i dystalna noga), stwierdziliśmy, że 5G...

Dyskusja

Opisujemy swobodnie unoszący się test immunofluorescencyjny do biopsji skóry w celu rozpoznania PD: wykorzystuje on podwójne barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-PGP9.5, markerem panaksonalnym i anty-5G4, przeciwciałem specyficznym dla konformacji, które rozpoznaje zagregowaną formę αSyn.

Wielkimi zaletami biopsji skóry w celach diagnostycznych w chorobie Parkinsona i ewentualnie w innych zaburzeniach konformacyjnych białek są: 1) bezpośredni dostęp do tkanki nerwowej podatnej na chorob...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5G4 (anty człowiek i alfa; Syneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mysz monoklonalna
AlexaFluor 488 Koza anty Królik IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/ml
AlexaFluor 594 Koza przeciw mysim IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/ml
Roztwór wodorofosforanu disodowego	Merk Millipore	106586
Glikol etylenowy	Sigma-Aldrich	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich	G7757
Monochlorowodorek L-lizyny	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyd	Aldrich Chemia
PGP9.5	Abcam	ab15503	Poliklonalny
chlorek sodu	królika Sigma	S3014
Diwodorofosforan sodu jednowodny	Merck Millipore	106346
(meta)periodynian sodu	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Podłoże montażowe