Artykuł metodologiczny

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

DOI:

10.3791/59587

⸱

30 kwietnia 2019

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz jest powszechnie wykorzystywana jako organizm modelowy do badania chorób dróg żółciowych. Aby ocenić rozwój i funkcję układu żółciowego, stosuje się różne techniki, w tym chemię surowicy, analizę histologiczną i barwienie immunologiczne dla określonych markerów. Chociaż techniki te mogą dostarczyć ważnych informacji o układzie żółciowym, często nie dają pełnego obrazu wad rozwojowych dróg żółciowych (ChAD) w całej wątrobie. Wynika to częściowo z silnej zdolności wątroby myszy do odprowadzania żółci nawet u zwierząt ze znacznym upośledzeniem rozwoju dróg żółciowych. Poniżej przedstawiamy prostą metodę obliczania średniej liczby BD związanych z każdą żyłą wrotną (PV) w sekcjach obejmujących wszystkie płaty zmutowanych/transgenicznych myszy. W tej metodzie wątroby są montowane i dzielone w stereotypowy sposób, aby ułatwić porównanie różnych genotypów i warunków eksperymentalnych. BD są identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej cholangiocytów barwionych cytokeratyną, a następnie zliczane i dzielone przez całkowitą liczbę PV obecnych w odcinku wątroby. Jako przykład pokazujemy, w jaki sposób ta metoda może wyraźnie odróżnić myszy typu dzikiego od mysiego modelu zespołu Alagille'a. Przedstawiona tutaj metoda nie może zastąpić technik wizualizujących trójwymiarową strukturę drzewa żółciowego. Oferuje jednak łatwy i bezpośredni sposób ilościowej oceny rozwoju BD i stopnia powstawania reakcji przewodowej u myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drzewo żółciowe jest kluczową częścią wątroby ssaków, umożliwiając przepływ żółci z hepatocytów do jelit. Wewnątrzwątrobowe drogi żółciowe (BD) są tworzone przez cholangiocyty, które różnicują się od hepatoblastów bipotencjalnych poprzez sygnalizację Notch i TGFβ1,2. Właściwa specyfikacja i zaangażowanie cholangiocytów oraz ich składanie się w dojrzałe BD mają kluczowe znaczenie dla rozwoju wewnątrzwątrobowego drzewa żółciowego. Ponieważ wątroba rośnie podczas rozwoju lub regeneracji narządów, układ żółciowy musi rozwijać się wzdłuż wątroby, aby zapewnić prawidłowy drenaż żółci. Co więcej, wiele chorób syndromicznych i niesyndromicznych powoduje niedostatek wewnątrzwątrobowych BDs3. Ponadto szereg ostrych i przewlekłych chorób wątroby powoduje tak zwane reakcje przewodowe w wątrobie, które definiuje się jako obecność znacznej liczby komórek, które wyrażają markery żółciowe, ale niekoniecznie pochodzą z komórek żółciowych lub tworzą opatentowane BDs4. W wieloukładowym zaburzeniu zespołu Alagille'a (ALGS) haploinsuficjacja liganda Notch jagged1 (JAG1) skutkuje słabym powstawaniem BD i cholestazą5,6. Nasze laboratorium wykazało niedawno, że wcześniej wygenerowana heterozygotyczna linia myszy Jag1 7 jest zwierzęcym modelem niedoboru BD w ALGS8. W tym mysim modelu ALGS cholangiocyty są nadal obecne. Nie zobowiązują się jednak do włączenia do dojrzałych, opatentowanych BDs8. Dlatego analiza wątroby w modelu niedoboru ChAD wymaga czegoś więcej niż tylko pozornej obecności lub braku cholangiocytów. Ważne jest, aby dokładnie ocenić stopień, w jakim dojrzałe BD są obecne w wątrobie.

W patologii anatomicznej istnieją akceptowane metody ilościowe do oceny, czy występuje niedostatek BD9. Na przykład badania nad ALGS u pacjentów często określają ilościowo stosunek BD do żyły wrotnej (PV), analizując co najmniej 10 naczyń wrotnych na biopsję wątroby9,10. Analiza kształtu i ogólnej obecności lub braku opatentowanych BD, w połączeniu z chemią surowicy, może dostarczyć cennych informacji na temat rozwoju BD u myszy11,12,13. Jednak myszy mogą stracić znaczną liczbę BD przy tylko niewielkim wzroście poziomu bilirubiny w surowicy8. W związku z tym metoda ilościowa, która ocenia liczbę BD obecnych na PV, może zapewnić bardziej bezpośrednią miarę stopnia niedoboru BD u myszy. W niedawnym raporcie określiliśmy ilościowo liczbę BD na PV we wszystkich płatach wątroby i odnotowaliśmy znaczny spadek stosunku BD do PV w Jag1+/– animals8. W trakcie naszej analizy zauważyliśmy, że pomimo znacznego zróżnicowania stopnia odpowiedzi zapalnej i reakcji przewodowych, stosunek BD do PV nie wykazuje dużej zmienności8. Co więcej, kwantyfikacja stosunku BD do PV pozwoliła nam wykazać, że usunięcie jednej kopii genu glikozylotransferazy Poglut1 u zwierząt Jag1 +/– może znacznie poprawić ich niedostatek BD 8. W tle Jag1 +/+ warunkowa utrata Poglut1 w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych powoduje postępujący wzrost liczby BD, który jest skromny (20-30%) przy P7, ale staje się widoczny u dorosłych8. Ponownie, technika ta pozwoliła nam wykazać, że nawet przy P7 wzrost gęstości BD u tych zwierząt jest statystycznie istotny. Warto zauważyć, że zwiększona gęstość BD w tym genotypie w wieku czterech miesięcy została również potwierdzona za pomocą analizy odlewu z żywicy. 8 Te obserwacje i inne raporty, które mierzyły gęstość BD w różnych modelach myszy ALGS14,15 skłoniły nas do włączenia tej metody do naszej ogólnej strategii analizy wad dróg żółciowych u różnych zmutowanych i transgenicznych myszy.

Tutaj szczegółowo opisujemy prostą technikę, która może być użyta do zbadania stopnia niedoboru BD w mysich modelach choroby wątroby (Rysunek 1). W tej metodzie barwienie markerami cholangiocytów cytokeratyną (CK) 8 i CK19 (dalej CK, wsCK) o szerokim spektrum działania) służy do wizualizacji BD i nieinkorporowanych cholangiocytów w wątrobie myszy. Przeciwciało przeciwko aktynie alfa-mięśni gładkich (αSMA) dodaje się do barwienia w celu znakowania naczyń. Systematyczna analiza stosunku BD do PV w sekcji obejmującej wszystkie płaty wątroby zapewnia, że dla każdego genotypu analizowana jest duża liczba PV. Ponieważ nasza metoda opiera się na ilościowym określaniu BD i PV na obrazach 2D, nie nadaje się do badania wpływu danej mutacji na strukturę 3D drzewa żółciowego lub integralność małych kanałów żółciowych. Niemniej jednak zapewnia badaczom prostą i obiektywną strategię oceny rozwoju dróg żółciowych u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były trzymane w barierowym obiekcie dla zwierząt w Baylor College of Medicine, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt.

1. Pobieranie tkanek wątroby myszy

  1. Przygotowanie myszy do zbioru wątroby
    1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą izofluranu.
    2. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy myszy, aby zapewnić śmierć.
    3. Wykonaj poprzeczne nacięcie około jednego cala poniżej klatki piersiowej.
    4. Odsłoń całą brzuszną powierzchnię wątroby.
  2. Kolekcja wątroby myszy
    1. Ostrożnie, małymi nożyczkami, przetnij więzadła łączące wątrobę z innymi narządami w jamie brzusznej.
    2. Przeciąć wspólny BD, aby odłączyć wątrobę od jelita.
    3. Ostrożnie usuń wątrobę, trzymając za woreczek żółciowy i natychmiast umieść w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej w trzech czwartych przez 4% paraformaldehydu (PFA).

2. Utrwalenie i zatopienie wątroby w parafinie

  1. Utrwalenie
    1. Utrwalić tkankę wątroby przez 48 godzin w 4% PFA w temperaturze 4 °C.
    2. Przemywać chusteczkę 70% EtOH przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    3. Przemyć chusteczkę dwukrotnie 95% EtOH przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    4. Przemyć chusteczkę dwukrotnie 100% EtOH przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  2. polana
    1. Przemyć tkankę wątroby środkiem czyszczącym (tabela materiałów) trzy razy przez 30 minut każdy w temperaturze pokojowej.
      nuta: Wątroba powinna być sztywna po trzecim płukaniu.
  3. Zatapianie w parafinie
    1. Umieść kasetę z bibułkami w formie na chusteczki higieniczne w wosku parafinowym na 3 prania po 30 minut każde. Wosk należy podgrzać do temperatury 60 °C.
    2. Napełnij formę bibułkową woskiem parafinowym do wysokości trzech czwartych i trzymaj na bloku grzewczym w temperaturze 60 °C.
    3. Umieść wątrobę w formie brzuszną stroną skierowaną do góry.
    4. Ostrożnie wyjmij formę z bloku grzewczego.
    5. Umieść górną część kasety na formie i uzupełnij gorącą płynną parafiną.
    6. Pozostaw formę i blok do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez noc.
      nuta: Bloki tkanek mogą być teraz przechowywane w temperaturze pokojowej.

3. Cięcie tkanki wątroby

  1. Przygotowanie bloku do przekroju
    1. Umieść formę na lodzie na 5 minut przed wyjęciem bloku z formy.
    2. Umieść blok na lodzie z bibułką laboratoryjną znajdującą się między blokiem a lodem.
    3. Trzymaj blok na lodzie, gdy nie jest cięty, aby uzyskać najlepsze wyniki krojenia tkanek.
  2. Cięcie bloków wątroby
    1. Za pomocą mikrotomu zacznij od przekroju przez powierzchowną, grzbietową stronę wątroby. Sekcje powinny wynosić 5 μm.
    2. Sprawdź powierzchowne skrawki pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że skrawki nie są ścięte ani złożone.
    3. Weź odcinek wątroby, który zawiera płat ogoniasty.
      nuta: W przypadku niektórych bloków będziesz mieć lewy, przyśrodkowy, prawy i ogoniasty płat na tym samym wycinku tkanki.
    4. W przypadku bloków, w których wszystkie cztery płaty nie są obecne na tym samym slajdzie, kontynuuj krojenie, aż lewy, środkowy i prawy płat znajdą się na tym samym slajdzie.

4. Immunohistochemia dla wsCK i αSMA

  1. Przetwarzanie szkiełek do immunohistochemii
    1. Wybierz jeden preparat dla każdego genotypu, który ma być analizowany.
    2. Myć szkiełko przez 15 minut w ksylenie, 100% EtOH, 95% EtOH i na koniec 70% EtOH (3 x 5 min w każdym roztworze).
    3. Myć szkiełko przez 5 minut w dejonizowanymH2O.
    4. Zanurzyć szkiełko w roztworze do pobierania antygenu (na bazie Tris, o wysokim pH).
    5. Podgrzewać pod ciśnieniem w szybkowarze przez 3 minuty przy 10 psi.
    6. Pozwól szkiełku ostygnąć do temperatury pokojowej (około 35 min).
  2. Blokowanie skrawków tkanki
    1. Za pomocą Pap Pen obrysuj sekcje na slajdzie.
    2. Nałóż sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) + 0,1% Tween na pokrycie sekcji dwukrotnie, po 5 minut każde.
    3. Utworzyć bufor blokujący, mieszając normalną surowicę kozią (NGS) w stosunku 1:50 w PBS + 0,3% Triton. Aby mieć wystarczającą ilość buforu zarówno do aplikacji przeciwciał blokujących, jak i pierwotnych, wystarczy 100 μl na sekcję.
    4. Nałożyć 100 μl roztworu blokującego na sekcję.
    5. Inkubować szkiełka pokryte roztworem blokującym w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Barwienie dla wsCK i αSMA
    1. Rozcieńczyć przeciwciała anty-CK8 i anty-CK1916 (Developmental Studies Hybridoma Bank, odpowiednio TROMA-I i TROMA-III) 1:20 w buforze blokującym do barwienia dla wsCK. Rozcieńczyć przeciwciało anty-αSMA17 (Tabela materiałów) do 1:200 w tym samym buforze.
    2. Nałożyć 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał zawierającego wszystkie trzy przeciwciała do każdej sekcji.
    3. Inkubować szkiełka pokryte roztworem przeciwciała w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Umyj szkiełka preparatem PBS + 0,1% Triton trzykrotnie po 5 minut każde.
    5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (anty-szczur-Alexa488 i anty-mysz-Cy5) 1:200 w PBS + 0,3% Triton.
    6. Nanieść 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych zawierającego oba przeciwciała drugorzędowe na szkiełka.
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Barwienie jądrowe i montaż DAPI
    1. Umyj szkiełka trzy razy po 5 minut każda.
    2. Nakładaj 100 μl DAPI (1:3000) na każdą sekcję przez 10 minut.
    3. Nałóż na szkiełka podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu (tabela materiałów) i umieść szklane szkiełko nakrywkowe na skrawkach tkanki. Pozostawić szkiełka na noc w temperaturze 4 °C. Uszczelnij szkiełka następnego dnia.
    4. Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C i zobrazuj w ciągu 1 tygodnia od zamontowania.

5. Obrazowanie i kwantyfikacja BD

  1. Obrazowanie wycinków wątroby
    1. Przed obrazowaniem należy zaślepić się na genotyp próbki z pomocą członka laboratorium. Upewnij się, że wszystkie pliki obrazowania są pozbawione genotypu lub innych specyficznych informacji identyfikujących poza numerem zwierzęcia/próbki.
    2. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wykonaj 20-krotne zdjęcia każdej sekcji z 1-krotnym zoomem i upewnij się, że zobrazowano każdą PV w poprzek wątroby. Uwzględnij płat lewy, przyśrodkowy, prawy i ogoniasty.
      nuta: Zwykle znajdujemy 60-90 dróg wrotnych na zwierzę, w zależności od wielkości wątroby.
    3. Aby zidentyfikować PV, poszukaj barwienia αSMA i wsCK. Struktury, które są αSMA dodatnie, ale nie mają barwienia wsCK, nie są strukturami wrotnymi.
  2. Identyfikacja i liczenie BD
    1. Utwórz arkusz kalkulacyjny z następującymi kolumnami: Liczba zwierząt/próby, Numer obrazu, Liczba PV i Liczba BD.
    2. Przeglądając każdy obraz, zidentyfikuj i zapisz liczbę PV na obrazie.
    3. Zidentyfikuj opatentowane BD na każdym obrazie na podstawie obecności cholangiocytów (wsCK+) otaczających definiowalne światło. Struktury powinny być odrębne i oddzielone mezenchymą od innych komórek wsCK+.
    4. Policz każdy patent BD i umieść go w tej samej kolumnie, co numer obrazu.
    5. Zrób to dla każdego zdjęcia fotowoltaiki.
    6. Obliczyć sumę wszystkich PV i wszystkich BD w próbce wątroby.
    7. Obliczyć stosunek BD do PV dla próbki wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej udokumentowaliśmy wady dróg żółciowych u zwierząt Jag1+/– mysi model klasy ALGS8. Aby określić stosunek BD do PV, podzieliliśmy wątroby myszy P30 i wybarwiliśmy je pod kątem CK8 i CK19 (wsCK) wraz z markerem naczyniowym αSMA. Następnie zobrazowaliśmy wszystkie PV w każdym z płatów wątroby. Jak pokazano w Rysunek 2A, zdefiniowaliśmy PV jako naczynia barwione αSMA, które mają przylegające do siebie zabarwienia wsCK (groty strzałek)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza rozwoju i naprawy ChAD u myszy jest ważnym narzędziem w badaniu patogenezy i mechanizmu zaburzeń cholestatycznych. Ponadto opracowanie nowych terapii jest częściowo uzależnione od ustalenia powtarzalnego i najlepiej mierzalnego fenotypu. Obecne fenotypowanie w modelach mysich zwykle obejmuje chemię surowicy, histologię wątroby i barwienie immunologiczne pod kątem markerów specyficznych dla typu komórki. Chociaż techniki te generują cenne informacje na temat struktury i funkcji układu żółciowego, nie zapewniają be...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie od National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 i R01 DK109982), Pilot/Feasibility Award od Texas Medical Center Digestive Disease Center w ramach NIH P30 DK56338, oraz Alagille Syndrome Accelerator Award od The Medical Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Isothesia (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
EksykatorBel-Art16-800-552
10%Mikroskopia elektronowa15712
Probówka 50 mlThermoScientific339653
70% etanoluDeconLaboratories 2401
95% etanoluDecon Laboratoria2801
100% etanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lczyszczący
Kaseta na chusteczki OmnisetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Parrafina
Pleśń tkankowaFisher Scientific62528-32
MikrotomMicromHM 325
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
KsylenFisher ScientificC8H10
Tris-Based Antigen RetrievalVector LaboratoriesH-3301
Ciśnienie CookerInstant PotLux Mini
Mini Mini Pap PenLife Technologies8877
Monolaurynian polioksyetylenu 20 sorbitanu (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Etoksylan oktylofenolu (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Normalna surowica koziaJackson Immunoresearch005-000-121
anty-CK8Badania rozwojowe Hybrydoma BankTROMA-IIdentyfikator rejestru przeciwciał AB531826
anty-CK19Hybridoma Identyfikatorrejestru przeciwciałTROMA-III
anty-&alfa;SMASigma AldrichA2547, klon 1A4
anty-szczur-Alexa488ThermoFisherA21208
anty-mysz-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 mikro szkło osłonoweVWR Life Sciences48393 059
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMI6000 B
KimtechScience05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Medium montażowe zapobiegające blaknięciu
PFA Nauki środek badania rozwojowe Bank AB2133570

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272(2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wska nik y y wrotnejsekcjonowanie w troby myszybarwienie immunohistochemicznecytokeratynaalfa SMAidentyfikacja przewod w ciowychutrwalanie tkanki w trobymetoda zatapiania w parafiniesekcjonowanie mikrotomemobrazowanie za pomoc mikroskopii fluorescencyjnej

Powiązane artykuły