Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Summary

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Abstract

Rozwój neuronów jest regulowany przez złożoną kombinację czynników środowiskowych i genetycznych. Ocena względnego udziału każdego składnika jest skomplikowanym zadaniem, które jest szczególnie trudne w odniesieniu do rozwoju interneuronów korowych (CI) kwasu γ-aminomasłowego (GABA)ergiczne. CI są głównymi neuronami hamującymi w korze mózgowej i odgrywają kluczową rolę w sieciach neuronalnych, regulując zarówno aktywność poszczególnych neuronów piramidowych, jak i oscylacyjne zachowanie zespołów neuronalnych. Są one generowane w przejściowych strukturach embrionalnych (wypukłości przyśrodkowe i ogonowe zwojowe - MGE i CGE), które są bardzo trudne do skutecznego celowania przy użyciu metod elektroporacji in utero. Komórki progenitorowe interneuronów migrują na duże odległości podczas normalnego rozwoju embrionalnego, zanim zintegrują się w obwodzie korowym. Ta niezwykła zdolność do rozpraszania się i integrowania z rozwijającą się siecią może zostać przejęta przez przeszczepienie embrionalnych prekursorów interneuronów do wczesnej kory gospodarza po urodzeniu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół, który umożliwia modyfikację genetyczną komórek progenitorowych interneuronów embrionalnych za pomocą ogniskowej elektroporacji ex vivo. Te zmodyfikowane prekursory interneuronów są następnie przeszczepiane do wczesnej kory pourodzeniowej gospodarza, gdzie dojrzewają do łatwych do zidentyfikowania implantów ślimakowych. Protokół ten pozwala na użycie wielu genetycznie kodowanych narzędzi lub zdolność do regulowania ekspresji określonych genów w progenitorach interneuronów, w celu zbadania wpływu zmiennych genetycznych lub środowiskowych na dojrzewanie i integrację implantów ślimakowych.

Introduction

Funkcja sieci neuronalnych polega na istnieniu zrównoważonego zestawu neuronów projekcyjnych pobudzających i interneuronów hamujących. Chociaż interneurony korowe (CI) stanowią tylko 20% wszystkich neuronów w korze mózgowej ssaków, uważa się, że deficyty w ich liczbie lub funkcji odgrywają kluczową rolę w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych^1,2. Badanie rozwoju implantów ślimakowych jest trudne, ponieważ implanty ślimakowe są generowane w przejściowych strukturach embrionalnych, które są trudno dostępne, i podążają za długą migracją styczną, zanim dotrą do paliusza i rozwiną swoje dojrzałe właściwości anatomiczne i fizjologiczne³. Znane są zarówno mechanizmy genetyczne, jak i środowiskowe, które regulują rozwój CI⁴, ale okazało się, że trudno jest zbadać względny udział wielu czynników.

Wiele wglądów w rozwój CI uzyskano przy użyciu systemów hodowli in vitro po wyizolowaniu progenitorów z wyniosłości zwojowych5^,6. Jedną z wielkich zalet tych metod jest możliwość znakowania i genetycznej modyfikacji wyizolowanych komórek progenitorowych oraz szczegółowego śledzenia ich różnicowania, w celu wykrycia zmian autonomicznych komórek. Jednak metody te nie są w stanie dostarczyć informacji na temat interakcji między rozwijającymi się interneuronami a aktywną siecią. Dostosowaliśmy te protokoły poprzez przeszczepienie zmodyfikowanych prekursorów do wczesnej kory postnatalnej. Komórki progenitorowe interneuronów wyizolowane z eminencji embrionalnych zwojów są w stanie przetrwać, rozproszyć się i zintegrować z siecią gospodarza po przeszczepieniu do kory mózgowej^7,8. Metoda ta została zastosowana w celu zmniejszenia nasilenia napadów padaczkowych w genetycznych modelach myszy i została zaproponowana jako możliwa nowa terapia różnych zaburzeń neurorozwojowych^9,10. Poprzedni protokół opisuje procedurę transdukcji tych prekursorów za pomocą wektorów wirusowych przed przeszczepami¹¹. Opisany przez nas protokół również pozwala na genetyczną modyfikację interneuronów, ale nie wymaga tworzenia wektora wirusowego, wymagając jedynie plazmidowego DNA, co znacznie zwiększa jego elastyczność. Niektóre badania wykazały sukces w zastosowaniu elektroporacji in utero do genetycznej modyfikacji prekursorów interneuronów w wyniosłościach zwojów ogonowych (CGE)¹², ale ta metoda okazała się bardzo trudna do odtworzenia.

W sekcji wyników reprezentatywnych ilustrujemy użycie tej metody do wyrażania receptorów projektanta aktywowanych wyłącznie przez (DREADDs¹³) w przeszczepionych CIs, metodzie, której użyliśmy w niedawnej publikacji¹⁴. Wyraziliśmy hM3D (Gq), zmodyfikowany receptor oparty na ludzkim receptorze cholinergicznym CHRM3, który nie wpływa na funkcje neuronów, chyba że wiąże swój specyficzny ligand - N-tlenek klozapiny (CNO). Podanie CNO selektywnie wyzwala aktywację komórek wykazujących ekspresję hM3D (Gq). Użyliśmy tej metody, aby pokazać, że autonomiczna i przejściowa depolaryzacja komórek jest wystarczająca, aby zapobiec apoptozie CI podczas rozwoju¹⁴. W połączeniu z różnymi genetycznie kodowanymi narzędziami, protokół ten ma potencjał do zwiększania lub zmniejszania ekspresji genów oraz wizualizacji lub manipulowania aktywnością komórek na różnych etapach różnicowania interneuronów.

Protocol

Zwierzęta były hodowane i trzymane zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii (1986).

UWAGA: W celu wygenerowania konstrukcji pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, fragment SalI-StuI, zawierający sekwencję hM3D(Gq), został wyizolowany z plazmidu 50463 (Addgene) i wstawiony do wektora ekspresji pCAGGs-RFP (prezent od F. Guillemot) trawionego za pomocą XhoI-EcoRV.

1. Przygotowanie plastrów kory mózgowej zarodka myszy

1. Sterylizować sprzęt laboratoryjny (np. mikroskopy stereoskopowe) i powierzchnie (np. stoły) odpowiednim rozpuszczalnikiem detergentowym i 70% roztworem etanolu (EtOH) w wodzie (_H2O).
2. Używaj narzędzi preparacyjnych, które zostały autoklawizowane i utrzymuj je cały czas w 100% EtOH.
3. Przygotować trzy 20 ml porcji 4% agarozy o niskiej temperaturze żelowania w 1x roztworze buforu fosforanowego (PBS), w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 55 °C.
4. Uśmiercać ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy w 13,5 lub 14,5 dniu ciąży (dzień embrionalny E13.5-E14.5).
5. Za pomocą nożyczek preparacyjnych otwórz brzuch ciężarnych myszy, usuń rogi macicy (wraz z zarodkami) i umieść je w lodowatym roztworze Krebsa (Tabela 1) na szalce Petriego o średnicy 90 mm.
6. Za pomocą prostych cienkich kleszczyków studenckich otwórz worki owodniowe, usuń zarodki i przenieś je do świeżego, lodowatego roztworu Krebsa, na nowej szalce Petriego o średnicy 90 mm. Wypreparuj mózg zarodka myszy (przodomózgowie, śródmózgowie, tyłomózgowie) od reszty ciała zarodka.
7. Trzymając wypreparowane mózgi z tyłomózgowia, przenieś je w lodowatym roztworze Krebsa na nową 90-milimetrową szalkę Petriego i trzymaj na lodzie.
8. Wodoodpornym pisakiem narysuj prostą linię na zewnętrznej powierzchni, pośrodku dolnej części sześciu szalek Petriego o średnicy 35 mm.
9. Umieścić jedną 4% nisko żelującą agarozę/PBS 20 ml podwielokrotność w temperaturze 37 °C na 5 minut. Natychmiast po tym ubogie 10 ml umieścić na dwóch 35-milimetrowych szalkach Petriego i zasadzić wypreparowane mózgi.
   nuta: Opuszki węchowe powinny być skierowane w dół (spód szalki Petriego). Osadź 3-4 mózgi na szalce Petriego, wyrównaj je w narysowanej wcześniej linii prostej. Pozostaw 3−5 mm odstępu między każdymi dwoma mózgami.
10. Powtarzaj kroki 1.8 i 1.9, aż wszystkie wypreparowane mózgi zostaną osadzone.
11. Umieść osadzone mózgi w temperaturze 4 °C, aby agaroza zastygła, a następnie pokrój trzy mózgi w jeden blok o odpowiedniej wielkości i orientacji.
    nuta: Pozostaw około 3 mm wokół krawędzi próbek mózgu. Zmień orientację mózgów, z opuszkami węchowymi na górze.
12. Przyklej blok do powierzchni podstawy mikrotomu i za pomocą ostrza chirurgicznego przetnij całą dolną część bloku, między każdym z dwóch mózgów, aby utworzyć 3 niezależne bloki (każdy mini blok zawiera jeden mózg).
13. Pokrój bloki w lodowatym roztworze Krebsa na plastry o grubości 250 μm, używając mikrotomu z wibrującymi ostrzami.
14. Za pomocą wygiętej mikroszpatułki o płaskim końcu zbierz tylko plastry zawierające wypukłości przyśrodkowe lub ogonowe (MGE lub CGE; Rysunek 1) i pojedynczo przenieść je na membrany filtracyjne (średnica 13 μm, wielkość porów 8,0 μm), unoszące się na minimalnej ilości niezbędnego podłoża (MEM, tabela 1) w polistyrenowych naczyniach do hodowli organów w studzience środkowej (60 mm x 15 mm).
15. Umieścić szalki w inkubatorze do hodowli tkankowych CO₂ w temperaturze 37 °C na 1 godzinę i przygotować do elektroporacji ogniskowej.

2. Ostra elektroporacja wycinka mózgu

1. Przed rozpoczęciem procedury elektroporacji należy przygotować 50 ml 1% żelu agarozowego na 100 mm szalce Petriego. Pozostaw żel agarozowy do zestalenia się w temperaturze pokojowej (RT) na około 30 minut.
2. Przygotować maleńkie kolumny agarozowe (o średnicy 1 mm i długości 10 mm), przedziurkowane szklaną pipetą (o długości 225 mm; pojemność 2 ml) i przenieść je do lodowatych roztworów Krebsa.
   nuta: Do pipety przymocowana jest gumowa gruszka z zakraplaczem odpowiednia do pipet o pojemności 2 ml, a po jej naciśnięciu kolumna może zostać uwolniona ze szklanej pipety do roztworu Krebsa.
3. Za pomocą ostrza chirurgicznego wytnij małe bloki agarozy o dwóch rozmiarach: mały, który będzie pasował do powierzchni elektrody (patrz poniżej) i większy, który posłuży jako podstawa do wykonania ogniskowych zastrzyków DNA do wycinków mózgu. Przenieś bloki agarozy do lodowatego roztworu Krebsa.
4. Przygotuj zestaw do iniekcji ogniskowych i ostrej elektroporacji (Rysunek 2).
   nuta: Do iniekcji potrzebny jest następujący sprzęt: 1) stereoskop do preparowania w jasnym polu, 2) pneumatyczny wtryskiwacz pikopompy, 3) mikromanipulator, 4) statyw magnetyczny i 5) stalowa płyta podstawy. Do elektroporacji ostrych plastrów potrzebny jest następujący sprzęt: 1) jedna kwadratowa platynowa elektroda na szalkę Petriego o średnicy 10 mm, 2) jedna kwadratowa platynowa elektroda osłonowa o średnicy 10 mm, 3) mikromanipulator i 4) elektroporator.
5. Ogniskowe iniekcje DNA
   1. Przygotować mieszaninę DNA wektorów ekspresyjnych: pCAGGs-IRES-GFP (wektor kontrolny) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, w stężeniu 1 μg/μL dla każdego wektora i dodać szybki zielony roztwór (zapas 25 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:10.
   2. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę (0,5 mm średnicy wewnętrznej i 1 mm średnicy zewnętrznej) 10 μl mieszaniny DNA i wstrzyknij niewielkie ilości (w zakresie 25-50 nL) do wybranego regionu (MGE/CGE) wycinka (Rysunek 1 i Rysunek 2).
6. Ostra elektroporacja
   nuta: Elektroporację należy wykonać natychmiast po ogniskowej iniekcji DNA.
   1. Umieść mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i przymocuj kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej za pomocą płaskiej mikroszpatułki.
   2. Przenieś plasterek z membraną podtrzymującą na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozy na wybranym obszarze (MGE/CGE) plasterka.
      UWAGA: Napięcie ładowania 125 V (dwa impulsy po 5 ms każdy, interwał 500 ms) zapewni udaną elektroporację (Rysunek 3).
7. Po elektroporacji umieścić plaster wraz z membraną podtrzymującą w naczyniu i przenieść naczynie do inkubatora do hodowli tkankowych CO₂ w temperaturze 37 °C.
8. Po 1 godzinie wymienić pożywkę MEM na pożywkę zasadową odpowiednią dla pierwotnych kultur neuronalnych (pożywka podstawowa neuronu; Tabela 1) i inkubować plastry przez noc, przez około 18-24 godziny.

3. Przygotowanie przeszczepów komórkowych

1. Sprawdź skuteczność elektroporacji we wszystkich plastrach. Zaznacz tylko te wycinki, w których zaobserwowano akceptowalną liczbę komórek fluorescencyjnych (Rysunek 3).
   nuta: Elektroporację około 30 plastrów na eksperyment w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek do szczepienia (patrz poniżej).
2. Wypreparuj wybrany obszar (MGE/CGE) z każdego wycinka i pokrój tkankę na małe kawałki w lodowatym roztworze Krebsa, pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
3. W międzyczasie umieść probówkę o pojemności 1,5 ml z 900 μl pożywki zasadowej neuron w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Przenieść kawałki tkanki za pomocą mikropipety P1000 do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl pożywki L15/DNazy przygotowanej przez dodanie 100 μl 1 mg/ml zapasu DNazy w pożywce DMEM/F12 do 900 μl pożywki L15. Umyj kawałki chusteczek, stukając.
5. Dodaj 100 μl DNazy (zapas 1 mg/ml w pożywce DMEM/F12) do 900 μl pożywki zasadowej neuronu.
6. Odrzuć pożywkę L15/DNazy i ponownie zawieś fragmenty tkanki w 200 μl pożywki neuronowej/DNazy przygotowanej w kroku 3.5.
7. Ustawić mikropipetor P200 na 180 μl i mechanicznie dysocjować kawałki tkanki, delikatnie pipetując w górę i w dół, 20-30 razy, aż do uzyskania gładkiej i "kremowej" zawiesiny.
8. Dodać 200 μl pożywki neuron basic/DNazy (końcowa całkowita objętość 400 μl) i ponownie zawiesić.
9. Pobrać 4 μl porcji komórek, odpowiednio rozcieńczyć i zamontować na hemocytometrze.
10. Pod mikroskopem jasnego pola sprawdź skuteczność dysocjacji i policz liczbę komórek.
    nuta: Jeśli dysocjacja się powiedzie, zaobserwuje się jasne (żywe) pojedyncze komórki, a nie agregaty komórkowe.
11. Odwirować zawiesinę komórek od kroku 3.8, przy 1,000 obr./min, w temperaturze pokojowej, przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant z probówki i dodać odpowiednią pożywkę L15/DNazy (zwykle 5-7 μL), tak aby końcowe stężenie komórek wynosiło 8 x 10 5-1,2 x 10⁶ komórek/μL.
    nuta: Podczas zawieszania niezwykle ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza.
12. Umieścić podwielokrotność komórek na lodzie i podać dodatkową pożywkę L15/DNazę do wstrzykiwań.

4. Zastrzyki wewnątrzczaszkowe

UWAGA: Następujące procedury odbywają się w sali zabiegowej w Domu dla Zwierząt. Ponieważ komórki zostaną wstrzyknięte bezpośrednio do mózgu nowonarodzonych szczeniąt bez odsłaniania mózgu, warunki aseptyczne są utrzymywane poprzez sterylizację przestrzeni roboczej 70% roztworem EtOH i użycie autoklawowanych szklanych igieł. Do wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych potrzebny jest następujący sprzęt: 1) stereomikroskop do preparacji w jasnym polu, 2) mikrowstrzykiwacz i 3) poduszka grzewcza do rekonwalescencji myszy.

1. Przygotuj szklaną igłę, ciągnąc igły zgodnie z zaleceniami producenta. W tym protokole stosuje się igły szklane o średnicy zewnętrznej 80 μm, średnicy wewnętrznej 40 μm i skosie 30°.
   nuta: Jak wspomniano powyżej, igły należy sterylizować w autoklawie przed użyciem.
2. Ręcznie napełnić igłę biologicznie obojętnym olejem za pomocą igły o sile 30 g i 2 cali i strzykawki.
3. Zamontować i włożyć igłę do zespołu wtryskiwacza zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Określić ustawienia wstrzykiwania przy maksymalnej objętości (69 nL) i względnie niskiej szybkości (23 nL/s).
5. Opróżnij igłę, aż tłok zostanie całkowicie wysunięty.
6. Napełnij igłę.
   1. Wytnij mały kawałek z taśmy do szczepienia i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym do analizy w jasnym polu. Za pomocą mikropipety P10 przenieś 5 μl z próbki (podwielokrotność komórki) na taśmę, tak aby powstała kulista kropla.
   2. Umieścić końcówkę igły w próbce i napełnić igłę (tłok chowa się i wciąga próbkę razem z nią).
      nuta: Ponieważ próbka powinna być dość lepka, napełniaj igłę małymi krokami, aby próbka się zrównoważyła, i powoli, co zapobiega tworzeniu się pęcherzyków. Próbka powinna być gładka i jednorodna w obrębie igły. Jeśli próbka jest zbyt lepka i nie jest możliwe napełnienie igły, należy dodać tyle pożywki L15/DNazy, ile jest wymagane do uzyskania prawidłowej lepkości. Niemniej jednak zmieni to stężenie próbki i najlepiej tego unikać.
7. Znieczulanie nowonarodzonych szczeniąt (dzień po porodzie 0-2 [P0-P2]) na lodzie przez 2-5 min.
   nuta: Upewnij się, że szczeniak się nie rusza.
8. Umieść znieczulone szczenię pod stereomikroskopem preparacyjnym w jasnym polu.
9. Wykonaj 3-4 wstrzyknięcia po 69 nL każde w każdą półkulę.
   nuta: Miejsca wstrzyknięcia znajdują się około 1 mm bocznie do linii środkowej i między 1 mm ogonowo do bregma i 1 mm rostralnie do linii międzyusznej. Końcówka igły powinna być umieszczona na głębokości około 1 mm w stosunku do powierzchni igły. Po każdym wstrzyknięciu igłę pozostawia się na miejscu przez około 30 s i okresowo wyjmuje.
10. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić szczeniaka na poduszce grzewczej przy najniższym ustawieniu grzania (37 °C). Kiedy młode wyzdrowieje, przenieś je do klatki z matką.
    nuta: Nigdy nie zostawiaj matki bez szczeniąt w klatce. Cała procedura (od momentu odebrania szczeniaka od rodzeństwa, aż do jego powrotu) powinna trwać mniej niż 10 minut.

5. Zastrzyki z N-tlenku klozapiny

1. Przygotować ligand DREADD, roztwór podstawowy CNO, rozcieńczając 1 mg CNO w 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty. Uzupełnić do 10 ml solą fizjologiczną, aby końcowe stężenie CNO wynosiło 0,1 mg/mL.
   nuta: DMSO jest toksyczny. Unikaj używania go do stężenia wyższego niż 0,1%. Jako kontrolę należy użyć roztworu soli fizjologicznej o takim samym stężeniu DMSO, jak roztwór zawierający CNO.
2. Od 14 dnia po urodzeniu i przez 3 kolejne dni (P14-P16) u każdej myszy należy wykonać dwa wstrzyknięcia dootrzewnowe (I.P.) CNO (stężenie CNO: 1 mg/kg) lub 0,05% DMSO w soli fizjologicznej, dziennie, w odstępie 12 godzin.
3. Ostatniego dnia (P17) należy wykonać pojedyncze wstrzyknięcie i złożyć ofiarę myszy przez zwichnięcie szyjki macicy w czasie 30 min-1 h.

Results

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, sprawdziliśmy, czy przeżywalność interneuronów korowych we wczesnych stadiach postnatalnych jest regulowana przez aktywność w sposób autonomiczny dla komórki. Przeprowadziliśmy 3 eksperymenty elektroporacji wycinków mózgu (12-16 zarodków [E14,5 zarodków] na eksperyment) z wektorami ekspresji pCAGGs-IRES-GFP (kontrola) i pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, w stężeniu 1 μg / μL dla każdego konstruktu. W naszych eksperymentach z elektroporacją tylko ułamek (około 50%; Rysunek 3) neuronów GFP⁺ ulegało koekspresji hM3D(Gq) (RFP⁺), a zatem populacja GFP⁺RFP^- służyła jako wewnętrzna kontrola wpływu ligandów DREADD. Transfekowane interneurony embrionalne kory mózgowej zostały mechanicznie zdysocjowane, a powstała zawiesina komórek (8 x 10⁵ komórek / μL) przeszczepiono w korze myszy typu dzikiego P0-P1. Wykonaliśmy 6 zastrzyków na mózg. W każdym eksperymencie wstrzyknięto co najmniej 6 nowo narodzonych szczeniąt. Podawanie CNO selektywnie zwiększało aktywność transfekowanych komórek RFP⁺, o czym świadczy ekspresja białka zależnego od aktywności cFos (Figura 4). Leczenie CNO zgodnie z opisanym protokołem (podawać dwa razy dziennie P14-P17) spowodowało wzrost proporcji komórek GFP⁺RFP⁺ w stosunku do komórek GFP⁺RFP^- w porównaniu z podłożem (0,5% DMSO w soli fizjologicznej) podawanym rodzeństwu z miotu (ryc. 5).

Rycina 1: Reprezentatywne wycinki kresomózgowia używane do eksperymentów z ostrą elektroporacją. (A-C) Plastry kresomózgowia uzyskane na trzech różnych sekwencyjnych poziomach rostro-ogonowych, barwione 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). LGE: wyniosłość zwoju bocznego; MGE: wyniosłość zwoju przyśrodkowego; CGE: wyniosłość zwoju ogonowego. Podziałka = 200 μm. Żółte gwiazdki wskazują miejsce elektroporacji w każdym plasterku. Biała linia wyznacza krawędź wyniosłości zwojowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy. (A) Wycinki mózgu myszy są elektroporowane odpowiednimi konstruktami, a (B) po 12 godzinach zmodyfikowane prekursory interneuronów korowych (CI) są izolowane i (C) przeszczepiane do paliusza nowonarodzonych młodych myszy (P0−P2). W celu modyfikacji aktywności niedojrzałych implantów ślimakowych, szczeniętom P14, którym przeszczepiono komórki, wstrzyknięto CNO lub nośnik przez cztery dni konstytutywne zgodnie z przedstawionym protokołem. (A') Zdjęcie zestawu do elektroporacji ostrego wycinka mózgu myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Reprezentatywny udany eksperyment z elektroporacją ostrych plastrów. (A) Reprezentatywny wycinek koronalny z mózgu zarodka E14.5 transfekowany w CGE zarówno plazmidami pCAGGs-IRES-GFP (GFP), jak i pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) i hodowany przez 12 godzin. Sekcja została wybarwiona immunologicznie w kierunku GFP (A, B, C) i RFP (A, B, D). Obszar ramki w panelu A jest powiększony, aby pokazać ekspresję zarówno reporterów fluorescencyjnych (B), GFP (C), jak i tylko RFP (D). Biała linia wyznacza krawędź wyniosłości zwojowej. B-D: to samo zdjęcie, różne kanały lub kombinacja dwóch różnych kanałów. Podziałka = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Ten rysunek został zmodyfikowany z Denaxa et al.¹⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Autonomiczny wzrost aktywności przeszczepionych implantów ślimakowych z ekspresją M3D (Gq) po podaniu CNO. (A-D) Reprezentatywne obrazy konfokalne przekroju koronalnego myszy P17 przeszczepionej w P1 z prekursorami CI transfekowanymi plazmidami pCAGGs-IRES-GFP (GFP) i pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) i traktowane CNO. Sekcja została wybarwiona immunologicznie pod kątem GFP (A), RFP (B) i cFos (C). (D) Połączony obraz immunofluorescencji A, B i C (combo). Należy zauważyć, że tylko CI współeksprymujące oba plazmidy (białe strzałki w AD) są również cFos⁺ w porównaniu z CI wyrażającymi tylko plazmid kontrolny GFP (żółte strzałki w AD). (E) Kwantyfikacja komórek cFos ⁺ RFP ⁺ znalezionych w paliusiu myszy P17 przeszczepionych w P1 (znormalizowane do całkowitej populacji RFP⁺) i potraktowanych nośnikiem lub CNO (N = 2). A-D: to samo zdjęcie, różne kanały lub kombinacja trzech różnych kanałów. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Autonomiczny wzrost aktywności implantów ślimakowych zwiększa przeżywalność. (A-D) Reprezentatywne obrazy konfokalne wycinków koronalnych kory somatosensorycznej myszy P17 przeszczepionych w P0-P2 z prekursorami CI transfekowanymi zarówno plazmidami pCAGGs-IRES-GFP (GFP), jak i pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) i traktowanymi nośnikiem (AB) lub CNO (C-D). (E) Kwantyfikacja komórek RFP⁺ znalezionych w przodomózgowiu myszy P17 przeszczepionych w P0-P2 (znormalizowane do całkowitej populacji GFP⁺). RFP⁺(nośnik) = 47% ± 3%, CNO = 61% ± 3%, p = 0,01, test t próby sparowanej Studenta, n = 3 nośniki i 3 CNO, minimum 150 komórek zliczonych na mózg. A i B: to samo zdjęcie, różne kanały. C i D: to samo zdjęcie, różne kanały. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Denaxa et al.¹⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Dodatkowe informacje dotyczące nośników używanych w tym protokole.

Discussion

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię genetycznej modyfikacji aktywności prekursorów CI w celu zbadania wpływu wewnętrznej aktywności na dojrzewanie CI i/lub wpływu CI modulowanych aktywnością na montaż/funkcję zintegrowanych obwodów korowych.

W przeszłości kilka laboratoriów, w tym nasze, przeprowadziło eksperymenty z elektroporacją in utero w celu genetycznej modyfikacji neuronów projekcyjnych⁶. Jednak elektroporacja in utero do wypukłości zwojowych, które obejmują przodków CI, jest bardzo trudna ze względu na problemy ze ścieżką przewodnictwa elektrycznego. Aby rozwiązać ten problem, niewielka liczba laboratoriów wykonuje zastrzyki pod kontrolą ultradźwięków, a następnie elektroporację, która jest wymagającą techniką wymagającą drogiego sprzętu. Protokół ten stanowi alternatywę dla tych metodologii, która jest dostępna dla większości społeczności naukowej.

Jednym z najtrudniejszych aspektów tego protokołu jest maksymalizacja liczby komórek, które przeżywają w korze gospodarza do etapów dojrzałych, kiedy zwykle przeprowadza się analizę fenotypową (bardzo zależy to od projektu eksperymentu, ale zwykle jest starsze niż P17). Istnieją trzy kluczowe kroki, na które badacz powinien zwrócić uwagę: (1) Skuteczność elektroporacji. Można to zmaksymalizować, zapewniając czystość plazmidów DNA. Do tej procedury należy stosować wyłącznie plazmidy DNA wysokiej jakości (stosunek A₂₆₀/_{A 280} 1,9-2,0). Tak wysokiej jakości preparaty DNA uzyskujemy dzięki zastosowaniu oczyszczania DNA chlorkiem cezu. Innym kluczowym czynnikiem jest promotor, który napędza ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania. Odkryliśmy, że wektor pCAGGs, który składa się z promotora b-aktyny kurczaka, jest niezwykle silny i może znacznie zwiększyć wydajność elektroporacji. (2) Liczba zarodków dawcy od dawcy. Ważne jest, aby upewnić się, że duża liczba (12-16) zarodków w tym samym stadium jest elektroporanowana. Liczba ta może zostać zwiększona, jeśli więcej eksperymentatorów przeprowadza sekcje zarodków i sekcje razem, ponieważ ważne jest, aby zarodkowe wycinki kory mózgowej zostały uzyskane, elektroporowane i przeniesione do inkubatora tak szybko, jak to możliwe. (3) Ważne jest, aby upewnić się, że każdemu młodemu wstrzykuje się dużą liczbę komórek, aby zapewnić wysoką szansę na przeżycie przeszczepionej komórki do osiągnięcia dojrzałości. Ponadto znacznie zwiększy to prawdopodobieństwo udanych przeszczepów, ponieważ^preparaty komórkowe o niskiej gęstości spowodują nierównomierne mieszanie komórek z pożywką, co spowoduje znaczną zmienność w przeszczepionych mózgach.

Opisany tutaj protokół został dostosowany do badania roli aktywności w regulacji przeżycia implantu ślimakowego w sposób autonomiczny dla komórki. Okno czasowe P14-P17 do wykonywania iniekcji CNO zostało specjalnie wybrane zgodnie z opublikowanymi danymi, które pokazują, że szczyt śmierci komórek progenitorowych przeszczepionych implantów ślimakowych występuje w tym okresie¹⁶. W związku z tym ten przedział czasowy lub częstotliwość wstrzyknięć CNO może nie być prawdziwa dla innych typów komórek lub regionów mózgu, a badacz powinien dostosować te parametry zgodnie z określonymi celami eksperymentalnymi. Wreszcie, opisana tutaj metodologia dla wewnątrzczaszkowych wstrzyknięć CI jest wykonalna tylko dla szczeniąt P0-P5 (w zależności również od tła linii myszy). Zasadniczo, wszelkie wstrzyknięcia powyżej P5 będą wymagały rozrzedzenia lub usunięcia czaszki¹⁵.

Jedną z kluczowych zalet tego protokołu jest możliwość wykorzystania nowych narzędzi kodowanych genetycznie do wizualizacji lub manipulowania aktywnością implantów ślimakowych na różnych etapach różnicowania, gdy integrują się one z rozwijającą się siecią. Wraz z tempem odkrywania nowych genetycznie kodowanych czujników napięcia i wapnia, a także nowych narzędzi chemogenetycznych i optogenetycznych, protokół ten pozwala naukowcom na wykorzystanie ich w ciągu kilku tygodni od uwolnienia do repozytoriów plazmidowych, takich jak Addgene.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium/Suplementy
B-27	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	175040-044
DMEM/F12	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21331-020
DNAse	SIGMA	DN15-100MG
FBS	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	10270-098
100x Glutamina	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	35050-061
L15	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	11415-049
MEM alfa, GlutaMAX	GIBCO ( ThermoFisher Scientific)	32561-029
Podłoże neuropodstawowe	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	21103-049	Pożywka podstawowa Neuron
100x P/S	GIBCO (ThermoFisher Scientific)	15140-122
Sprzęt
Electroporator	BTX	ECM 830 Generator
Wtryskiwacz do ostrej Elektroporacja plastrów	Eppendorf	FemtoJet Microinjector
Injector do przeszczepu komórek (I)	Visual Sonics	Vevo Injector System
Injector Injector do przeszczepu komórek (II)	WPI	NANOLITER2010
Stojak magnetyczny	WPI	M10L Stojak
Kite Ręczny mikromanipulator	WPI	KITE-M3-R
Platinum Elecrode (i)	Protech Międzynarodowa Sp. z o.o.	CUY-700-1
Platynowy Elekrode (II)	Protech International Inc.	CUY-700-2
Stalowa płyta podstawy	WPI	5479
Vibratome	Leica	VT1200S
Inny materiał
szklany kapilar do elektroporacji	VWR	1B100-4
Szklane kapilary do przeszczepu komórek	Sonics	dostarczone przez  Visual Sonics
Nuclepore 8 i mikro; m Membrana Whatmana	SLS	110414
Naczynia do hodowli tkanek narządowych	BD Biosciences (Falcon)	353037