Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59577

⸱

17 lipca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, The University of Kansas School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Streszczenie

Samoorganizacja białek zarządza funkcją białka i rozdziela procesy komórkowe w przestrzeni i czasie. Obecne metody badania cierpią z powodu niskiej czułości, pośrednich odczytów, ograniczonej przepustowości i/lub rozdzielczości na poziomie populacji, a nie rozdzielczości pojedynczej komórki. Zaprojektowaliśmy pojedynczą metodologię opartą na cytometrii przepływowej, która rozwiązuje wszystkie te ograniczenia: rozproszony fret amfifluorowy lub DAmFRET. DAmFRET wykrywa i określa ilościowo samoorganizację białek za pomocą uczulonej emisji FRET in vivo, umożliwia wdrożenie w różnych systemach modelowych - od drożdży po komórki ludzkie - i osiąga czułe, jednokomórkowe, wysokoprzepustowe odczyty niezależnie od lokalizacji lub rozpuszczalności białek.

Wprowadzenie

Testy do badania homotypowych interakcji białek, czyli "samoorganizacji" są ważne, ponieważ stan oligomeryczny i rozpuszczalność białek dyktują ich funkcję. Proteom obfituje w homo-multimery1,2,3,4, podczas gdy stosunkowo niewiele białek funkcjonuje jako monomery. Białka mogą również gromadzić się w nieprawidłowy sposób z powodu stresu, wieku lub niewłaściwej regulacji, co prowadzi do patologicznych zmian w aktywności. Zidentyfikowanie czynników, które modulują takie zdarzenia, a nawet fizycznej natury zgromadzeń, jest często wyjątkowo trudne.

Coraz większa liczba białek jest obecnie uznawana za samoorganizujące się z niezwykłą kooperatywnością i nieokreśloną stechiometrią, co skutkuje ich wymieszaniem z innymi składnikami komórkowymi, jako fazy gęste od białek. Przybierają one postać nieuporządkowanych kondensatów, takich jak kropelki i żele, lub wysoce uporządkowanych włókien, takich jak włókna amyloidowe. Fluktuacje konformacyjne związane z tym ostatnim sprawiają, że jego początkowe powstawanie, czyli zarodkowanie, jest z natury probabilistyczne na poziomie molekularnym5,6. Ponieważ prawdopodobieństwo zarodkowania skaluje się wraz z objętością, powstawanie takich zespołów może być wysoce stochastyczne w przestrzennych granicach żywych komórek7,8. Na krańcu stochastycznej separacji faz ograniczonej zarodkowaniem znajdują się priony, wysoce uporządkowane zespoły białek, które rzadko zarodkują spontanicznie, ale gdy już się uformują, szablonują swój własny wzrost w nieskończoność. Jedno z takich białek, znane jako ASC, wykonuje cyfrowy przełącznik podobny do prionów w aktywności wrodzonych komórek odpornościowych ssaków. Samoorganizacja ASC jest zarodkowana przez jego interakcję ze specyficznymi białkami, które same uległy oligomeryzacji po związaniu wzorców molekularnych związanych z patogenem lub niebezpieczeństwem. Zespoły ASC z kolei zarodkują prokaspazę-1 w celu samoorganizacji i aktywacji, co prowadzi do dojrzewania cytokin i piroptozy komórki9,10. Obszar ASC odpowiedzialny za jego montaż należy do nadrodziny domeny śmierci, która składa się z ponad stu członków w proteomie człowieka. Pomimo kluczowej roli domen śmierci w odporności wrodzonej i programowanej śmierci komórki, większość z nich nie została jeszcze scharakteryzowana w odniesieniu do samoorganizacji. Odkrycie i scharakteryzowanie dodatkowych białek o takim zachowaniu będzie znacznie ułatwione dzięki bezpośredniemu, jednokomórkowemu odczytowi samoorganizacji białek.

Klasyczne podejścia biochemii białek do badania samoorganizacji białek, takie jak chromatografia wykluczająca wielkość i ultrawirowanie, są w dużej mierze ograniczone do oceny na poziomie populacji. Jednak heterogeniczność między komórkami wynikająca z ograniczonych zarodkowością przemian fazowych nie może być modelowana przy użyciu tego poziomu szczegółowości. Podejścia jednokomórkowe oparte na mikroskopii fluorescencyjnej odzyskują tę zdolność, ale brakuje im przepustowości niezbędnej do dokładnego ilościowego określenia zarodkowania lub wykrycia rzadkich zespołów. Co więcej, rozpuszczalne samoorganizacje, takie jak większość enzymów i oligomerów preamyloidowych, są zbyt małe i mobilne, aby można je było rozdzielić za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Można je wykryć za pomocą bardziej wyrafinowanych metod, takich jak spektroskopia korelacji fluorescencji, ale są one bardzo ograniczone pod względem liczby komórek i przepustowości.

Oparte na bliskości testy składania białek, takie jak FRET i komplementacja rozszczepionego fluoroforu, oferują potencjalne rozwiązanie tych problemów. Jednak na ogół wymagają one użycia dwóch różnych konstruktów wyrażających interesujące białko połączone z komplementarnymi znacznikami - fluoroforami donorowymi i akceptorowymi w przypadku FRET. Pogarsza to przepustowość eksperymentalną, a także zmniejsza czułość ze względu na różnice między komórkami w względnych poziomach dawcy i akceptora. Aby obejść ten problem, zaprojektowaliśmy test, który wykorzystuje fotokonwertowalny fluorofor, mEos3.111, który pozwala pojedynczemu konstruktowi na ekspresję zarówno białka znakowanego donorem, jak i akceptorem. Widmo emisyjne nieprzekształconego mEos3.1 (donor podobny do GFP) wystarczająco pokrywa się z widmem wzbudzenia fotokonwertowanego mEos3.1 (akceptor podobny do dsRed), aby umożliwić wystąpienie FRET, gdy cząsteczki znajdują się w bliskiej odległości (<10 nm). W ten sposób, wystawiając komórki na empirycznie określoną dawkę światła 405 nm, która fotokonwertuje optymalną frakcję całkowitego mEos3.1 do formy akceptora, osiągamy spójne i powtarzalne względne poziomy dawcy i akceptora w wielu próbkach, poziomach ekspresji i eksperymentach. Mierzymy fluorescencję akceptora po wzbudzeniu albo bezpośrednio światłem 561 nm, albo pośrednio (przez transfer energii od dawcy) światłem 488 nm (tj. Uczulona emisja FRET). Podajemy składanie białek jako stosunek tych dwóch wartości i nazywamy go amfifluorycznym FRET lub AmFRET.

Aby obliczyć stężenie białka za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw obliczamy średnią intensywność fluorescencji Spc42 oznaczonego mEos3.1. Ponieważ komórki drożdży zawierają około 1000 cząsteczek Spc42, następnie obliczamy intensywność fluorescencji pojedynczej fluorescencyjnej zielonej cząsteczki mEos3.1. Wykorzystując równomierną fotokonwersję we wszystkich stężeniach komórkowych (Rysunek 1E), następnie korelujemy całkowite wartości fluorescencji mEos3.1 dla wszystkich intensywności akceptorów po fotokonwersji. Następnie jesteśmy w stanie podzielić całkowitą liczbę moli białek fluorescencyjnych przez przybliżoną objętość cytozolową (określoną za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej), aby uzyskać całkowite stężenie cytozolowe interesującego nas białka. Dokładne obliczenia można znaleźć w oryginalnym manuskrypcie8.

Poprzez ekspresję białka skondensowanego mEos3.1 z plazmidu 2μ w drożdżach, badamy w przybliżeniu tysiąckrotny zakres stężenia białka w każdej próbce8. To samo osiągamy w komórkach HEK293T dzięki zmienności wychwytu plazmidu podczas transfekcji, a tym samym zmiennej liczbie kopii.

Wynikowy rozkład AmFRET, lub DAmFRET, dla wielu tysięcy komórek ujawnia zależność od koncentracji samoorganizacji w cytozolu dla dowolnego interesującego białka. Ogólnie rzecz biorąc, projekt DAmFRET stanowi metodologię umożliwiającą odkrywanie i charakteryzowanie samoorganizacji białek z niespotykanym dotąd połączeniem czułości, przepustowości i odtwarzalności.

Podczas gdy korzystanie z cytometru obrazowego umożliwia nam pomiary stężenia białek in vivo, takie cytometry nie są jeszcze dostępne w większości instytucji badawczych. Niemniej jednak DAmFRET można uruchomić nawet w typowym cytometrze nieobrazującym, aby uzyskać rozkłady składania białek w zakresie ekspresji białek.

Protokół

1. Przygotowanie Saccharomyces cerevisiae do testu DAmFRET

  1. Przekształć eksperymentalnie istotne szczepy drożdży za pomocą plazmidu indukowanego galaktozą 2μ, który wyraża interesujące białko8 oznaczone na końcu C lub N za pomocą mEos3.1 przy użyciu standardowego protokołu octanu litu12 .
  2. Hoduj drożdże w płynnej kulturze.
    1. Dla każdego białka zapytania, zaszczepić kolonie drożdży (przekształcone), w trzech egzemplarzach, każda w 200 μl odpowiednich nieindukujących pożywek wzrostowych (tj. pożywki zawierającej 2% dekstrozy, drożdżowej zasady azotowej i aminokwasów do wyboru plazmidu) na 96-dołkowej płytce (Rysunek 1C).
    2. Inkubować komórki, wytrząsając na wytrząsarce płytkowej (patrz tabela materiałów) o orbicie 1,5 mm z prędkością 1200 obr./min w temperaturze 30 °C przez 16 godzin.
  3. Indukuj ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania (reprezentatywny protokół dla 16 h-niektóre białka mogą zająć więcej lub mniej czasu).
    1. Po 16 godzinach indukcji obracać płytkę o masie 2200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT0 w celu osadzenia próbek.
    2. Usuń multimedia przez wymuszone odwrócenie. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl odpowiedniej pożywki indukcyjnej (tj. pożywki zawierającej 2% galaktozy, zasady azotowej drożdży i aminokwasów do wyboru plazmidu). Zobacz Rysunek 1C.
    3. Inkubować komórki, wytrząsając w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.
    4. Odwirować (patrz tabela materiałów) płytkę o masie 2200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu osadzenia próbek. Usuń multimedia przez wymuszone odwrócenie. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl pożywki indukcyjnej.
    5. Inkubować komórki, wytrząsając z prędkością 1200 obr./min w temperaturze 30 °C przez kolejne 4 godziny. To ponowne zamieszanie w świeżych pożywkach powinno nastąpić 4 godziny przed uruchomieniem DAmFRET, w celu zmniejszenia autofluorescencji.

2. Tworzenie plazmidu u ssaków

  1. Skonstruuj wektor ssaków, który ma konstytutywny promotor i mEos3.1 z symbolem zastępczym, aby wstawić interesujący nas gen i łącznik między nimi.
    UWAGA: Skonstruowaliśmy wektor kompatybilny ze złotą bramą, M1, z publicznie dostępnego plazmidu (patrz Tabela Materiałów) z następującymi modyfikacjami: istniejące miejsce BsaI zostało usunięte przez mutację punktową G do A (w pozycji 3719 zgodnie z zdeponowaną sekwencją). mEos3.1 uzyskano za pomocą ukierunkowanej mutagenezy fluoroforu w I157V. Odwrócone miejsca BsaI, po których następuje łącznik 4x (EAAAR), zostały wstawione przez zespół Gibsona w ramce między promotorem CMV a mEos3.1 w celu wytworzenia końcowego wektora M1. Ekspresja białek jest napędzana przez wzmacniacz i promotor CMV; i zakończenie transkrypcji przez sygnał poliadenylacji SV40.
  2. Utwórz bibliotekę wstawień, zgodną ze skonstruowanym wektorem.
    UWAGA: Zamawiamy nasze wkładki do montażu Golden Gate jako syntetyczne fragmenty liniowe (patrz tabela materiałów) otoczone miejscami BsaI do ligacji do M1 między promotorem CMV a 4x(EAAAR)-mEos3.1.

3. Hodowla i transfekcja komórek ssaków

  1. Hodowla HEK293T komórek w DMEM + 10% FBS + 1x pożywka PenStrep w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  2. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewać 5 x 105 komórek na 6-dołkowej płytce z 2 ml pożywki.
  3. Komórki transfekcyjne z 2 μg plazmidowego DNA przy użyciu odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w stosunku 3:1 (odczynnik do transfekcji: DNA). Wymieszać składniki w 150 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, dodać mieszaninę do każdej studzienki i inkubować przez 48 godzin w celu ekspresji białka.
  4. Potwierdzić ekspresję białka po 24 godzinach za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (wzbudzenie 488 nm, emisja 515 nm).

4. Przygotowanie komórek ssaków do testu DAmFRET

  1. Po 48 godzinach ekspresji białka usunąć pożywkę z każdej studzienki i ostrożnie umyć komórki 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C. Po umyciu odessać PBS.
  2. Dodać 0,5 ml kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,25%) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodaj 0,5 ml kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki, ponownie zawieś komórki i upewnij się, że nie są widoczne duże grudki.
  4. Przenieś całą objętość każdej studzienki do probówek o pojemności 1,5 ml.
  5. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml PBS + 10 mM EDTA.
  7. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) + 10 mM EDTA w PBS.
  9. Zamocuj komórki na 5 minut na stole wstrząsowym ciągłym ruchem.
  10. Wiruj komórki przez 5 minut przy 1000 x g przy RT.
  11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 10 mM EDTA.
  12. Wiruj komórki przez 5 minut przy 1000 x g przy RT.
  13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu do przebiegu cytometrii (dla 1 dołka z 96-dołkowej płytki użyć 200 μl PBS + 10 mM EDTA).
  14. Przenieść zawieszone komórki do jednego dołka 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.

5. Fotokonwersja komórek drożdży i ssaków do testu

  1. Fotokonwersja próbek w mikropłytce bez pokrywy przy użyciu lampy UV (patrz Tabela Materiałów) wyposażonej w filtr 320-500 nm (fioletowy) i kolimator wiązki, umieszczony 45 cm nad płytką, przez czas 25 minut podczas wytrząsania. Warunki te są odpowiednie, gdy moc wiązki na płytce wynosi 11,25 mW/cm2, przy około 17 000 mJ/cm2 całkowitej dawki fotonów8.

6. Zbieranie danych DAmFRET

  1. Oznaczanie komórek za pomocą cytometru z niewspółliniowymi laserami 488/561. Poniższe dane stanowią minimalne wymagania dotyczące obliczania FRET.
    1. Użyj kanału wzbudzenia 488 nm / emisji 515 nm do zbierania fluorescencji dawcy.
    2. Użyj kanału wzbudzenia 488 nm / emisji 595 nm do zbierania fluorescencji sygnału FRET.
    3. Użyj kanału wzbudzenia 561 nm / kanału emisyjnego 595 nm (niewspółliniowego z kanałem 488/595) do zbierania fluorescencji akceptora.
    4. Użyj kanału wzbudzenia 405 nm / emisji 457 nm do zbierania autofluorescencji8.
    5. Wykorzystaj kanał obrazu w jasnym polu do obliczania objętości.
      UWAGA: Ustawienia cytometru obrazowego dla S. cerevisiae są następujące: obiektyw 60x przy niskim natężeniu przepływu i wysokiej czułości; moce lasera ustawione na 405 nm przy 15 mW, 488 nm przy 15 mW, 561 nm przy 20 mW. Ustawienia cytometru obrazowego dla komórek HEK293T są następujące:40-krotny obiektyw przy niskim natężeniu przepływu i wysokiej czułości; moce lasera ustawione na 405 nm przy 15 mW, 488 nm przy 15 mW, 561 nm przy 20 mW. Należy również pamiętać, że nasz cytometr obrazowania został specjalnie zaprojektowany, aby mieć przestrzennie oddzielone lasery 488 nm i 561 nm (tj. na różnych kamerach), aby uzyskać wyraźną rozdzielczość FRET z fluorescencji akceptora.
  2. Zbierz dane dla 20 000-50 000 pojedynczych komórek na próbkę w bramce fluorescencyjnie dodatniej.
    1. Bramkowanie pojedynczych komórek o wysokim współczynniku kształtu i małej powierzchni komórki, w przeciwieństwie do skupionych komórek lub zanieczyszczeń, które miałyby odpowiednio niski współczynnik kształtu i duże lub bardzo małe obszary komórek.
      UWAGA: Równoważne parametry w cytometrze nieobrazowym to FSC (rozproszenie do przodu) dla przybliżonej wielkości komórki i SSC (rozproszenie boczne) dla ziarnistości komórki. Dodatkowo użyj wysokości impulsu FSC w stosunku do szerokości impulsu jako wskaźnika zastępczego dla bramkowania pojedynczej komórki. Dodatkowo ważne jest, aby nie zbierać zdarzeń, które mają wartości fluorescencji wykraczające poza górną granicę czułości cytometru. W naszym cytometrze obrazowania ograniczamy zbieranie zdarzeń do surowej maksymalnej wartości piksela o jeden mniejszej niż limit nasycenia dla każdego kanału fluorescencyjnego, który zbieramy. Podobnie w przypadku konwencjonalnych cytometrów przepływowych punkty danych w przedziale o największej intensywności (który obejmuje zdarzenia wykraczające poza dynamiczny zakres wykrywania) nie powinny być analizowane.

7. Analiza danych

  1. Przeprowadź kompensację przy użyciu niefotokonwertowanej próbki mEos3.1 dla czystego sygnału donorowego i monomerycznego DsRed2, który ma podobne widmo do czerwonej formy mEos3.1, dla czystego sygnału akceptora13. Aby uzyskać większą czułość, upewnij się, że kanał detektora FRET jest również uwzględniany jako cel rozlania się w programie do analizy.
  2. Bramkować próbki, aby wybrać tylko pojedyncze komórki, które są dodatnie pod względem fluorescencji (jak w Rysunek 2).
  3. Oblicz parametr AmFRET jako stosunek całkowitego sygnału FRET (488ex/595em) do całkowitego sygnału akceptora FRET (561ex/595em).
  4. Wizualizacja danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Stężenia cytozolowe dla S. cerevisiae w tym badaniu zostały obliczone przy użyciu poniższych ustawień, jak w Khan et al.8. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).

Wyniki

Wykrywanie oligomerów, które nie tworzą punktowych skupisk

Wcześniej zastosowaliśmy metodę DAmFRET do charakterystyki separacji faz białek, która zazwyczaj prowadzi do tworzenia dużych kompleksów białkowych, możliwych do wykrycia również za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykazać przydatność metody DAmFRET w badaniu kompleksów białkowych o rozmiarach ograniczonych przez dyfrakcję, przeanalizowaliśmy biochemicznie dobrze scharakteryzowane białko tworzące dyskretne homo-heptamery, które są zbyt małe, aby można było je zobrazować za pomocą mikroskopii świetlnej: ludzką ko-chaperoninę HSPE1.14Porównaliśmy profile DAmFRET komórek drożdży wykazujących ekspresję samego białka mEos3.1 lub kompleksu HSPE1-mEos3.1. W przypadku tego drugiego odnotowano jednolicie dodatnie wartości AmFRET, podczas gdy w pierwszym przypadku wartości AmFRET były pomijalne (Rysunek 3A). Obrazy komórek uzyskane za pomocą cytometru przepływowego z obrazowaniem (patrz na Tabela materiałów) wykazało rozproszoną fluorescencję we wszystkich kanałach – donora, FRET i akceptora, zarówno w komórkach wykazujących ekspresję mEos3.1, jak i HSPE1-mEos3.1 (Rysunek 3B). Aby potwierdzić ten wynik przy wyższej rozdzielczości optycznej, zastosowano mikroskopię konfokalną do wykonania serii obrazów w osi z (z-stacks) dla wielu pól widzenia komórek. Rzeczywiście, fluorescencja była równomiernie rozmieszczona w całym cytosolu, bez wykrywalnych punktów (puncta), niezależnie od tego, czy komórki eksponowały HSPE1-mEos3.1, czy sam fluorofor (Rycina 3C). Należy zauważyć, że scharakteryzowane Kd zawartości HSPE1 wynosi około 3 µM co znajduje się nieco poniżej czułości naszego systemu, w związku z czym nie obserwujemy sigmoidalnej zależności FRET od stężenia, której należałoby się spodziewać w przypadku tego konkretnego homo-oligomeru. Niemniej jednak stwierdzamy, że metoda DAmFRET skutecznie wykrywa rozpuszczalną homo-oligomeryzację in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Wykrywanie kompleksów o nukleacji ograniczonej

Aby zaprezentować zdolność metody DAmFRET do odróżniania dyskretnych homo-oligomerów od kompleksów ograniczonych nukleacją, takich jak priony, przeanalizowano ludzkie białko inflamasomu ASC. Podczas gdy WT ASCPYD tworzy filamenty in vivo, nieaktywny mutant R41E ASCPYD tego nie robi9,10. W komórkach drożdży wyeksponowano albo sam mEos3.1, albo mEos3.1 połączony z WT lub R41E ASCPYD. Komórki drożdży wykazujące jedynie fluorofor lub mutantową formę ASCPYD wykazywały pomijalny poziom AmFRET w całym zakresie stężeń, co wskazuje na brak zdolności do samoddziaływania. W przeciwieństwie do nich, WT ASCPYD wykazał profil DAmFRET z dwiema populacjami: jedną z pomijalnym AmFRET i drugą z wysokim AmFRET (Rysunek 4A). Jak potwierdzają obrazy fluorescencyjne (Rysunek 4B), populacje te reprezentują odpowiednio komórki zawierające wyłącznie białko rozpuszczalne lub komórki zawierające głównie białko samoorganizujące się. Nieciągłość relacji między populacjami oraz fakt, że występują one przy nakładających się stężeniach, wskazuje, że bariera nukleacji stabilizuje formę monomerową białka i może zapobiegać jego agregacji w czasie trwania eksperymentu8. Przerwa w poziomie AmFRET między dwiema populacjami wskazuje, że po zajściu nukleacji następuje niemal natychmiastowe przejście innych monomerów w formę zorganizowaną i osiągnięty zostaje nowy poziom stacjonarny AmFRET. Wyniki DAmFRET potwierdziły wcześniejsze dane strukturalne, zgodnie z którymi mutant punktowy ASCPYD R41E zaburzył nukleację w zakresie stężeń osiągalnych w tym systemie ekspresji (Rysunek 4A).

Zastosowanie DAmFRET w komórkach ssaków

Chociaż komórki drożdżowe są idealnymi komórkami gospodarzami dla DAmFRET, chcieliśmy rozszerzyć możliwość zastosowania DAmFRET na komórki ssaków. Aby uniknąć śmierci komórek wywołanej przez funkcjonalne polimery ASC, przetestowaliśmy DAmFRET w komórkach HEK293T, które nie wykazują ekspresji kaspazy-1. W komórkach HEK293T wyeksponowaliśmy te same białka, co w komórkach drożdżowych na Ryc. 4A. Otrzymane profile DAmFRET w komórkach HEK293T jakościowo przypominają profile w komórkach drożdżowych (Ryc. 4A,C). W związku z tym DAmFRET służy jako najbardziej wszechstronna metoda in vivo do wykrywania i ilościowego określania nukleowanych samoorganizacji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki przy wysokiej przepustowości, niezależnie od obecności widocznych mikroskopowo punktów oraz typu komórek.

Eksperyment indukcji białka i fotokonwersji FRET; schemat, analiza wykresu, dane emisyjne.
Rycina 1Przegląd projektu eksperymentalnego dla S. cerevisiae. Rysunek ten został opracowany na podstawie pracy Khan i współpracowników.8 za zgodą. (A) 2µ plasmapa środkowa przedstawiająca otwartą ramkę odczytu dla białka docelowego, z etykietą fotokonwertowalnego białka mEos3.1 i pod kontrolą promotora indukowalnego. (B) Po transformacji do komórek drożdży, 2µ systsystemu replikacji prowadzi do wysokiej zmienności liczby kopii między komórkami. Zmienność ta, w połączeniu z szumem transkrypcyjnym promotora GAL1, skutkuje szerokim rozkładem ekspresji białka w populacji komórek. (C) Przegląd eksperymentalny testu DAmFRET u drożdży. Aby zapewnić obecność zdrowych komórek do analizy, w pierwszej kolejności kolonie są szczepione w celu proliferacji przez 16 h w pożywce syntetycznej zawierającej nieindukujące źródło węgla – dekstrozę. Po proliferacji komórki przenosi się do pożywki syntetycznej zawierającej indukujące źródło węgla – galaktozę – na 16 h. Po indukcji komórki poddaje się częściowej i jednorodnej fotokonwersji poprzez naświetlanie światłem o długości fali 405 nm. (D) Następnie próbki analizuje się za pomocą cytometry przepływowej z obrazowaniem. Widma i intensywności mEos3.1 w kolorze zielonym i czerwonym sprawiają, że nadają się one odpowiednio jako donator i akceptor FRET. Gdy cząsteczki znajdują się w bliskiej odległości od siebie, co ma miejsce w polimerze przedstawionym w dolnej komórce, cząsteczki czerwone będą fluorescować po wzbudzeniu cząsteczek zielonych (FRET). (E) Wykres intensywności donora w funkcji intensywności akceptora wykazujący ścisłą liniową zależność po fotokonwersji, co dowodzi, że wydajność fotokonwersji nie jest zależna od poziomu ekspresji. (F) Wykres punktowy średnich intensywności akceptora względem donora w populacjach komórek wykazujących ekspresję różnych białek znakowanych mEos, w formie rozpuszczalnej i amyloidowej, wykazujący, że wydajność fotokonwersji nie zależy od partnera fuzji ani rozpuszczalności (słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe powtórzeń biologicznych). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometryczna; dane z pojedynczych komórek; wykresy kropkowe; autofluorescencja; FRET; stężenie cytozolowe.
Rycina 2Strategia bramkowania DAmFRET dla danych z cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Strategia bramowania zastosowana w celu analizy wyłącznie pojedynczych, niepączkujących komórek o wysokim stopniu skupienia, niskiej autofluorescencji i wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego.A) Hierarchia bramek w celu uzyskania dobrze skupionych, żywych, pojedynczych komórek do analizy. (B) Histogram RMS gradientu kanału jasnego pola. Pomiar ten umożliwia wybór komórek, które są odpowiednio ogniskowane w świetle przechodzącym. (C) Wykres gęstości kolistości w funkcji pola powierzchni, przedstawiający wyselekcjonowaną populację niepączkujących, sferycznych pojedynczych komórek. (DWykres gęstości przedstawiający intensywność autofluorescencji (Ch07) w stosunku do intensywności fluorescencji donora (Ch02), wykazujący oddzielne populacje komórek wykazujących ekspresję (wyselekcjonowane) oraz komórek ciemnych.E) Wykres punktowy intensywności donora w funkcji intensywności akceptora, wykazujący wyraźny spadek fluorescencji donora w podgrupie komórek, będący wynikiem FRET pomiędzy fluoroforami donora i akceptora. (F) Końcowy wykres DAmFRET. Komórki zawierające niezmontowane białko są skupione wokół wartości AmFRET równej zero, podczas gdy komórki zawierające białko samozmontowane wykazują dodatnią wartość AmFRET. Dwie nakładające się populacje na wykresie wskazują na istnienie skończonej bariery nukleacji tego białka w agregaty wyższego rzędu, takie jak amyloidy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykresy analizy FRET i mikroskopia oddziaływań białek mEos3.1 oraz HSPE1; efekty stężeń.
Rysunek 3Reprezentatywne dane dla białek monomerowych i heptamerycznych uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii. (AProfil DAmFRET monomericznego białka mEos3.1 (po lewej) oraz heptamerycznego białka HSPE1 znakowanego mEos3.1 (po prawej), wykazujący zwiększony ratiometryczny FRET wynikający z montażu homotypicznego.BObrazy z cytometru przedstawiające komórki wykazujące ekspresję mEos3.1 (lewo) oraz HSPE1 (prawo) we wszystkich zarejestrowanych kanałach.C) Reprezentatywne obrazy komórek drożdży wykazujących ekspresję monomeru mEos3.1 (po lewej) i HSPE1 (po prawej). Obrazy stanowią sumaryczne projekcje przekrojów konfokalnych. W celu potwierdzenia tej obserwacji wykonano obrazowanie co najmniej pięćdziesięciu komórek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykresy analizy FRET oceniające oddziaływania białek, obejmujące stężenie cytozolowe oraz intensywność akceptora.
Rysunek 4Profile DAmFRET wykazują podobne zachowanie podczas samoorganizacji ludzkich ASCPYD białko w S. cerevisiae oraz komórki HEK293T. (A) Wykresy gęstości przedstawiające AmFRET w funkcji stężenia cytozolowego (w µM) mEos3.1 (po lewej), lub mEos3.1 połączonego z WT (środek) lub mutantem monomeryzującym ASCPYD (prawo) wewnątrz S. cerevisiae. (B) Obrazy z cytometru przedstawiające komórki z bramki dolnej i górnej (odpowiednio lewy i środkowy panel), wykazujące ekspresję WT ASCPYD; oraz komórek wykazujących ekspresję ASCPYD R41E wskazanego bramkowania (panel prawy). (C) Wykresy gęstości przedstawiające AmFRET w funkcji intensywności akceptora dla tej samej serii białek co w (A), lecz wykazanych w komórkach HEK293T. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

DAmFRET jest najbardziej wszechstronną metodą wykrywania samoorganizacji białek in vivo. DAmFRET łączy bezpośredni odczyt homotypowych interakcji białko-białko w szerokim zakresie stężeń, z rozdzielczością pojedynczej komórki i wysoką przepustowością. Bezpośredni odczyt DAmFRET i fakt, że skondensowane białka nie wymagają określonej lokalizacji subkomórkowej lub stanu nierozpuszczalnego, eliminują wyniki fałszywie dodatnie i rozszerzają jego zastosowanie na szeroki zakres białek w ich natywnych lokalizacjach subkomórkowych. W szczególności, znakując organelle fluoroforami, które są spektralnie kompatybilne z mEos3.1, takimi jak T-Sapphire i mCardinal, można określić subkomórkową lokalizację rozpuszczalnych i złożonych form białek wraz z DAmFRET.

Korzystając z obrazowego cytometru przepływowego, jak opisano tutaj, analiza 96-dołkowej płytki z około 20 000 bramkowanych komórek na studzienkę zajmuje 8 godzin. Jednak rutynowo wykonujemy również DAmFRET za pomocą standardowych cytometrów (nieobrazowych), które osiągają znacznie wyższą przepustowość (do 20 próbek na minutę). W rzeczywistości każdy cytometr przepływowy z przestrzennie oddzielonymi laserami 488 i 561 nm, który jest wolny od artefaktów logarytmu i ma odpowiednie PMT i filtry do wykrywania sygnałów donorowych, fret i akceptorowych, jest wystarczający do wykonania DAmFRET. Obecnie ten wzrost przepustowości odbywa się kosztem informacji o lokalizacji i określania objętości, tak że samoorganizacja musi być następnie analizowana jako funkcja ekspresji białka, a nie stężenia. Nie stanowi to problemu w przypadku analiz jakościowych. Dodatkowo, możliwe jest oszacowanie objętości cytozolu poprzez fuzję spektralnie odrębnego fluoroforu z endogennym białkiem "porządkowym", którego ekspresja ściśle koreluje z objętością cytozolu.

Jak wykazaliśmy dzięki zastosowaniu DAmFRET zarówno w komórkach drożdży, jak i ssaków, DAmFRET można łatwo dostosować do różnych systemów ekspresji. Umożliwia to badanie samoorganizacji białek w ich natywnych kontekstach komórkowych. Co więcej, oferuje możliwość porównywania składania białek w bardzo rozbieżnych modelach hodowli komórkowych w celu zbadania zachowania mechanizmów rządzących samoorganizacją białek.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jeffowi Lange, Jayowi Unruhowi, Jianzheng Wu, Tarique Khanowi i Ellen Ketter za ich pracę na rzecz rozwoju testu. Praca ta została wykonana w celu częściowego spełnienia wymagań dotyczących badań nad pracą doktorską dla T.S.K. i A.R.G. jako studentów zarejestrowanych odpowiednio na Open University w Wielkiej Brytanii i Stowers Institute for Medical Research Graduate School w USA. Dodatkowe informacje związane z testami można znaleźć na stronie https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Dostęp do oryginalnych danych leżących u podstaw tego manuskryptu można uzyskać w Oryginalnym Repozytorium Danych Stowers pod adresem http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Ta praca została sfinansowana przez NIH Director's Early Independence Award DP5-OD009152, March of Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-32 oraz Stowers Institute for Medical Research.

Wkład autora jest następujący. Konceptualizacja: T.S.K., S.V. i R.H.; Metodologia: T.S.K., S.V., A.R.G. i A.B; Śledztwo: S.V., T.S.K. i A.R.G.; Analiza formalna: S.V. i T.S.K. ; Kuratorstwo danych: T.S.K.; Wizualizacja: T.S.K. i S.V., Pismo (oryginalny projekt): S.V. i T.S.K.; Pisanie (recenzja, redakcja): R.H., S.V. i T.S.K.; i Pozyskiwanie Finansowania: R.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 Płytka dołkowaAxygenP96-450R-C-S
ASC 2-92 (plazmid ssaków)RHM1.0095Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (R41E) (plazmid ssaków)RHM1.0096Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (R41E) (plazmid drożdży)rhx2432Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (plazmid drożdży)rhx2431Dostępne na zamówienie
WirówkaEppendorf5430R"wirówka" w tekście
CSM -UraSunrise Science Products1004-100
DekstrozaEMD MiliporeDX0145-5
DMEMGibco11966025
EDTASigma-AldrichEDS-500G
FCS Express 6DeNovoFCS Express 6 Flow"oprogramowanie do cytometrii przepływowej" w tekście
Surowica bydlęcapłodu VWR Life Science45001-108
Cytometr przepływowyBioRadZE5Cytometr przepływowy bez obrazowania
FUGENE HDPromegaE2311"odczynnik do transfekcji" w tekście
GalaktozaVWR Life Science0637-500g
HSPE1 ( plazmid drożdży)rhx1531Dostępny na żądanie
Obrazowy cytometr przepływowyEMD MilliporeImageStream X Mark II"obrazowy cytometr przepływowy" w tekście
KomórkiHEK293T
mEos3.1 (plazmid ssaków)rhm1Dostępny na zamówienie
mEos3.1 (plazmid drożdży)rhx0935Dostępny na zamówienie
optiMEMGibco31985062"zredukowane podłoże surowicy" w tekście
PBSVWR Life Science45000-446
PenStrepGibco15070063
PFASigma-AldrichP6148-1KG
Lampa fotokonwersyjnaOmniCureS1000
Plazmid #54525Addgene#54525"publicznie dostępny plazmid" w tekście
Titramax 1000 Wytrząsarka do płytekHeidolph Instruments1000"wytrząsarka do płyt" w tekście
Trypsin-EDTAGibco25200056
Szczeprhy1713Dostępny na zamówienie- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ 1 leu2Δ 0 ura3 i Delta; 0 met15 i Delta; 0 cln3Δ 0::GAL1pr_WHI5_hphMX)
ssaków drożdży

Bibliografia

  1. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
  2. Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
  3. Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
  4. Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
  5. Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  6. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  7. Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
  8. Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
  9. Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  10. Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  11. Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
  12. Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425(1992).
  13. Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
  14. Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

analiza DAmFRETFRET z uwzgl dnieniem emisji uwra liwionejcytometria przep ywowa z obrazowaniemkom rki dro d yfotokonwersjabia ko fluorescencyjnebariera nukleacjimikroskopia konfokalna
Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.