Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Streszczenie

Wtórne bakteryjne zapalenie płuc następujące po zakażeniu grypą niezmiennie plasuje się w pierwszej dziesiątce głównych przyczyn zgonów w Stanach Zjednoczonych. Do tej pory mysie modele koinfekcji były podstawowym narzędziem opracowanym do badania patologii zarówno infekcji pierwotnych, jak i wtórnych. Pomimo rozpowszechnienia tego modelu, w badaniach przeważają znaczne rozbieżności dotyczące procedur wkraplania, objętości dawek i skuteczności. Co więcej, wysiłki te były w dużej mierze niekompletne, jeśli chodzi o ustalenie, w jaki sposób patogen może bezpośrednio wpływać na postęp choroby po zakażeniu. W tym miejscu przedstawiamy precyzyjną metodę dostarczania, odzyskiwania i analizy patogenów, która może być stosowana w mysich modelach wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc. Wykazaliśmy, że wkraplanie dotchawicze umożliwia wydajne i dokładne dostarczanie kontrolowanych objętości bezpośrednio i równomiernie do dolnych dróg oddechowych. Płuca można wyciąć w celu odzyskania i ilościowego określenia obciążenia patogenami. Po wycięciu zakażonych płuc opisujemy metodę ekstrakcji wysokiej jakości RNA patogenu do późniejszej analizy transkrypcyjnej. Procedura ta ma tę zaletę, że jest niechirurgiczną metodą dostarczania bez użycia specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego i zapewnia powtarzalną strategię badania udziału patogenów we wtórnym bakteryjnym zapaleniu płuc.

Wprowadzenie

Wtórne bakteryjne zapalenie płuc po zakażeniu grypą jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych i aktywnym obszarem badań^1,2. Pomimo licznych badań z wykorzystaniem mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, nadal istnieją niespójności dotyczące wkraplania patogenów i przesłuchań^3,4,5. Ponadto, podczas gdy wiele wcześniejszych wysiłków koncentrowało się na immunomodulujących efektach grypy, które prowadzą do zwiększonej podatności na wtórne infekcje bakteryjne, nowsze dane sugerują, że regulacja wirulencji patogenu bakteryjnego jest równym czynnikiem przyczyniającym się do powstania choroby^6,7,8,9. Te nowe dane wymagają bardziej precyzyjnej metody badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc w mysich modelach koinfekcji, które ułatwiają badanie odpowiedzi patogenu.

Unikalne dla modeli jednoczesnych infekcji grypy, organizmy gospodarzy są celowo osłabione immunologicznie przez pierwotną infekcję grypą przed podaniem wtórnego czynnika bakteryjnego. W celu jak najlepszego odtworzenia patogenezy choroby obserwowanej u ludzkich gospodarzy, konieczne jest kontrolowanie obciążenia patogenem zarówno czynników pierwotnych, jak i wtórnych, tak aby można było obserwować indywidualne i skojarzone skutki każdego czynnika zakaźnego. Najczęściej infekcje dróg oddechowych u myszy zostały stwierdzone poprzez podanie donosowe^3,4,5,6,10. Ze względu na to, że droga ta jest technicznie prosta i może być odpowiednia w niektórych zastosowaniach infekcji pojedynczym czynnikiem, nie nadaje się do modeli koinfekcji, ponieważ procedury wkraplania, objętości dawek i skuteczność są bardzo zmienne w opublikowanej literaturze^3,4,5,6.

Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie patogenezy wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, należy wziąć pod uwagę wkład zarówno gospodarza, jak i patogenu. W tym celu opracowaliśmy proste i powtarzalne podejście do odzyskiwania żywych bakterii i patogenów RNA z zakażonych płuc. Metoda ta wykorzystuje uproszczoną, nieinwazyjną procedurę wkraplania dotchawiczego, a następnie izolację bakteryjnego RNA. Opisana w niniejszym dokumencie procedura wkraplania dotchawiczego jest podobna do wcześniej opisanych metod i nie ogranicza się do dostarczania patogenów^11,12,13. Korzystanie z tej konkretnej procedury ma swoją zaletę tego, że jest tanie i nie wymaga użycia specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowy; Ponadto, ponieważ procedura ta jest nieinwazyjna, zapewnia minimalny stres u mysich osób, minimalizuje reakcję zapalną wynikającą z mechaniki inokulacji i zapewnia wydajną drogę dostarczania infekcji wielu podmiotom. Krótko mówiąc, myszy znieczulone izofluranem są zawieszone na siekaczach. Kleszcze służą do delikatnego chwytania języka, a następnie wkładania do tchawicy wstępnie załadowanej, wygiętej, końcówki igły o rozmiarze 21 i dostarczania ładunku patogenu. Walidacja tej procedury jest wykazana poprzez wizualne potwierdzenie równomiernego rozprowadzenia barwnika w przedziale płucnym i odzyskanie ładunku bakteryjnego. Następnie pokazujemy, jak odzyskać żywotnego Staphylococcus aureus (S. aureus) z zakażonych płuc i opisujemy powtarzalną metodę izolowania wysokiej jakości RNA patogenu.

Protokół

Wszystkie metody są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Montana.

1. Wkraplanie dotchawicze

1. Przygotuj miejsce do pracy zawierające następujące materiały: platformę do intubacji, sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml, sterylne kleszcze z końcówką, sterylną igłę z końcówką w rozmiarze 21 oraz dwie stożkowe rurki do przechowywania strzykawki i kleszczyków.
   UWAGA: Platformy do intubacji można zakupić komercyjnie lub zbudować we własnym zakresie. Zastosowana tu platforma do intubacji została wykonana z pleksi o średnicy 0,25 cala. Krótko mówiąc, pleksi została podgrzana, a płyta jest wygięta do wnętrza pod kątem około 65°. Po zewnętrznej stronie platformy intubacyjnej dwie maszynowe zostały wciśnięte w odległości 3 cali od siebie, a między nimi zawieszono gumową taśmę.
2. Przygotować inokulum patogenu poprzez seryjne rozcieńczanie próbki, tak aby uzyskać pożądane stężenie końcowe w całkowitej objętości 50 μl. Przechowywać inokulum na lodzie.
3. Zakładając sterylne rękawice, zegnij igłę o stępionej końcówce 21 G na około 35°.
   UWAGA: Do każdej myszy potrzebna jest osobna igła.
4. Przymocować wygiętą igłę o końcówce 21 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Pobrać 100 μl poduszki powietrznej do strzykawki, a następnie 50 μl czynnika zakaźnego. Umieścić załadowaną igłę i strzykawkę w miejscu łatwo dostępnym dla ręki dominującej.
5. Głęboko znieczulij mysz za pomocą 4% mieszaniny izofluranu i tlenu lub podobnej metody znieczulenia zatwierdzonej przez IACUC. Prawidłowa głębokość znieczulenia jest zwykle uzyskiwana, gdy częstość oddechów zwalnia do około 1 wdechu na 5-8 s i można ją potwierdzić, szczypiąc wyrostek i obserwując brak reakcji ze strony myszy.
   UWAGA: Ta metoda znieczulenia zapewniała wystarczający czas znieczulenia wynoszący około 1,5 minuty. To wystarczyło, aby członkowie naszego laboratorium nauczyli się i przeprowadzili tę procedurę wkraplania; Można jednak zastosować inne metody znieczulenia zatwierdzone przez instytucję^11,12,13.
6. Wyjmij znieczuloną mysz z komory anestezjologicznej i zawieś mysz na platformie intubacyjnej od siekaczy szczęki.
7. Aby otworzyć czyste przejście do tchawicy, użyj kleszczy z końcówką, aby delikatnie chwycić i wysunąć język na zewnątrz jamy ustnej. Przenieś język z kleszczy na kciuk i palec wskazujący ręki niedominującej.
8. Trzymaj język w ręce niedominującej i podnieś fabrycznie załadowaną strzykawkę. Skieruj zgięty koniec igły od ciała i włóż igłę do jamy ustnej do podstawy języka.
9. Trzymając igłę u podstawy języka, delikatnie pochyl nadgarstek, aby spowodować lekkie odsunięcie igły od ciała. Ten krok zapewnia, że igła zostanie wprowadzona do tchawicy, a nie do przełyku.
10. Powoli prowadź igłę w dół do tchawicy; często wyczuwalne jest lekkie tykanie, gdy igła przechodzi przez fałd głosowy. Przełóż igłę przez tchawicę, aż poczujesz lekki opór, gdy igła napotka carinę.
11. Lekko unieść igłę w kierunku proksymalnym, aby zawiesić igłę nad cariną. Umożliwia to dostarczanie do dwóch oskrzeli pierwotnych. Całkowicie wcisnąć tłok strzykawki, aby dostarczyć ładunek zakaźny. Usunąć igłę z tchawicy, podnosząc ją do góry i wyrzucić.
12. Zdejmij mysz z platformy intubacyjnej, naciskając gumową opaskę, ale trzymaj mysz w pozycji pionowej. Zatkaj nosowe drogi oddechowe, kładąc palec bezpośrednio na nozdrzach. Utrzymaj tę pozycję przez około 1 minutę lub do momentu, gdy zaobserwujesz kilka głębokich oddechów.
    UWAGA: Ten ostatni krok zapewnia, że całkowita objętość inokulum zostanie dostarczona do dolnych dróg oddechowych.
13. Wróć mysz do klatki i obserwuj całkowite wyzdrowienie po znieczuleniu.

2. Wycięcie zakażonych płuc

1. Pracując w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność, przygotuj miejsce pracy z następującymi elementami: wagą i sterylną łodzią wagową, platformą preparacyjną, zestawem do preparacji zawierającym nożyczki i kleszcze, sterylnym PBS bez RNAzów i sterylną gazą.
2. Poddać eutanazji zakażoną mysz za pomocą CO₂ lub podobnej metody eutanazji zatwierdzonej przez IACUC.
3. Umieść zainfekowaną mysz na platformie sekcyjnej i zabezpiecz ją za pomocą szpilek na końcu każdego wyrostka. Spryskaj mysz etanolem, aby pomóc utrzymać sterylność powierzchni roboczych.
4. Zaczynając od pępka, użyj kleszczy, aby podnieść skórę i wykonać nacięcie aż do podstawy tchawicy. Chwytając skórę po obu stronach początkowego nacięcia, odciągnij skórę od ciała i przetnij połączenia tkankowe.
   UWAGA: Pomocne może być wykonanie kilku bocznych nacięć w poprzek skóry, aby odsłonić więcej okolicy piersiowej.
5. Zaczynając od podstawy wyrostka mieczykowatego, wykonaj małe nacięcie z zamiarem przebicia przepony. Powoduje to wzrost ciśnienia w klatce piersiowej, który powoduje cofanie się płuc. Gdy płuca są cofnięte, kontynuuj nacięcie, aby uwolnić przeponę.
6. Usuń żebra, wykonując nacięcie po obu stronach klatki piersiowej. Spowoduje to pełne odsłonięcie klatki piersiowej i płuc.
7. Aby wyciąć płuca, chwyć kleszczami podstawę serca i unieś do góry. Umieść nożyczki za płucami i zacznij wykonywać małe nacięcia przez połączenia tkankowe, kontynuując podnoszenie serca do góry.
8. Po wycięciu płuc umieść je na sterylnej gazie i usuń serce. Serce można łatwo usunąć, podnosząc je z płuc za pomocą kleszczy i przecinając pozostałe połączenia tkankowe.
9. Przenieś płuca do wstępnie obtarowanej łodzi wagowej i zapisz wagę.
10. Po zważeniu płuc przenieś je do sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i tymczasowo przechowuj na lodzie, aż przejdziesz do etapów odzyskiwania i analizy patogenu.

3. Odzyskiwanie i analiza patogenów

1. Kontynuując pracę w okapie z przepływem laminarnym, przygotuj miejsce do pracy z następującymi materiałami: maszynką do mielenia tkanek, sterylnym PBS bez RNAzy, buforem RLT uzupełnionym ß-merkaptoetanolem (1:100) i 1,5 ml probówek wirówkowych bez RNAzy.
   UWAGA: ß-merkaptoetanol może być niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, spożycia, kontaktu z oczami lub wdychania. Rozcieńczanie ß-merkaptoetanolu do buforu RLT powinno odbywać się w dygestorium.
2. Zacznij od dodania 1 ml sterylnego PBS wolnego od RNAzy do młynka do tkanek. Po napełnieniu przechowuj młynek do tkanek na lodzie.
3. Przygotuj serię sterylnych probówek do seryjnego rozcieńczania bez RNAzy, które zostaną użyte do ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego odzyskanego z zakażonych płuc. Najłatwiej to osiągnąć, dodając 900 μl sterylnej wody do każdej probówki mikrowirówkowej, a następnie seryjnie rozcieńczając inokulum patogenu.
   UWAGA: Liczba probówek rozcieńczających niezbędnych do dokładnego zliczenia patogenów będzie się różnić w zależności od początkowego wprowadzenia patogenu i czasu trwania infekcji. Trzeba to ustalić empirycznie.
4. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś płuca do przygotowanego młynka do tkanek i dokładnie zhomogenizuj tkankę, naciskając na cokół podczas obracania.
5. Otworzyć młynek do tkanek i wlać 100 μl homogenizowanej próbki do pierwszej z przygotowanych seryjnie rozcieńczających probówek. Seryjnie rozcieńczyć próbki i oznaczyć jtk przez posiew na agarze odżywczym. CFU mogą być rejestrowane jako jtk/ml lub jtk/ml/mg tkanki płucnej.
   UWAGA: Na tym etapie można pobrać dodatkowe 200 μl homogenizowanej próbki w celu oczyszczenia wirusowego RNA (patrz tabela materiałów) lub przechowywać w temperaturze -80°C do przyszłej analizy.
6. Po usunięciu podwielokrotności w celu oznaczenia CFU i/lub izolacji wirusowego RNA, zastąpić cokół mielenia i zagnieździć homogenizowaną tkankę przez odwirowanie z prędkością 4 000 obr./min (3724 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
7. Za pomocą pipety usunąć supernatant z granulowanej próbki i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Supernatant jest wolny od bakterii i może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu analizy rozpuszczalnego gospodarza i wydzielanych czynników chorobotwórczych.
8. Zawiesić homogenizowany osad tkankowy przez pipetowanie lub wirowanie w 700 μl buforu RLT-ß-merkaptoetanolu i przenieść próbkę do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNAzy.
   UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
9. Oczyszczanie RNA przy użyciu niewielkich modyfikacji w protokole producenta zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów); patrz Voyich et al. 2008¹⁴.
   1. Przenieść homogenizowaną gnojowicę płuc do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej kulki krzemionkowe o średnicy 0,1 mm i przetwarzać za pomocą ubijaka do kulek przez 20 s z prędkością 6 m/s.
   2. Odwirować próbkę z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty. Po odwirowaniu odpipetować supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   3. Dodać 350 μl 96%–100% etanolu do próbki i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub odwrócenie.
   4. Przenieść 700 μl próbki do kolumny oczyszczającej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować próbkę w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ. Nadmiar próbki należy przepuścić przez tę samą kolumnę, jak opisano powyżej.
   5. Przemyć kolumnę 700 μl buforu RW1 i odwirować próbkę w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przepływ i przenieść kolumnę z membraną krzemionkową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
   6. Nanieść 500 μl buforu RPE na kolumnę. Przemyć kolumnę przez odwirowanie w temperaturze ≥ 8 000 x g przez 15 s. Odrzuć przepływ.
   7. Nanieść dodatkowe 500 μl buforu RPE do kolumny RNeasy i odwirować przy 8 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić przepływ i odwirować kolumnę przy ≥10 000 x g przez 1 min.
   8. Aby wymyć oczyszczony RNA, zacznij od przeniesienia kolumny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez RNAzy. Odpipetować 50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę z żelu krzemionkowego kolumny i odwirować przy ≥8000 x g przez 1 min.
      UWAGA: Uwolniony RNA można ponownie przeciągnąć przez tę samą kolumnę, aby zwiększyć wydajność RNA.
   9. Do oczyszczonego RNA dodać 50 μl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 μl. Podwielokrotność 350 μl RLT-ß-merkaptoetanolu, a następnie 250 μl 96%–100% etanolu do próbki i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub inwersję.
   10. Umieścić próbkę w kolumnie oczyszczającej umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy ≥8000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływowy płyn i wymienić probówkę zbiorczą.
   11. Przemyć kolumnę, dodając 350 μl buforu RW1, a następnie odwirować w temperaturze ≥8000 x g przez 15 s.
   12. Przygotować roztwór DNazy zawierający około 27 jednostek Kunitza, dodając 10 μl zapasu DNazy (750 jednostek Kunitza/ml) do 70 μl buforu RDD. Dodać 80 μl roztworu DNazy bezpośrednio na membranę z żelu krzemionkowego i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   13. Przemyć kolumnę 350 μl buforu RW1 i odwirować przy ≥8000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ.
   14. Powtórz kroki 3.9.6–3.9.8, aby oczyścić RNA.
       UWAGA: Zaleca się powtórzenie procedury oczyszczania RNA, wykonując kroki 3.9.9–3.9.10 i 3.9.6–3.9.8 (pomiń kroki DNazy 3.9.11–3.9.13). To dodatkowe oczyszczanie skutkuje bardzo wysokiej jakości RNA.
10. Wydajność RNA można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru z odczytami na poziomie 260 nM w celu określenia stężenia i 260:280 nM w celu określenia czystości. Po uzyskaniu wydajności RNA standaryzować stężenie każdej próbki RNA do 50 ng/μL.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie wielu porcji w stężeniu 50 ng/μl, aby uniknąć cykli zamrażania/rozmrażania, które mogą prowadzić do degradacji RNA.
11. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do analizy transkryptu.
    UWAGA: W poprzednich publikacjach RNA od 3-5 myszy połączono w celu analizy transkryptu. Dzięki optymalizacji powyższej techniki, RNA od 1 myszy zostało empirycznie określone jako wystarczające do analizy transkryptu (80–120 ng / μL).

Wyniki

Rysunek 1 wykorzystuje 0,1% wagowo-objętościowego roztworu Coomassie brilliant blue, aby zademonstrować, że wkroplenie dotchawicze dostarcza inokulum bezpośrednio i równomiernie do dolnych dróg oddechowych. Rysunek 2 pokazuje, że bakterie (S. aureus) CFU odzyskały się bezpośrednio z homogenizowanej tkanki płucnej. Rysunek 3 pokazuje użycie tego systemu do precyzyjnego dostarczania i odzyskiwania inokulum w dolnych drogach oddechowych poprzez wykreślenie wejściowych i regeneracyjnych CFU od poszczególnych myszy. Rysunek 4 pokazuje krzywą amplifikacji qRT-PCR genu gyrB bakteryjnego porządkowania, aby pokazać, że bakteryjne RNA może być ekstrahowane bezpośrednio z zakażonej tkanki płucnej przy minimalnym zanieczyszczeniu DNA. Rysunek 5 pokazuje konstrukcję standardowej krzywej przy użyciu amplifikacji qRT-PCR segmentu M wirusa grypy A, aby pokazać, że wirusowe RNA może być ekstrahowane bezpośrednio z zakażonej tkanki płucnej.

Rycina 1: Wkraplanie dotchawicze umożliwia równomierne rozprowadzenie do dolnych dróg oddechowych. (A, B) Niezakażone płuca wycięto od zdrowej myszy po dotchawczym wkropleniu sterylnego PBS i sfotografowano z (A) perspektywy grzbietowej i (B) brzusznej. (C, D) 50 μl 0,1% roztworu błękitu brylantowego Coomassie podano znieczulonej myszy poprzez podanie dotchawicze. (C) Grzbietowy. (D) Brzuszny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne odzyskiwanie bakteryjnych CFU z zakażonego homogenatu płuc. Płuca zostały wycięte jeden dzień po prowokacji S. aureus. Po homogenacji 100 μl gnojowicy płucnej rozcieńczono seryjnie przez ^10-6. Aby wyliczyć odzyskane CFU, 10 μl kropli wysiewano z rozcieńczeń ^10-5 i ^10-6 na tryptycznym agarze sojowym (TSA) i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% C0₂ przez noc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Precyzyjne dostarczanie i odzyskiwanie inokulum patogenu po podaniu dotchawiczym. Myszy podzielono na dwie grupy po trzy myszy w grupie. Myszy poddano dotchawniczej inkraplacji S. aureus w temperaturze 1 x 10⁸ (niskie) i 2 x 10⁸ (wysokie) CFU/ml. Godzinę po zakażeniu myszy poddano eutanazji, a płuca wycięto, aby zademonstrować precyzję wkraplania i rekonwalescencji. inokulum bakteryjne i bakterie odzyskane z homogenatu płuc posiewano na TSA (tryptycznym agarze sojowym). Nie stwierdzono istotnych różnic między wprowadzaniem bakterii a odzyskiwaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny odzysk i czystość bakteryjnego RNA. Sześć godzin po wkropleniu dotchawiczym 1 x 10⁸ CFU/50 μL S. aureus, myszy poddano eutanazji. Płuca wycięto i zhomogenizowano, a następnie ponownie zawiesino gnojowicę płucną w buforze RLT-ß-merkaptoetanolu. RNA oczyszczono zgodnie z opisem w kroku 3.9¹⁴. qRT-PCR wykorzystano do wykrycia transkryptów bakteryjnego genu gospodarowania gyrB. Włączono kontrolę niezawierającą odwrotnej transkryptazy (nRT), aby wykazać czystość odzyskanego RNA. Przy progu 0,1 transkrypty gyrB wykryto w średnim cyklu 21,1, 20,3 i 20,5. Kontrole nRT nie zostały wykryte, dopóki średnie cykli 35,9, 35,5 i 35,0. n = 3 kontrpróby biologiczne, zawierające 3 kontrpróby techniczne/kontrpróbę biologiczną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywna regeneracja wirusowego RNA. Sześć dni po wkropleniu dotchawiczym 100 PFU/50 μL grypy A/PR/8/1934(H1N1) myszy poddano eutanazji. Płuca wycięto i zhomogenizowano, a następnie zebrano 200 μl homogenizowanej gnojowicy i przepuszczono przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm przed oczyszczeniem wirusowego RNA. Oczyszczone RNA rozcieńczano seryjnie (10-1-10-4), a następnie amplifikowano segment M grypy A. (A) Wykres amplifikacji RNA grypy A odzyskanego z zakażonego płuca i rozcieńczonego 10-1-10-4. (B) Krzywa standardowa segmentu M grypy A. Próg = 0,2, R² = 0,994, nachylenie = -3,46. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zastosowanie tego modelu zapewnia wysoce wydajną i powtarzalną metodę badania wtórnych infekcji bakteryjnych. Możliwość ścisłej kontroli dostarczania inokulum patogenu umożliwia bardziej precyzyjne obserwacje indywidualnych i kombinatorycznych efektów każdego patogenu. Nieskuteczność bardziej powszechnej drogi wkraplania donosowego prawdopodobnie przyczyniła się do rozbieżności w objętościach i stężeniach dawek obecnych w literaturze. Uzasadnione jest, że brak precyzyjnego mysiego systemu do badania wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc opóźnił wyniki identyfikujące specyficzne odpowiedzi bakteryjne, które przyczyniają się do nasilenia koinfekcji płucnych. Opracowanie powtarzalnego modelu do badania ekspresji wirulencji podczas wtórnych zakażeń bakteryjnych może doprowadzić do zidentyfikowania celów szczepionek lub leków w celu złagodzenia tych zakażeń.

Etap wkraplania dotchawiczego ma kluczowe znaczenie dla skutecznego wykrycia infekcji dolnych dróg oddechowych i dalszej analizy patogenów. Podczas nauki tej techniki pomocne może być ćwiczenie używania barwnika (zgodnie z opisem w metodach) przed podaniem materiału zakaźnego. Użycie barwnika pozwala na bezpośrednią wizualizację inokulum do dróg oddechowych. Częstym błędem, który może wystąpić, jest wprowadzenie igły do przełyku, a nie do tchawicy. Spowoduje to dostarczenie inokulum do żołądka, a nie do płuc. Aby skorygować ten błąd, odchyl igłę dalej od ciała i przełóż ją w dół do tchawicy. Po opanowaniu procedura ta jest bardzo skuteczna i może być stosowana do przeprowadzania eksperymentów na dużej liczbie myszy. Pracując partiami w celu znieczulenia myszy, wkraplanie dotchawicze można zakończyć w około 30 sekund na mysz. Ponadto wycięcie płuc można wykonać w ciągu 2 do 3 minut na mysz.

Odzyskanie żywotnego i czystego bakteryjnego RNA z zakażonych tkanek ma kluczowe znaczenie dla analizy transkryptów. RNazy są wszechobecne i mogą szybko zrujnować eksperyment¹⁵. Niektóre metody obejmują stosowanie inhibitorów RNazy; jednak stwierdziliśmy, że zamrożenie próbki w temperaturze -80 °C w RLT-ß-merkaptoetanolu lub natychmiastowe przetworzenie próbki w celu izolacji RNA przy użyciu wszystkich probówek i odczynników wolnych od RNaz jest skuteczne w zmniejszaniu zanieczyszczenia RNazą. Ponadto zalecamy oczyszczanie maksymalnie sześciu próbek jednocześnie. Uwzględnienie więcej niż sześciu próbek może spowodować wydłużenie opóźnień między etapami protokołu, które mogą doprowadzić do degradacji RNA. Po oczyszczeniu należy również zachować ostrożność, aby uniknąć niepotrzebnych cykli zamrażania i rozmrażania. W związku z tym, jeżeli na jednej próbce zostanie przeprowadzonych wiele analiz, zaleca się porcjowanie oczyszczonego RNA do przechowywania w temperaturze -80 °C.

Oprócz technik omówionych w niniejszym dokumencie, metoda ta może być uzupełniona poprzez wykonanie płukania pęcherzyków oskrzelowych przed wycięciem i homogenacją płuc¹⁶. Można to osiągnąć poprzez płukanie całych dolnych dróg oddechowych lub za pomocą nici do szwów w celu ograniczenia jednego rozgałęzionego ramienia drzewa oskrzelowego, a następnie płukania przez pozostałą gałąź. Często prowadzi to do zmniejszenia odzyskiwania ładunku patogenu, ale zapewnia próbkę, na podstawie której można uzyskać informacje, takie jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej, tożsamość populacji komórkowej i profile cytokin¹⁶. Razem dane te mogą przyczynić się do pełniejszego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen zachodzących podczas wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc.

Chociaż omawiane metody dotyczyły wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, można je rozszerzyć na dowolny mysi model infekcji dolnych dróg oddechowych; W szczególności te, które skorzystałyby na ściśle kontrolowanym dostarczaniu i odzyskiwaniu zainstalowanego inokulum. Ponadto, podobnie jak wiele innych dróg zakażenia, wkraplanie dotchawicze może być wykorzystywane w zastosowaniach niezakaźnych, takich jak podawanie leków i związków środowiskowych¹².

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lysing Matrix B	MP Biomedicals	6911100	Określany w tekście jako "kulki krzemionkowe 0,1 mm"
jest igła o rozmiarze 21	SAI	B21-150	1,5".
Zestaw DNaz wolnych od RNaz	Qiagen	79254	DNaza użyta w załączonym tekście.
FastPrep-24 Classic Instrument	MP Biomedicals	116004500	FastPrep FP120 nie jest już dostępny. Określany w tekście jako "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents	Applied Biosystems	4405543	Influenza A segment qRT-PCR kit.
Stanowisko do intubacji	Kent Scientific	ETI-MES-01	Określane w tekście jako "platforma do intubacji". Platforma do intubacji użyta w załączonym filmie została wykonana we własnym zakresie.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Zestaw do oczyszczania RNA; zawiera kolumny RNeasy, bufor RLT, bufor RW1 i bufor RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904	Zestaw do oczyszczania wirusowego RNA.
Młynki	do tkanek Thermo Fisher Scientific	02-542-08
2-merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)	Calbiochem	UN2966