Artykuł metodologiczny

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59582

⸱

8 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Streszczenie

Krytyczne niedokrwienie kończyn (CLI) jest poważnym stanem, który pociąga za sobą wysokie ryzyko amputacji kończyny dolnej. Pomimo tego, że rewaskularyzacja jest złotym standardem terapii, znaczna liczba pacjentów z CLI nie nadaje się ani do rewaskularyzacji chirurgicznej, ani wewnątrznaczyniowej. Terapie angiogenne pojawiają się jako opcja dla tych pacjentów, ale obecnie są nadal badane. Przed zastosowaniem u ludzi terapie te muszą zostać przetestowane na modelach zwierzęcych, a ich mechanizmy muszą być jasno poznane. Zwierzęcy model niedokrwienia kończyn tylnych (HLI) został opracowany przez podwiązanie i wycięcie dystalnych tętnic i żył biodrowych zewnętrznych i udowych u myszy. Stworzono kompleksowy panel testów w celu oceny skutków niedokrwienia i przypuszczalnych terapii angiogennych na poziomie funkcjonalnym, histologicznym i molekularnym. Do pomiaru przepływu i oceny funkcjonalnej perfuzji wykorzystano Doppler laserowy. Odpowiedź tkanek oceniano poprzez analizę gęstości naczyń włosowatych po barwieniu przeciwciałem anty-CD31 na odcinkach histologicznych mięśnia brzuchatego łydki oraz poprzez pomiar gęstości naczyń pobocznych po diafonizacji. Ekspresję genów angiogennych określono ilościowo za pomocą RT-PCR ukierunkowanego na wybrane czynniki angiogenne wyłącznie w komórkach śródbłonka (EC) po mikrodysekcji laserowej z mięśni brzuchatych łydek myszy. Metody te były czułe w identyfikacji różnic między kończynami niedokrwiennymi i nieniedokrwiennymi oraz między kończynami leczonymi i nieleczonymi. Protokół ten zapewnia powtarzalny model CLI i ramy do testowania terapii angiogennych.

Wprowadzenie

Choroba tętnic obwodowych (PAD) dotyka głównie kończyn dolnych. PAD jest spowodowany miażdżycą, niedrożnością tętnicy, która może powodować poważne ograniczenie przepływu krwi w kończynach dolnych1. Chromanie przestankowe jest pierwszym objawem PAD i odnosi się do bólu mięśni podczas chodzenia. CLI jest najcięższym stadium PAD, diagnozowanym u pacjentów, którzy wykazują niedokrwienny ból spoczynkowy, owrzodzenia lub gangrenę2. Pacjenci z CLI mają wysokie ryzyko amputacji, zwłaszcza jeśli nie są leczeni3. Rewaskularyzacja kończyn dolnych (zarówno za pomocą operacji otwartej, jak i zabiegu wewnątrznaczyniowego) jest obecnie jedynym sposobem na uratowanie kończyny. Jednak około 30% pacjentów z CLI nie nadaje się do tych procedur, z powodów, które obejmują lokalizację zmian, wzorzec niedrożności tętnic i rozległą chorobę współistniejącą4,5. Dlatego potrzebne są nowe terapie dla tych pacjentów, których w przeciwnym razie nie można by leczyć, a promowanie angiogenezy jest strategią będącą przedmiotem bardziej intensywnych badań.

Przed testami na ludziach, skuteczność i bezpieczeństwo nowych terapii in vivo musi być rozważone na modelach zwierzęcych. Opracowano kilka modeli do badania CLI, głównie poprzez wywoływanie niedokrwienia kończyn tylnych (HLI) u myszy6,7,8,9,10. Jednak modele te różnią się kilkoma aspektami, w tym charakterem tętnic, które są podwiązane i/lub wycinane, oraz tym, czy otaczające je żyły i nerwy są również preparowane6,7,8,9,10. Podsumowując, aspekty te wpłyną na nasilenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u każdego zwierzęcia, co utrudni porównanie wyników. Dlatego tak ważne jest opracowanie skutecznego protokołu, w którym procedura indukcji niedokrwienia i ocena różnych celów powinny być ustandaryzowane, aby ocenić, czy dana terapia angiogenna będzie skuteczna. Protokół eksperymentalny obejmujący wszystkie te aspekty zapewniłby kompleksowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których terapie angiogenne wywierają swoje skutki, oraz miarę ich skuteczności w każdym z ich wyników. Dobrym przykładem są dwie odrębne prace opublikowane niedawno przez nasz zespół11,12, w których różne podejścia do indukcji angiogenezy terapeutycznej zostały ocenione przy użyciu tego samego protokołu, który zostanie opisany bardziej szczegółowo w tym protokole.

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie powtarzalnego modelu eksperymentalnego, który może naśladować efekty CLI i położyć eksperymentalne podstawy do kompleksowej oceny funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych efektów domniemanych czynników angiogennych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zgodne z dyrektywą 2010/63/UE i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt oraz licencjonowane przez DGAV, portugalski właściwy organ ds. ochrony zwierząt (numer licencji 023861/2013)

UWAGA: Kilka substancji chemicznych użytych w protokołach jest toksycznych i szkodliwych. Prosimy o stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami)

1. Mysi model niedokrwienia kończyn tylnych

UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane na 22-tygodniowych samicach myszy C57BL/6.

  1. Przygotowanie roztworów
    1. Przygotowanie roztworu znieczulającego
      Uwaga: Ta kombinacja środków znieczulających (medetomidyna i ketamina) zapewnia unieruchomienie do 30 minut i 15-minutowe okno chirurgiczne. Efekt ten może być odwrócony przez podanie atipamezolu.
      1. Za pomocą czystej strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 1 ml medetomidyny (1 mg/kg masy ciała), wyeliminować pęcherzyki powietrza w celu dokładnych pomiarów i dodać do probówki Falcon o pojemności 15 ml.
      2. Za pomocą czystej strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 0,75 ml ketaminy (75 mg/kg masy ciała), wyeliminować pęcherzyki powietrza w celu dokładnych pomiarów i dodać ją do 15 ml probówki Falcon zawierającej medetomidynę.
      3. Dodać 8,25 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby otrzymać 10 ml roztworu znieczulającego.
      4. Zidentyfikuj probówkę z nazwą związków, datą zmieszania i datą ważności.
      5. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotowanie roztworu przeciwdziałającego uspokajająco
      1. Za pomocą czystej strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 1 ml atipamezolu (5 mg/kg masy ciała), usunąć pęcherzyki powietrza w celu uzyskania dokładnych pomiarów i dodać go do probówki Falcon o pojemności 15 ml.
      2. Dodać 9 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby otrzymać 10 ml roztworu powrotnego.
      3. Zidentyfikuj probówkę z nazwą związków, datą zmieszania i datą ważności.
      4. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotowanie pooperacyjnego roztworu przeciwbólowego
      1. Za pomocą czystej strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 0,5 ml buprenorfiny (100 μl/15-30 g masy ciała), wyeliminować pęcherzyki powietrza, aby uzyskać dokładne pomiary, i dodać ją do 15 ml probówki Falcon.
      2. Dodać 9,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby otrzymać 10 ml roztworu przeciwbólowego.
      3. Zidentyfikuj probówkę z nazwą związków, datą zmieszania i datą ważności.
      4. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
  2. Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych
    1. Narzędzia chirurgiczne potrzebne do tej interwencji: spiczaste kleszcze, nożyczki sprężynowe, uchwyt igły okulistycznej, nożyczki chirurgiczne i uchwyt na igłę. Przed użyciem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Użyj bawełnianych wacików do rozwarstwienia podskórnej tkanki tłuszczowej.
    2. Załadować do strzykawki roztwór znieczulający przed wzięciem myszy do ręki.
    3. Unieruchomić zwierzę, przykładając siłę za uszami do siatki klatki, przytrzymując jak najwięcej skóry, aby utrzymać mysz w bezruchu.
    4. Trzymaj zwierzę przechylone z opuszczoną głową i wykonaj dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu znieczulającego, trzymając strzykawkę pod kątem 45° względem ciała myszy.
    5. Sprawdź, czy nie ma odruchów wycofania pedału, aby ocenić głębokość znieczulenia.
    6. Usuń włosy z prawej kończyny tylnej za pomocą golarki elektrycznej. Użyj peelingu z mydłem dezynfekującym z chlorheksydyną do przygotowania skóry. Użyj czystego ręcznika papierowego, aby usunąć mydliny. Nałóż peeling chirurgiczny z chlorheksydyną i zabezpiecz obszar skóry sterylną serwetą przed przetransportowaniem myszy do sterylnego gabinetu chirurgicznego.
    7. Umieść zwierzę w odleżynie grzbietowej i skrępuj je czterema kończynami rozstawionymi i zabezpieczonymi taśmą.
      UWAGA: Wykonaj zabieg na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać stabilną temperaturę ciała zwierzęcia; Zabieg chirurgiczny wykonywany jest przy użyciu mikroskopu preparacyjnego w powiększeniu 10x lub 20x.
    8. Zastosuj roztwór antyseptyczny chlorheksydyny za pomocą sterylnej gazy, aby sfinalizować przygotowanie skóry. Za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego numer 11 wykonaj 1-centymetrowe nacięcie skóry nad udem prawej kończyny tylnej.
    9. Tępo wypreparuj podskórną tkankę tłuszczową, odsłaniając pęczek nerwowo-naczyniowy. Za pomocą spiczastych kleszczy, nożyczek sprężynowych i uchwytu igły okulistycznej otwórz błoniastą osłonkę biodrowo-udową, aby odsłonić dystalne zewnętrzne naczynia biodrowe i udowe.
    10. Wypreparuj i oddziel naczynia (tętnicę i żyłę) od nerwu. Za pomocą niewchłanialnego szwu polipropylenowego 7.0 podwiązać dystalną tętnicę i żyłę biodrową zewnętrzną oraz dystalną tętnicę i żyłę udową.
    11. Przeciąć odcinek tętnicy biodrowo-udowej i żył między węzłami dystalnymi i proksymalnymi za pomocą nożyczek sprężynowych.
    12. Zamknij nacięcie szwem wchłanialnym (np. szwem 5.0 Vicryl).
    13. Umieścić w strzykawce roztwór przeciwuspokajający i zastosować tę samą metodę, opisaną w ppkt 1.2.3 i 1.2.4, aby wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu przeciwuspokajającego.
  3. Monitorowanie pooperacyjne
    UWAGA: Zwierzęta są uważnie obserwowane co 15-20 minut, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta dobrze regenerują się po zażyciu środka uspokajającego; Znieczulone zwierzęta nigdy nie są pozostawiane bez opieki.
    1. Oceń powrót do zdrowia po znieczuleniu: 1) monitoruj tempo i głębokość oddychania; 2) oceniać odruchy zwierząt (położenie pedału i oczu)
    2. Wstrzyknięcie podskórne środka przeciwbólowego należy wykonywać co 8-12 godzin.
    3. Monitoruj zwierzęta codziennie po operacji, rejestrując krótki opis stanu zdrowia zwierzęcia i wyglądu miejsca operacji, upewnij się, że wszystkie szwy są zamknięte.
    4. Ponownie zszyj nacięcie, jeśli wystąpi rozejście. Jeśli to się nie powiedzie, nałóż film barierowy na nacięcie, aby chronić przed moczem, wydalaniem kału, tarciem i ścinaniem skóry oraz wspomóc proces gojenia.

2. Ocena efektu angiogennego

UWAGA: Po indukcji niedokrwienia, zastosuj środek terapeutyczny w badaniu i wykonaj następujące procedury. Kroki podjęte w innych punktach czasowych są szczegółowo opisane w odpowiedniej sekcji.

  1. Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej
    1. Usuń włosy z obu kończyn tylnych na dzień przed analizą za pomocą golarki elektrycznej, a następnie kremu do depilacji.
    2. Znieczulij myszy za pomocą roztworu znieczulającego.
    3. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C na 5 minut, aby upewnić się, że temperatura nie zmieni się podczas zabiegu
    4. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach z nogami zabezpieczonymi w pozycji wyprostowanej. Zmierz odległość między prawymi i lewymi nogami i stopami dla każdego zwierzęcia, ponieważ pozycja zwierzęcia powinna być podobna, ilekroć procedura musi być powtórzona, aby śledzić zmiany w perfuzji kończyn tylnych w czasie.
    5. Rozpocznij pozyskiwanie danych za pomocą laserowego obrazowania perfuzyjnego Dopplera.
    6. Po zakończeniu akwizycji przywróć znieczulenie roztworem przeciwuspokajającym.
    7. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół niedokrwiennej kończyny tylnej i porównywalny obszar ROI wokół nieniedokrwiennej kończyny tylnej.
    8. Obserwuj wartości strumienia i określ perfuzję jako stosunek perfuzji w kończynie niedokrwiennej do perfuzji w kończynie niedokrwiennej. Zmiany współczynnika perfuzji są mierzone w czasie.
  2. Immunohistochemia i analiza gęstości naczyń włosowatych
    1. Po znieczuleniu poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Aby zebrać mięśnie brzuchatego łydki obu nóg, najpierw usuń skórę z obu tylnych kończyn.
    3. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa i oddziel ścięgno od kości za pomocą skalpela z 11 ostrzami.
    4. Przytrzymaj ścięgno Achillesa i oddziel mięsień od kości piszczelowej i strzałkowej aż do stawu kolanowego za pomocą nożyczek sprężynowych.
    5. Oddziel mięsień dwugłowy uda od mięśnia brzuchatego łydki.
    6. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć przyczepy mięśni brzuchatego łydki na poziomie stawu kolanowego.
    7. Zebrane mięśnie brzuchatego łydki umieść w orientacji poprzecznej na małym krążku korkowym za pomocą 10% tragakantu.
    8. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu podziału.
    9. Wyciąć 7 μm odcinki próbek mięśni na kriostacie i zamontować na szkiełkach podstawowych.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    10. Umieścić szkiełka podstawowe w butelce zawierającej schłodzony czysty aceton (około 50 ml) na 10 minut w temperaturze -20 °C.
    11. Dodaj peroksydazę wodorową 0,3% rozcieńczoną w metanolu (50 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Przemyć dwukrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (50 ml), w sumie przez 10 minut.
    13. Użyj hydrofobowego pisaka wokół sekcji.
      UWAGA: Użycie długopisu hydrofobowego pozwala na zmniejszenie ilości roztworów zużywanych podczas trwania protokołu. Do wszystkich inkubacji należy użyć 100 μl wszystkich roztworów na sekcję.
    14. Zastosuj blokujący roztwór 5% surowicy króliczej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    15. Próbki inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD31 szczura rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 1 % albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    16. Umyj trzy razy w PBS przez łącznie 30 minut.
    17. Dodać drugorzędowe biotynylowane królicze przeciwciało IgG przeciwko szczurom w proporcji 1:200 w 1% BSA w PBS i 5% surowicy królika przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    18. Umyć w PBS jak poprzednio i dodać znakowany kompleks peroksydazy sprzężonej z awidyną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    19. Płukać 3 razy w PBS przez 5 minut i dodawać zestaw substratów peroksydazy diaminobenzydyny (DAB) na kolejne 5 minut.
    20. Przed montażem należy przeciwbarwić sekcje hematoksyliną przez 10 sekund
      21. .
    21. Zmierz gęstość naczyń włosowatych za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola (tj. liczba naczyń włosowatych na liczbę miocytów) w 2 różnych sekcjach po 4 różne obszary anatomiczne w każdej próbce.
  3. Perfuzja środka kontrastowego
    1. Znieczulij myszy za pomocą roztworu znieczulającego.
    2. Wykonaj laparotomię pośrodkową za pomocą ostrza skalpela numer 15.
    3. Odsłonić aortę brzuszną i żyłę główną ogonową, po cofnięciu bocznie jelita cienkiego i użyciu nożyczek sprężynowych.
    4. Wprowadzić jeden cewnik o rozmiarze 26 czaszkowo do aorty brzusznej, a drugi do żyły głównej ogonowej w tym samym kierunku.
    5. Zabezpiecz cewniki na miejscu za pomocą jedwabnego szwu 5/0, aby wykonać szew podtrzymujący.
    6. Przemyć układ naczyniowy roztworem soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C zawierającym heparynę (500 jednostek/100 ml) wepchniętym do aorty brzusznej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Kontynuuj delikatną perfuzję, aż pojawi się klarowny roztwór wydobywający się z cewnika umieszczonego wewnątrz żyły ogonowej.
      UWAGA: Zwykle do przepłukania układu naczyniowego dorosłego szczura potrzeba od 30 do 40 ml heparynizowanego roztworu soli
      7. fizjologicznej.
    7. Podawać mieszaninę adenozyny (1 mg/l) i papaweryny (4 mg/l) przez 2 min.
    8. Wstrzyknąć do cewnika aortalnego 10 ml mieszaniny 50% siarczanu baru i 5% żelatyny.
      UWAGA: Roztwór należy przechowywać w temperaturze 60 °C, aby uniknąć zgęstnienia.
    9. Pozostawić myszy w temperaturze -4 °C na co najmniej 4 godziny, aby umożliwić zastygnięcie odlewu naczyniowego.
    10. Usuń skórę z dolnej części ciała każdej myszy.
  4. Diafonizacja - technika Spalteholza
    1. Napraw myszy, zanurzając je w 10% roztworze formaldehydu na co najmniej 72 godziny.
    2. Wybielaj myszy przez zanurzenie w 30% roztworze nadtlenku wodoru na 24 godziny.
    3. Odwodnić myszy za pomocą techniki substytucji przez zamrożenie. Metodologia ta polega na poddaniu myszy kolejnym pasażom (średnio czterema) czystego acetonu w temperaturze -20 °C przez 24 godziny każde.
    4. Klaruj myszy, zanurzając je w roztworze zawierającym mieszaninę 100% benzoesanu benzylu i 100% salicylanu metylu w proporcji 3:5 (ta mieszanina jest również znana jako roztwór Spalteholza) 13.
    5. Pozostaw myszy zanurzone w roztworze Spalteholz w komorze próżniowej, aż stanie się przezroczysty, co zwykle trwa od 5 do 7 dni.
    6. Wymień roztwór, jeśli stanie się ciemny, zanim próbka stanie się przezroczysta
      7. .
  5. Kwantyfikacja statków zabezpieczających
    1. Obserwuj myszy zawieszone w roztworze Spalteholza pod wpływem prześwietlenia za pomocą mikroskopu stereotaktycznego. Użyj kleszczy mikrochirurgicznych, aby delikatnie go chwycić i przesunąć.
    2. Sfotografuj całe kończyny za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu.
    3. Uzyskaj zdjęcia całych kończyn za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    4. Wykonaj ręczną segmentację naczyń pobocznych, podświetlając je za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
      UWAGA: Naczynia boczne są zdefiniowane zgodnie z definicją Longlanda, zdefiniowany trzon, strefa środkowa i re-entrant, o średnicy od 20 do 300 μm, z wyłączeniem tętnic udowych, odpiszczelowych i podkolanowych oraz wszystkich struktur żylnych.
    5. Zdefiniuj ROI u każdej myszy w tym samym regionie anatomicznym w przywodzicielu, otaczającym i poniżej okluzji chirurgicznej.
    6. Określ ilościowo gęstość naczyń pobocznych (CVD) w równoważnych ROI odpowiadających 20% całkowitej powierzchni kończyny. CVD oblicza się jako stosunek powierzchni naczyniowej do obszarów ROI. Wszystkie pomiary gęstości są wykonywane za pomocą oprogramowania ImageJ.
      UWAGA: Przyjmuje się, że wartość CVD kończyny niedokrwiennej dla każdej myszy odpowiada 100%, aby wykluczyć różnice w procedurach anatomicznych, perfuzji lub diafonizacji. Odsetek CVD w kończynie niedokrwiennej obliczono zatem w stosunku do nieniedokrwiennej.
    7. Określ procentowy wzrost CVD jako różnicę między procentem CVD wśród kończyn niedokrwiennych i nieniedokrwiennych.
  6. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji naczyń włosowatych
    1. Po znieczuleniu poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Aby zebrać mięśnie brzuchatego łydki obu nóg, usuń skórę z myszy z obu tylnych kończyn.
    3. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa i oddziel ścięgno od kości za pomocą skalpela z 11 ostrzami.
    4. Przytrzymaj ścięgno Achillesa i oddziel mięsień od kości piszczelowej i strzałkowej aż do stawu kolanowego za pomocą nożyczek sprężynowych.
    5. Oddziel mięsień dwugłowy uda od mięśnia brzuchatego łydki.
    6. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć przyczepy mięśni brzuchatego łydki na poziomie stawu kolanowego.
    7. Zebrane mięśnie brzuchatego łydki umieścić w orientacji poprzecznej na małym krążku korkowym za pomocą 10 % tragakantu.
    8. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu podziału.
    9. Wyciąć na kriostacie 12 μm odcinki próbek mięśniowych i zamontować na szkiełkach podstawowych.
      UWAGA: W celu ochrony RNA weź wstępnie schłodzone szkiełko i dotknij palcem (rękawiczkami) tylnej strony szkiełka, aby ogrzać tylko obszar do umieszczenia sekcji. Przenieść fragment z noża do kriostatu, dotykając rozgrzanego obszaru i suszyć w temperaturze -20 °C w kriostacie przez 2-3 minuty. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
      1. Umieścić szkiełka podstawowe w butelce zawierającej schłodzony czysty aceton (około 50 ml) na 5 minut w temperaturze -20 °C i wysuszyć na powietrzu.
      2. Użyj hydrofobowego pisaka wokół sekcji.
        UWAGA: Użycie długopisu hydrofobowego pomaga w zmniejszeniu ilości roztworów zużywanych podczas protokołu. Do wszystkich inkubacji należy użyć 100 μl wszystkich roztworów na sekcję.
      3. Ponownie uwodnić za pomocą 2 M NaCl/PBS w temperaturze 4 °C i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD31 szczura w temperaturze 1:500 w 2M NaCl/PBS.
      4. Prać dwukrotnie w 2M NaCl/PBS przez łącznie 6 minut.
      5. Dodać drugorzędowe biotynylowane królicze przeciwciało IgG przeciwko szczurom w stosunku 1:200 w 2M NaCl/PBS i 5% surowicy królika przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Przemyć 2 M NaCl/PBS jak poprzednio i dodać znakowany kompleks peroksydazy sprzężonej z awidyną przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      7. Spłucz i dodaj zestaw substratu do peroksydazy DAB na 5 minut.
      8. Odwodnić sekcje w lodowatym 90 % etanolu, a następnie w 100 % etanolu i pozostawić do wyschnięcia.
      9. Wypreparuj 10 000 naczyń włosowatych na mysz za pomocą laserowego systemu mikrodysekcji wyposażonego w impulsowy laser półprzewodnikowy o długości fali 355 nm i katapultuj wypreparowane naczynia włosowate do samoprzylepnej nakrętki do probówki z mikrodymą.
  7. Ekstrakcja RNA, synteza cDNA, wstępna amplifikacja i RT-PCR
    1. Wyizoluj całkowite RNA z mikrowypreparowanych naczyń włosowatych za pomocą odpowiedniego zestawu, uzyskany całkowity RNA wynosi 1,5-3 ng/μL.
    2. Użyj zestawu do syntezy cDNA do syntezy i dwóch rund wstępnej amplifikacji, używając starterów opisanych w Tabeli 1.
    3. Wykonaj RT-PCR dla tych samych celów, które opisano w poprzednim kroku. Należy użyć programu składającego się z początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 50 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Za pomocą opisanego protokołu przetestowano mezenchymalne komórki macierzyste z tkanki Whartona pępowiny oraz niskodawkowe promieniowanie jonizujące (LDIR) jako potencjalne terapie naczyniotwórcze11,12. Pomiar przepływu krwi metodą laserowej dopplerowskiej perfuzji przeprowadzono przed wywołaniem niedokrwienia oraz w ustalonych punktach czasowych, począwszy od momentu bezpośrednio po indukcji niedokrwienia aż do 45. dnia po jej wywołaniu. Wyniki pomiaru perfuzji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysie modele CLI polegały głównie na podwiązaniu tętnicy udowej tuż dystalnie do początku profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Wykazano, że pozostawia to większość krążenia pobocznego nienaruszoną, co przywraca przepływ krwi do kończyny w ciągu 7 dni 9. Usunięcie łożyska pobocznego można osiągnąć poprzez wyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy José Rino i Tânii Carvalho, szefom Zakładu Bioobrazowania oraz Laboratorium Histologii i Patologii Porównawczej Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Dziękujemy również Wiaczesławowi Sushchykowi z Wydziału Anatomii Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Odniesienie do finansowania: projekt finansowany przez UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira jest wspierana przez stypendium (SFRH/BD/80483/2011) z Fundação para a Ciência e Tecnologia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7500 Szybki odczynnik do PCRApplied BiosystemsAceton
Merk1000141000; Uwaga - wysoce łatwopalny
odczynnik adenozynywalduharm
AtipamezoleOrionOdczynnik Pharma
Siarczan baru (Micropaque)Guebert8671404 (ref. Infarmed)Odczynnik
BuprenorfinaRichterOdczynnik farmaceutyczny
Carl Zeiss Opmi-1 FC Mikroskop chirurgicznyCarl Zeiss, NiemcyInstrument
cDNA RT2 PreAMP Zestaw do syntezy cDNAQiagen7335730Odczynnik
Cryostat Leica CMLeica Microsystems3050SInstrument
DAB zestaw substratu peroksydazyDAKO; Vector LaboratoriesK3468Odczynnik
do peroksydazy wodorowejMerk1072090250Odczynnik; Uwaga -
odczynnik do długopisu hydrofobowegonocif Dako411121 Uwaga - toksyczny
KetamidorRichterpharmaCN: 580393,7 630/01/12 Odczynnik Dfvf
Laserowy obrazownik perfuzyjny Doppler moorLDI2-HIRMoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Wielka Brytania5710Instrument
Leica DM2500 pionowy mikroskop jasnego polaLeica MicrosystemsInstrument
MedetorVirbac037/01/07RFVPTOdczynnik
metanolVWRUN1230Odczynnik; Uwaga - toksyczny i wysoce łatwopalny
odczynnikPapaverineLabesfal
Pentano IssoMerk1060561000odczynnik; Uwaga - wysoce łatwopalny
Power SYBR® GreenApplied Biosystems4309155 Odczynnik
Oczyszczony szczur anty-mysi CD31Odczynnik Pharmingen550274
Zestaw RNeasy MicroQiagen74004Odczynnik
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733XZestaw do szwów
VECTASTAIN ABC HRP (Peroksydaza, IgG szczurów)Zestaw ABC Vectastain; Vector LaboratoriesPK-4004Odczynnik
Vicryl5.0 / Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202 / UL101Szew
Zeiss PALM MicroBeam Laserowy system mikrodysekcjiMikroskopia Carl Zeiss, Niemcy1023290916Instrument
Mikroskop stereotaktycznyCarl Zeiss, NiemcyInstrument
Aparat cyfrowyLinuxinstrument
w czasie rzeczywistym;

Bibliografia

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laserowa dopplerowska ocena przep ywuanaliza g sto ci naczy kapilarnychg sto naczy kolateralnychekspresja gen w RT PCRlaserowa mikrodysekcja przechwytywaniami sie brzuchaty ydkibarwienie przeciwcia em CD31ekspresja gen w angiogennych

Powiązane artykuły