Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Streszczenie

Samoorganizacja białek zarządza funkcją białka i rozdziela procesy komórkowe w przestrzeni i czasie. Obecne metody badania cierpią z powodu niskiej czułości, pośrednich odczytów, ograniczonej przepustowości i/lub rozdzielczości na poziomie populacji, a nie rozdzielczości pojedynczej komórki. Zaprojektowaliśmy pojedynczą metodologię opartą na cytometrii przepływowej, która rozwiązuje wszystkie te ograniczenia: rozproszony fret amfifluorowy lub DAmFRET. DAmFRET wykrywa i określa ilościowo samoorganizację białek za pomocą uczulonej emisji FRET in vivo, umożliwia wdrożenie w różnych systemach modelowych - od drożdży po komórki ludzkie - i osiąga czułe, jednokomórkowe, wysokoprzepustowe odczyty niezależnie od lokalizacji lub rozpuszczalności białek.

Wprowadzenie

Testy do badania homotypowych interakcji białek, czyli "samoorganizacji" są ważne, ponieważ stan oligomeryczny i rozpuszczalność białek dyktują ich funkcję. Proteom obfituje w homo-multimery^1,2,3,4, podczas gdy stosunkowo niewiele białek funkcjonuje jako monomery. Białka mogą również gromadzić się w nieprawidłowy sposób z powodu stresu, wieku lub niewłaściwej regulacji, co prowadzi do patologicznych zmian w aktywności. Zidentyfikowanie czynników, które modulują takie zdarzenia, a nawet fizycznej natury zgromadzeń, jest często wyjątkowo trudne.

Coraz większa liczba białek jest obecnie uznawana za samoorganizujące się z niezwykłą kooperatywnością i nieokreśloną stechiometrią, co skutkuje ich wymieszaniem z innymi składnikami komórkowymi, jako fazy gęste od białek. Przybierają one postać nieuporządkowanych kondensatów, takich jak kropelki i żele, lub wysoce uporządkowanych włókien, takich jak włókna amyloidowe. Fluktuacje konformacyjne związane z tym ostatnim sprawiają, że jego początkowe powstawanie, czyli zarodkowanie, jest z natury probabilistyczne na poziomie molekularnym^5,6. Ponieważ prawdopodobieństwo zarodkowania skaluje się wraz z objętością, powstawanie takich zespołów może być wysoce stochastyczne w przestrzennych granicach żywych komórek^7,8. Na krańcu stochastycznej separacji faz ograniczonej zarodkowaniem znajdują się priony, wysoce uporządkowane zespoły białek, które rzadko zarodkują spontanicznie, ale gdy już się uformują, szablonują swój własny wzrost w nieskończoność. Jedno z takich białek, znane jako ASC, wykonuje cyfrowy przełącznik podobny do prionów w aktywności wrodzonych komórek odpornościowych ssaków. Samoorganizacja ASC jest zarodkowana przez jego interakcję ze specyficznymi białkami, które same uległy oligomeryzacji po związaniu wzorców molekularnych związanych z patogenem lub niebezpieczeństwem. Zespoły ASC z kolei zarodkują prokaspazę-1 w celu samoorganizacji i aktywacji, co prowadzi do dojrzewania cytokin i piroptozy komórki^9,10. Obszar ASC odpowiedzialny za jego montaż należy do nadrodziny domeny śmierci, która składa się z ponad stu członków w proteomie człowieka. Pomimo kluczowej roli domen śmierci w odporności wrodzonej i programowanej śmierci komórki, większość z nich nie została jeszcze scharakteryzowana w odniesieniu do samoorganizacji. Odkrycie i scharakteryzowanie dodatkowych białek o takim zachowaniu będzie znacznie ułatwione dzięki bezpośredniemu, jednokomórkowemu odczytowi samoorganizacji białek.

Klasyczne podejścia biochemii białek do badania samoorganizacji białek, takie jak chromatografia wykluczająca wielkość i ultrawirowanie, są w dużej mierze ograniczone do oceny na poziomie populacji. Jednak heterogeniczność między komórkami wynikająca z ograniczonych zarodkowością przemian fazowych nie może być modelowana przy użyciu tego poziomu szczegółowości. Podejścia jednokomórkowe oparte na mikroskopii fluorescencyjnej odzyskują tę zdolność, ale brakuje im przepustowości niezbędnej do dokładnego ilościowego określenia zarodkowania lub wykrycia rzadkich zespołów. Co więcej, rozpuszczalne samoorganizacje, takie jak większość enzymów i oligomerów preamyloidowych, są zbyt małe i mobilne, aby można je było rozdzielić za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Można je wykryć za pomocą bardziej wyrafinowanych metod, takich jak spektroskopia korelacji fluorescencji, ale są one bardzo ograniczone pod względem liczby komórek i przepustowości.

Oparte na bliskości testy składania białek, takie jak FRET i komplementacja rozszczepionego fluoroforu, oferują potencjalne rozwiązanie tych problemów. Jednak na ogół wymagają one użycia dwóch różnych konstruktów wyrażających interesujące białko połączone z komplementarnymi znacznikami - fluoroforami donorowymi i akceptorowymi w przypadku FRET. Pogarsza to przepustowość eksperymentalną, a także zmniejsza czułość ze względu na różnice między komórkami w względnych poziomach dawcy i akceptora. Aby obejść ten problem, zaprojektowaliśmy test, który wykorzystuje fotokonwertowalny fluorofor, mEos3.1¹¹, który pozwala pojedynczemu konstruktowi na ekspresję zarówno białka znakowanego donorem, jak i akceptorem. Widmo emisyjne nieprzekształconego mEos3.1 (donor podobny do GFP) wystarczająco pokrywa się z widmem wzbudzenia fotokonwertowanego mEos3.1 (akceptor podobny do dsRed), aby umożliwić wystąpienie FRET, gdy cząsteczki znajdują się w bliskiej odległości (<10 nm). W ten sposób, wystawiając komórki na empirycznie określoną dawkę światła 405 nm, która fotokonwertuje optymalną frakcję całkowitego mEos3.1 do formy akceptora, osiągamy spójne i powtarzalne względne poziomy dawcy i akceptora w wielu próbkach, poziomach ekspresji i eksperymentach. Mierzymy fluorescencję akceptora po wzbudzeniu albo bezpośrednio światłem 561 nm, albo pośrednio (przez transfer energii od dawcy) światłem 488 nm (tj. Uczulona emisja FRET). Podajemy składanie białek jako stosunek tych dwóch wartości i nazywamy go amfifluorycznym FRET lub AmFRET.

Aby obliczyć stężenie białka za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw obliczamy średnią intensywność fluorescencji Spc42 oznaczonego mEos3.1. Ponieważ komórki drożdży zawierają około 1000 cząsteczek Spc42, następnie obliczamy intensywność fluorescencji pojedynczej fluorescencyjnej zielonej cząsteczki mEos3.1. Wykorzystując równomierną fotokonwersję we wszystkich stężeniach komórkowych (Rysunek 1E), następnie korelujemy całkowite wartości fluorescencji mEos3.1 dla wszystkich intensywności akceptorów po fotokonwersji. Następnie jesteśmy w stanie podzielić całkowitą liczbę moli białek fluorescencyjnych przez przybliżoną objętość cytozolową (określoną za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej), aby uzyskać całkowite stężenie cytozolowe interesującego nas białka. Dokładne obliczenia można znaleźć w oryginalnym manuskrypcie⁸.

Poprzez ekspresję białka skondensowanego mEos3.1 z plazmidu 2μ w drożdżach, badamy w przybliżeniu tysiąckrotny zakres stężenia białka w każdej próbce⁸. To samo osiągamy w komórkach HEK293T dzięki zmienności wychwytu plazmidu podczas transfekcji, a tym samym zmiennej liczbie kopii.

Wynikowy rozkład AmFRET, lub DAmFRET, dla wielu tysięcy komórek ujawnia zależność od koncentracji samoorganizacji w cytozolu dla dowolnego interesującego białka. Ogólnie rzecz biorąc, projekt DAmFRET stanowi metodologię umożliwiającą odkrywanie i charakteryzowanie samoorganizacji białek z niespotykanym dotąd połączeniem czułości, przepustowości i odtwarzalności.

Podczas gdy korzystanie z cytometru obrazowego umożliwia nam pomiary stężenia białek in vivo, takie cytometry nie są jeszcze dostępne w większości instytucji badawczych. Niemniej jednak DAmFRET można uruchomić nawet w typowym cytometrze nieobrazującym, aby uzyskać rozkłady składania białek w zakresie ekspresji białek.

Protokół

1. Przygotowanie Saccharomyces cerevisiae do testu DAmFRET

1. Przekształć eksperymentalnie istotne szczepy drożdży za pomocą plazmidu indukowanego galaktozą 2μ, który wyraża interesujące białko⁸ oznaczone na końcu C lub N za pomocą mEos3.1 przy użyciu standardowego protokołu octanu litu¹² .
2. Hoduj drożdże w płynnej kulturze.
   1. Dla każdego białka zapytania, zaszczepić kolonie drożdży (przekształcone), w trzech egzemplarzach, każda w 200 μl odpowiednich nieindukujących pożywek wzrostowych (tj. pożywki zawierającej 2% dekstrozy, drożdżowej zasady azotowej i aminokwasów do wyboru plazmidu) na 96-dołkowej płytce (Rysunek 1C).
   2. Inkubować komórki, wytrząsając na wytrząsarce płytkowej (patrz tabela materiałów) o orbicie 1,5 mm z prędkością 1200 obr./min w temperaturze 30 °C przez 16 godzin.
3. Indukuj ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania (reprezentatywny protokół dla 16 h-niektóre białka mogą zająć więcej lub mniej czasu).
   1. Po 16 godzinach indukcji obracać płytkę o masie 2200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT0 w celu osadzenia próbek.
   2. Usuń multimedia przez wymuszone odwrócenie. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl odpowiedniej pożywki indukcyjnej (tj. pożywki zawierającej 2% galaktozy, zasady azotowej drożdży i aminokwasów do wyboru plazmidu). Zobacz Rysunek 1C.
   3. Inkubować komórki, wytrząsając w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.
   4. Odwirować (patrz tabela materiałów) płytkę o masie 2200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu osadzenia próbek. Usuń multimedia przez wymuszone odwrócenie. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl pożywki indukcyjnej.
   5. Inkubować komórki, wytrząsając z prędkością 1200 obr./min w temperaturze 30 °C przez kolejne 4 godziny. To ponowne zamieszanie w świeżych pożywkach powinno nastąpić 4 godziny przed uruchomieniem DAmFRET, w celu zmniejszenia autofluorescencji.

2. Tworzenie plazmidu u ssaków

1. Skonstruuj wektor ssaków, który ma konstytutywny promotor i mEos3.1 z symbolem zastępczym, aby wstawić interesujący nas gen i łącznik między nimi.
   UWAGA: Skonstruowaliśmy wektor kompatybilny ze złotą bramą, M1, z publicznie dostępnego plazmidu (patrz Tabela Materiałów) z następującymi modyfikacjami: istniejące miejsce BsaI zostało usunięte przez mutację punktową G do A (w pozycji 3719 zgodnie z zdeponowaną sekwencją). mEos3.1 uzyskano za pomocą ukierunkowanej mutagenezy fluoroforu w I157V. Odwrócone miejsca BsaI, po których następuje łącznik 4x (EAAAR), zostały wstawione przez zespół Gibsona w ramce między promotorem CMV a mEos3.1 w celu wytworzenia końcowego wektora M1. Ekspresja białek jest napędzana przez wzmacniacz i promotor CMV; i zakończenie transkrypcji przez sygnał poliadenylacji SV40.
2. Utwórz bibliotekę wstawień, zgodną ze skonstruowanym wektorem.
   UWAGA: Zamawiamy nasze wkładki do montażu Golden Gate jako syntetyczne fragmenty liniowe (patrz tabela materiałów) otoczone miejscami BsaI do ligacji do M1 między promotorem CMV a 4x(EAAAR)-mEos3.1.

3. Hodowla i transfekcja komórek ssaków

1. Hodowla HEK293T komórek w DMEM + 10% FBS + 1x pożywka PenStrep w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
2. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewać 5 x 10⁵ komórek na 6-dołkowej płytce z 2 ml pożywki.
3. Komórki transfekcyjne z 2 μg plazmidowego DNA przy użyciu odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w stosunku 3:1 (odczynnik do transfekcji: DNA). Wymieszać składniki w 150 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, dodać mieszaninę do każdej studzienki i inkubować przez 48 godzin w celu ekspresji białka.
4. Potwierdzić ekspresję białka po 24 godzinach za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (wzbudzenie 488 nm, emisja 515 nm).

4. Przygotowanie komórek ssaków do testu DAmFRET

1. Po 48 godzinach ekspresji białka usunąć pożywkę z każdej studzienki i ostrożnie umyć komórki 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C. Po umyciu odessać PBS.
2. Dodać 0,5 ml kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,25%) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 0,5 ml kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki, ponownie zawieś komórki i upewnij się, że nie są widoczne duże grudki.
4. Przenieś całą objętość każdej studzienki do probówek o pojemności 1,5 ml.
5. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 x g w temperaturze pokojowej (RT).
6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml PBS + 10 mM EDTA.
7. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 x g w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) + 10 mM EDTA w PBS.
9. Zamocuj komórki na 5 minut na stole wstrząsowym ciągłym ruchem.
10. Wiruj komórki przez 5 minut przy 1000 x g przy RT.
11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 10 mM EDTA.
12. Wiruj komórki przez 5 minut przy 1000 x g przy RT.
13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu do przebiegu cytometrii (dla 1 dołka z 96-dołkowej płytki użyć 200 μl PBS + 10 mM EDTA).
14. Przenieść zawieszone komórki do jednego dołka 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.

5. Fotokonwersja komórek drożdży i ssaków do testu

1. Fotokonwersja próbek w mikropłytce bez pokrywy przy użyciu lampy UV (patrz Tabela Materiałów) wyposażonej w filtr 320-500 nm (fioletowy) i kolimator wiązki, umieszczony 45 cm nad płytką, przez czas 25 minut podczas wytrząsania. Warunki te są odpowiednie, gdy moc wiązki na płytce wynosi 11,25 mW/^cm2, przy około 17 000 mJ/^cm2 całkowitej dawki fotonów⁸.

6. Zbieranie danych DAmFRET

1. Oznaczanie komórek za pomocą cytometru z niewspółliniowymi laserami 488/561. Poniższe dane stanowią minimalne wymagania dotyczące obliczania FRET.
   1. Użyj kanału wzbudzenia 488 nm / emisji 515 nm do zbierania fluorescencji dawcy.
   2. Użyj kanału wzbudzenia 488 nm / emisji 595 nm do zbierania fluorescencji sygnału FRET.
   3. Użyj kanału wzbudzenia 561 nm / kanału emisyjnego 595 nm (niewspółliniowego z kanałem 488/595) do zbierania fluorescencji akceptora.
   4. Użyj kanału wzbudzenia 405 nm / emisji 457 nm do zbierania autofluorescencji⁸.
   5. Wykorzystaj kanał obrazu w jasnym polu do obliczania objętości.
      UWAGA: Ustawienia cytometru obrazowego dla S. cerevisiae są następujące: obiektyw 60x przy niskim natężeniu przepływu i wysokiej czułości; moce lasera ustawione na 405 nm przy 15 mW, 488 nm przy 15 mW, 561 nm przy 20 mW. Ustawienia cytometru obrazowego dla komórek HEK293T są następujące:40-krotny obiektyw przy niskim natężeniu przepływu i wysokiej czułości; moce lasera ustawione na 405 nm przy 15 mW, 488 nm przy 15 mW, 561 nm przy 20 mW. Należy również pamiętać, że nasz cytometr obrazowania został specjalnie zaprojektowany, aby mieć przestrzennie oddzielone lasery 488 nm i 561 nm (tj. na różnych kamerach), aby uzyskać wyraźną rozdzielczość FRET z fluorescencji akceptora.
2. Zbierz dane dla 20 000-50 000 pojedynczych komórek na próbkę w bramce fluorescencyjnie dodatniej.
   1. Bramkowanie pojedynczych komórek o wysokim współczynniku kształtu i małej powierzchni komórki, w przeciwieństwie do skupionych komórek lub zanieczyszczeń, które miałyby odpowiednio niski współczynnik kształtu i duże lub bardzo małe obszary komórek.
      UWAGA: Równoważne parametry w cytometrze nieobrazowym to FSC (rozproszenie do przodu) dla przybliżonej wielkości komórki i SSC (rozproszenie boczne) dla ziarnistości komórki. Dodatkowo użyj wysokości impulsu FSC w stosunku do szerokości impulsu jako wskaźnika zastępczego dla bramkowania pojedynczej komórki. Dodatkowo ważne jest, aby nie zbierać zdarzeń, które mają wartości fluorescencji wykraczające poza górną granicę czułości cytometru. W naszym cytometrze obrazowania ograniczamy zbieranie zdarzeń do surowej maksymalnej wartości piksela o jeden mniejszej niż limit nasycenia dla każdego kanału fluorescencyjnego, który zbieramy. Podobnie w przypadku konwencjonalnych cytometrów przepływowych punkty danych w przedziale o największej intensywności (który obejmuje zdarzenia wykraczające poza dynamiczny zakres wykrywania) nie powinny być analizowane.

7. Analiza danych

1. Przeprowadź kompensację przy użyciu niefotokonwertowanej próbki mEos3.1 dla czystego sygnału donorowego i monomerycznego DsRed2, który ma podobne widmo do czerwonej formy mEos3.1, dla czystego sygnału akceptora¹³. Aby uzyskać większą czułość, upewnij się, że kanał detektora FRET jest również uwzględniany jako cel rozlania się w programie do analizy.
2. Bramkować próbki, aby wybrać tylko pojedyncze komórki, które są dodatnie pod względem fluorescencji (jak w Rysunek 2).
3. Oblicz parametr AmFRET jako stosunek całkowitego sygnału FRET (488ex/595em) do całkowitego sygnału akceptora FRET (561ex/595em).
4. Wizualizacja danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Stężenia cytozolowe dla S. cerevisiae w tym badaniu zostały obliczone przy użyciu poniższych ustawień, jak w Khan et al.⁸. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).

Wyniki

Wykrywanie oligomerów, które nie tworzą puncta

Wcześniej stosowaliśmy DAmFRET do charakterystyki separacji faz białkowych, co zazwyczaj prowadzi do powstawania dużych zespołów białkowych, które można również wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby zademonstrować możliwość zastosowania DAmFRET do zespołów białek o ograniczonej dyfrakcji, przeanalizowaliśmy biochemicznie dobrze scharakteryzowane białko, które tworzy dyskretne homo-heptamery, które są zbyt małe, aby można je było uwidocznić za pomocą mikroskopii świetlnej: ludzka ko-chaperonina, HSPE1¹⁴. Porównaliśmy profile DAmFRET komórek drożdży wykazujących ekspresję samego mEos3.1 lub HSPE1-mEos3.1. Te ostatnie wykazywały jednolite dodatnie wartości AmFRET, podczas gdy pierwsze wykazywały znikome AmFRET (Rysunek 3A). Obrazy komórek uzyskane za pomocą obrazowego cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów) wykazały rozproszoną fluorescencję we wszystkich kanałach - donorowym, FRET i akceptorowym, zarówno dla komórek wykazujących ekspresję mEos3.1, jak i HSPE1-mEos3.1 (Figura 3B). Aby potwierdzić to odkrycie w wyższej rozdzielczości optycznej, użyliśmy mikroskopii konfokalnej do uchwycenia stosów z dla wielu pól komórek. Rzeczywiście, fluorescencja była równomiernie rozłożona w cytozolu, bez wykrywalnego punktu, niezależnie od tego, czy komórki wyrażały HSPE1-mEos3.1, czy sam fluorofor (Figura 3C). Zauważ, że scharakteryzowany K_d HSPE1 wynosi około 3 μM, co jest nieco poniżej czułości naszego systemu, a zatem nie obserwujemy sigmoidalnego związku FRET ze stężeniem, którego można by się spodziewać dla tego dyskretnego homo-oligomeru. Niemniej jednak dochodzimy do wniosku, że DAmFRET solidnie wykrywa rozpuszczalną homooligomeryzację in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wykrywanie zespołów ograniczonych do zarodkowania

Aby pokazać zdolność DAmFRET do odróżniania dyskretnych homo-oligomerów od zespołów ograniczonych zarodkowaniem, takich jak priony, przeanalizowaliśmy ludzkie białko inflamasomowe ASC. Podczas gdy WT ASC^PYD tworzy filamenty in vivo, nieaktywny mutant R41E ASC^PYD nie^9,10. Ulegliśmy ekspresji w komórkach drożdży albo samego mEos3.1, albo mEos3.1 połączonego z WT lub R41E ASC^PYD. Komórki drożdży wykazujące ekspresję samego fluoroforu lub zmutowanej formy ASC^PYD wykazywały znikomy AmFRET w całym zakresie stężeń, co wskazuje na niezdolność do samointerakcji. W przeciwieństwie do tego, WT ASC^PYD wykazywał profil DAmFRET z dwiema populacjami: jedną ze znikomym AmFRET i drugą z wysokim AmFRET (Rysunek 4A). Jak potwierdzają obrazy fluorescencyjne (Rysunek 4B), populacje te reprezentują komórki, które zawierają odpowiednio tylko rozpuszczalne białko lub zamiast tego zawierają głównie białko samoorganizujące się. Nieciągły związek między populacjami i fakt, że występują one w nakładających się stężeniach, wskazuje, że bariera zarodkowania stabilizuje monomeryczną formę białka i może zapobiec jej gromadzeniu się w czasie trwania eksperymentu⁸. Luka w AmFRET między tymi dwiema populacjami wskazuje, że gdy dojdzie do zarodkowania, niemal natychmiast szablonuje inne monomery do złożonej formy i osiąga nowy poziom AmFRET w stanie ustalonym. DAmFRET potwierdził wcześniejsze dane strukturalne, że punktowy mutant ASC^PYD R41E zakłócał zarodkowanie w stężeniach osiągalnych przez ten system ekspresji (Rysunek 4A).

Zastosowanie DAmFRET w komórkach ssaków

Chociaż komórki drożdży są idealnymi komórkami gospodarza dla DAmFRET, chcieliśmy rozszerzyć zastosowanie DAmFRET na komórki ssaków. Aby uniknąć śmierci komórki spowodowanej przez funkcjonalne polimery ASC, przetestowaliśmy DAmFRET na HEK293T komórkach, które nie mają ekspresji kaspazy-1. Ekspresję tych samych białek w HEK293T komórkach, co w komórkach drożdży w Rysunek 4A. Uzyskane profile DAmFRET w HEK293T komórkach jakościowo przypominają te w komórkach drożdży (ryc. 4A,C). DAmFRET służy zatem jako najbardziej wszechstronna metoda in vivo do wykrywania i ilościowego określania samoorganizacji białek jądrzastych w rozdzielczości pojedynczej komórki z wysoką przepustowością, niezależnie zarówno od obecności mikroskopijnie widocznych punktów, jak i typu komórki.

Rysunek 1: Przegląd projektu eksperymentalnego dla S. cerevisiae. Ten rysunek został zaadaptowany z Khan et al.⁸ za zgodą. (A) Mapa plazmidu 2μ przedstawiająca otwartą ramkę odczytu dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, oznaczonego fotokonwertowalnym mEos3.1 i sterowanego przez indukowalny promotor. (B) Po przekształceniu w komórki drożdży, system replikacji 2μ prowadzi do dużej zmienności liczby kopii między komórkami. Ta zmienność, w połączeniu z szumem transkrypcyjnym z promotora GAL1, skutkuje szerokim rozkładem ekspresji białek w populacji komórek. (C) Przegląd doświadczeń dotyczących drożdżowego testu DAmFRET. Aby zapewnić zdrowe komórki do testu, kolonie są najpierw inokulowane w celu proliferacji przez 16 godzin w pożywkach syntetycznych zawierających nieindukujące źródło węgla, dekstrozę. Po proliferacji komórki są przenoszone na pożywkę syntetyczną zawierającą indukujące źródło węgla, galaktozę, przez 16 godzin. Po indukcji komórki są częściowo i równomiernie fotokonwertowane przez ekspozycję na światło o długości fali 405 nm. (D) Próbki są następnie analizowane przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej. Widma i intensywności zielonego i czerwonego mEos3.1 sprawiają, że dobrze nadają się one odpowiednio dla donora i akceptora FRET. Gdy znajdują się w bliskiej odległości od siebie, jak ma to miejsce w polimerze przedstawionym w dolnej komórce, czerwone cząsteczki ulegają fluorescencji po wzbudzeniu zielonych cząsteczek (FRET). (E) Wykres intensywności dawcy i akceptora pokazujący ścisłą liniową zależność po fotokonwersji, pokazujący, że poziom ekspresji nie ma wpływu na skuteczność fotokonwersji. (F) Wykres punktowy średniej intensywności akceptora i dawcy z populacji komórek wyrażających różne białka znakowane mEos, zarówno w formie rozpuszczalnej, jak i amyloidowej, pokazujący, że na efektywność fotokonwersji nie ma wpływu partner fuzyjny ani rozpuszczalność (słupki błędu wskazują odchylenie standardowe biologicznych trójek). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Strategia bramkowania DAmFRET dla obrazowania danych cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania stosowana do analizy tylko skoncentrowanych, niepączkujących pojedynczych komórek, które mają niską autofluorescencję i wyrażają białko fluorescencyjne. (A) Hierarchia bramek w celu uzyskania dobrze skoncentrowanych, żywych, pojedynczych komórek do analizy. (B) Histogram gradientu RMS kanału jasnego pola. Pomiar ten pozwala na wybór komórek, które są odpowiednio zogniskowane w świetle przechodzącym. (C) Wykres gęstości kolistości w funkcji obszaru pokazującego bramkowaną populację niepączkujących kulistych pojedynczych komórek. (D) Wykres gęstości przedstawiający intensywność autofluorescencji (Ch07) w stosunku do fluorescencji dawcy (Ch02) pokazujący oddzielne populacje komórek eksprymujących (bramkowanych) i ciemnych komórek. (E) Wykres punktowy intensywności dawcy w stosunku do akceptora pokazujący wyraźną utratę fluorescencji dawcy w podzbiorze komórek, wynikającą z FRET między fluoroforami dawcy i akceptora. (F) Końcowy wykres DAmFRET. Komórki zawierające niezłożone białko są skoncentrowane wokół zera AmFRET, podczas gdy komórki zawierające samoorganizujące się białko wykazują dodatnią wartość AmFRET. Dwie nakładające się na siebie populacje na wykresie wskazują na skończoną barierę dla zarodkowania tego białka w zespoły wyższego rzędu, takie jak amyloidy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne dane białek monomerycznych i heptamerycznych za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii. (A) Profil DAmFRET monomerycznego białka mEos3.1 (po lewej) i heptamerycznego HSPE1 oznaczonego mEos3.1 (po prawej) wykazujący zwiększoną ratiometryczną FRET wynikającą z homotypowego montażu. (B) Obrazy z cytometru komórek wyrażających mEos3.1 (po lewej) i HSPE1 (po prawej) pokazane we wszystkich przechwyconych kanałach. (C) Reprezentatywne obrazy komórek drożdży wykazujących ekspresję monomerycznego mEos3.1 (po lewej) i HSPE1 (po prawej). Obrazy są projekcjami sumy warstw konfokalnych. Zobrazowano co najmniej pięćdziesiąt komórek, aby potwierdzić tę obserwację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Profile DAmFRET wykazują podobne zachowanie podczas samoorganizacji ludzkiego białka^{ASC PYD} w komórkach S. cerevisiae i HEK293T. (A) Wykresy gęstości przedstawiające AmFRET w stosunku do stężenia cytozolowego (w μM) mEos3.1 (po lewej) lub mEos3.1 połączonego z WT (w środku) lub monomeryzującego mutanta ASC^PYD (po prawej) w S. cerevisiae. (B) Obrazy z cytometru, komórek z dolnej i górnej bramki (odpowiednio lewy i środkowy panel) wyrażających WT ASC^PYD; oraz komórek wyrażających ASC^PYD R41E wskazanej bramki (prawy panel). (C) Wykresy gęstości przedstawiające intensywność AmFRET w stosunku do akceptora dla tej samej serii białek co w (A), ale wyrażonych w HEK293T komórkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

DAmFRET jest najbardziej wszechstronną metodą wykrywania samoorganizacji białek in vivo. DAmFRET łączy bezpośredni odczyt homotypowych interakcji białko-białko w szerokim zakresie stężeń, z rozdzielczością pojedynczej komórki i wysoką przepustowością. Bezpośredni odczyt DAmFRET i fakt, że skondensowane białka nie wymagają określonej lokalizacji subkomórkowej lub stanu nierozpuszczalnego, eliminują wyniki fałszywie dodatnie i rozszerzają jego zastosowanie na szeroki zakres białek w ich natywnych lokalizacjach subkomórkowych. W szczególności, znakując organelle fluoroforami, które są spektralnie kompatybilne z mEos3.1, takimi jak T-Sapphire i mCardinal, można określić subkomórkową lokalizację rozpuszczalnych i złożonych form białek wraz z DAmFRET.

Korzystając z obrazowego cytometru przepływowego, jak opisano tutaj, analiza 96-dołkowej płytki z około 20 000 bramkowanych komórek na studzienkę zajmuje 8 godzin. Jednak rutynowo wykonujemy również DAmFRET za pomocą standardowych cytometrów (nieobrazowych), które osiągają znacznie wyższą przepustowość (do 20 próbek na minutę). W rzeczywistości każdy cytometr przepływowy z przestrzennie oddzielonymi laserami 488 i 561 nm, który jest wolny od artefaktów logarytmu i ma odpowiednie PMT i filtry do wykrywania sygnałów donorowych, fret i akceptorowych, jest wystarczający do wykonania DAmFRET. Obecnie ten wzrost przepustowości odbywa się kosztem informacji o lokalizacji i określania objętości, tak że samoorganizacja musi być następnie analizowana jako funkcja ekspresji białka, a nie stężenia. Nie stanowi to problemu w przypadku analiz jakościowych. Dodatkowo, możliwe jest oszacowanie objętości cytozolu poprzez fuzję spektralnie odrębnego fluoroforu z endogennym białkiem "porządkowym", którego ekspresja ściśle koreluje z objętością cytozolu.

Jak wykazaliśmy dzięki zastosowaniu DAmFRET zarówno w komórkach drożdży, jak i ssaków, DAmFRET można łatwo dostosować do różnych systemów ekspresji. Umożliwia to badanie samoorganizacji białek w ich natywnych kontekstach komórkowych. Co więcej, oferuje możliwość porównywania składania białek w bardzo rozbieżnych modelach hodowli komórkowych w celu zbadania zachowania mechanizmów rządzących samoorganizacją białek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 Płytka dołkowa	Axygen	P96-450R-C-S
ASC 2-92 (plazmid ssaków)		RHM1.0095	Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (R41E) (plazmid ssaków)		RHM1.0096	Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (R41E) (plazmid drożdży)		rhx2432	Dostępny na zamówienie
ASC 2-92 (plazmid drożdży)		rhx2431	Dostępne na zamówienie
Wirówka	Eppendorf	5430R	"wirówka" w tekście
CSM -Ura	Sunrise Science Products	1004-100
Dekstroza	EMD Milipore	DX0145-5
DMEM	Gibco	11966025
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-500G
FCS Express 6	DeNovo	FCS Express 6 Flow	"oprogramowanie do cytometrii przepływowej" w tekście
Surowica bydlęca	płodu VWR Life Science	45001-108
Cytometr przepływowy	BioRad	ZE5	Cytometr przepływowy bez obrazowania
FUGENE HD	Promega	E2311	"odczynnik do transfekcji" w tekście
Galaktoza	VWR Life Science	0637-500g
HSPE1 ( plazmid drożdży)		rhx1531	Dostępny na żądanie
Obrazowy cytometr przepływowy	EMD Millipore	ImageStream X Mark II	"obrazowy cytometr przepływowy" w tekście
Komórki		HEK293T
mEos3.1 (plazmid ssaków)		rhm1	Dostępny na zamówienie
mEos3.1 (plazmid drożdży)		rhx0935	Dostępny na zamówienie
optiMEM	Gibco	31985062	"zredukowane podłoże surowicy" w tekście
PBS	VWR Life Science	45000-446
PenStrep	Gibco	15070063
PFA	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
Lampa fotokonwersyjna	OmniCure	S1000
Plazmid #54525	Addgene	#54525	"publicznie dostępny plazmid" w tekście
Titramax 1000 Wytrząsarka do płytek	Heidolph Instruments	1000	"wytrząsarka do płyt" w tekście
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
Szczep		rhy1713	Dostępny na zamówienie- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ 1 leu2Δ 0 ura3 i Delta; 0 met15 i Delta; 0 cln3Δ 0::GAL1pr_WHI5_hphMX)