Method Article

Analizy proteomiczne oparte na spektrometrii mas z wykorzystaniem bazy danych OpenProt w celu odkrycia nowych białek przetłumaczonych z niekanonicznych otwartych ramek odczytu

DOI:

10.3791/59589

⸱

April 11th, 2019

 , 
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2PROTEO, Quebec Network for Research on Protein Function, Structure, and Engineering

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OpenProt to swobodnie dostępna baza danych, która wymusza policistroniczny model genomów eukariotycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół korzystania z baz danych OpenProt podczas przeszukiwania zestawów danych spektrometrii mas. Wykorzystanie bazy danych OpenProt do analizy eksperymentów proteomicznych pozwala na odkrycie nowych i wcześniej niewykrywalnych białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adnotacja genomu jest kluczowa dla dzisiejszych badań proteomicznych, ponieważ rysuje zarysy krajobrazu proteomicznego. Tradycyjne modele adnotacji z otwartą ramką do czytania (ORF) narzucają dwa arbitralne kryteria: minimalną długość 100 kodonów i jeden ORF na transkrypcję. Jednak coraz więcej badań donosi o ekspresji białek z regionów rzekomo niekodujących, co podważa dokładność obecnych adnotacji genomu. Odkryto, że te nowe białka są kodowane albo w niekodujących RNA, 5' lub 3' nieulegających translacji regionach (UTR) mRNA, albo nakładających się na znaną sekwencję kodującą (CDS) w alternatywnym ORF. OpenProt to pierwsza baza danych, która wymusza policistroniczny model genomów eukariotycznych, umożliwiając adnotację wielu ORF na transkrypt. OpenProt jest swobodnie dostępny i oferuje niestandardowe pobieranie sekwencji białek dla 10 gatunków. Wykorzystanie bazy danych OpenProt do eksperymentów proteomicznych umożliwia odkrywanie nowych białek i podkreśla policistroniczną naturę genów eukariotycznych. Wielkość bazy danych OpenProt (wszystkie przewidywane białka) jest znaczna i należy ją uwzględnić w analizie. Jednak dzięki odpowiednim ustawieniom współczynnika fałszywych wykryć (FDR) lub użyciu ograniczonej bazy danych OpenProt użytkownicy uzyskają bardziej realistyczny obraz krajobrazu proteomicznego. Ogólnie rzecz biorąc, OpenProt jest ogólnodostępnym narzędziem, które będzie sprzyjać odkryciom proteomicznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, proteomika oparta na spektrometrii mas (MS-) stała się złotą techniką do rozszyfrowywania proteomów komórek eukariotycznych1,2,3,4,5. Ta metoda opiera się na aktualnych adnotacjach genomu w celu wygenerowania referencyjnej bazy danych sekwencji białek, która nakreśla zakres możliwości6,7,8. Jednak adnotacje genomu zawierają arbitralne kryteria adnotacji ORF, takie jak minimalna długość 100 kodonów i jeden ORF na transkrypt9,10. Coraz więcej badań kwestionuje obecny model adnotacji i donosi o odkryciach nieopisanych funkcjonalnych ORF w genomach eukariotycznych8,11,12,13,14. Te nowe białka znajdują się zakodowane w rzekomo niekodujących RNA, w nieulegających translacji regionach 5' lub 3' mRNA lub nakładających się na kanoniczną sekwencję kodującą (cCDS) w alternatywnej ramce. Chociaż większość z tych odkryć była przypadkowa, pokazują one zastrzeżenia obecnych adnotacji genomu i policistroniczną naturę genów eukariotycznych8.

Tutaj podkreślamy użycie baz danych OpenProt do proteomiki opartej na MS. OpenProt jest pierwszą bazą danych, która zawiera polistroniczny model adnotacji dla transkryptomów eukariotycznych. Jest on dostępny bezpłatnie pod adresem www.openprot.org15. Część tych przewidywanych ORF-ów byłaby losowa i niefunkcjonalna, dlatego OpenProt kumuluje dowody eksperymentalne i funkcjonalne, aby zwiększyć pewność. Dowody eksperymentalne obejmują ekspresję białek (przez stwardnienie rozsiane) i dowody translacji (przez profilowanie rybosomów)15. Dowody funkcjonalne obejmują ortologię białek (z podejściem podobnym do In-Paranoid) i przewidywanie domeny funkcjonalnej15.

OpenProt oferuje możliwość pobrania kilku baz danych, od zawierających tylko dobrze obsługiwane białka do baz danych tworzonych na zamówienie. W tym miejscu przedstawimy potok wykorzystania baz danych OpenProt i zaoferujemy wgląd w to, którą bazę danych wybrać, biorąc pod uwagę cel eksperymentalny. Przedstawiony tutaj potok analizy proteomicznej jest obsługiwany przez framework Galaxy, ponieważ jest otwarty i łatwy w użyciu, ale bazy danych mogą współpracować z dowolnym przepływem pracy16,17,18. Przedstawimy również, w jaki sposób wykorzystać stronę internetową OpenProt do gromadzenia dalszych informacji na temat nowych białek wykrywanych przez SM. Korzystanie z baz danych OpenProt zapewni bardziej wyczerpujący obraz krajobrazu proteomicznego i będzie sprzyjać odkryciom proteomiki i biomarkerów w bardziej systematyczny sposób niż obecne metody.

Ten protokół podkreśla użycie baz danych OpenProt 15 podczas przeszukiwania zbiorów danych MS; nie będzie sprawdzać projektu samego eksperymentu, który został dokładnie sprawdzony gdzie indziej20,21,22. Aby pozostać w pełni otwartym, protokół jest swobodnie dostępny (Materiały uzupełniające S1-S4). Dla łatwiejszego odczytania, wszystkie terminy używane w OpenProt i tym samym w całym tym protokole są zdefiniowane w Tabeli 1.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie bazy danych OpenProt

UWAGA: Na przykład można również uzyskać niestandardowe bazy danych oparte na danych sekwencyjnych RNA, a procedura jest szczegółowo opisana w drugiej sekcji tego protokołu. Jeśli potrzebna jest niestandardowa baza danych, przejdź do następnej sekcji.

  1. Przejdź do witryny OpenProt : www.openprot.org i otwórz stronę Pobrane, korzystając z linku z menu górnej strony.
  2. Kliknij na interesujący Cię gatunek na podstawie przeanalizowanych danych eksperymentalnych.
  3. Kliknij żądany typ białka.
    UWAGA: OpenProt oferuje trzy klasyfikacje: RefProt, Isoforms i AltProt. Jak pokazano w Rysunek 1, ten parametr będzie się różnił w zależności od celu badawczego.
    1. Kliknij na sam RefProc, aby wygenerować pliki zawierające tylko znane białka.
    2. Kliknij AltProt i Isoforms, aby wygenerować pliki zawierające tylko nowe białka - albo nowe izoformy znanych białek (Isoforms), albo zakodowane przez alternatywny ORF (AltProts). Należy pamiętać, że OpenProt wymusza minimalną długość ORF wynoszącą 30 kodonów15.
    3. Kliknij AltProts, Isoforms i RefProts, aby wygenerować pliki zawierające wszystkie typy białek obecne w bazie danych OpenProt - znane i nowe białka.
  4. Jeśli to możliwe, kliknij adnotację, z której rysowane są sekwencje białek.
    UWAGA: OpenProt oferuje bardziej wyczerpujący krajobraz proteomiczny poprzez połączenie wielu adnotacji. Adnotacje transkryptomu w minimalnym stopniu się pokrywają; W związku z tym wybrana adnotacja może znacząco wpłynąć na zwizualizowany profil proteomiczny15,23.
  5. Kliknij na poziom dowodów potwierdzających niezbędnych do rozważenia białka. Jak pokazano w Rysunek 1, ten parametr będzie się różnił w zależności od celu badawczego.
    1. Kliknij na co najmniej dwa wykryte unikalne peptydy, aby wygenerować pliki zawierające tylko najbardziej pewne białka.
      UWAGA: Kryterium dwóch unikalnych peptydów jest obecnie uważane za złoty standard w proteomice ekspresji białek. Jeśli celem eksperymentu jest wykrycie znanych i dobrze potwierdzonych białek, zaleca się stosowanie tego parametru.
    2. Kliknij co najmniej jeden wykryty unikalny peptyd, aby wygenerować pliki zawierające białka, które zostały już zaobserwowane co najmniej raz w eksperymentach spektrometrii mas ponownie przeanalizowanych przez OpenProt.
      UWAGA: Pozwala to na uwzględnienie krótszej długości AltProts i prawdopodobieństwa, że niektóre z nich mogą zawierać tylko jeden unikalny peptyd tryptyczny8,11.
    3. Kliknij wszystkie przewidywane, aby wygenerować pliki zawierające wszystkie przewidywania OpenProt .
      UWAGA: To ustawienie jest zalecane tylko wtedy, gdy celem eksperymentu jest odkrycie nowych białek (Rysunek 1). Późniejszy znaczny wzrost przestrzeni wyszukiwania wymaga dostosowanego potoku analizy, jak omówiono poniżej7,15.
  6. Kliknij żądany format pliku, aby pobrać. Do analiz proteomicznych należy wybrać plik Fasta (białkowy). Plik readme zawiera wszystkie niezbędne informacje na temat formatu pliku.

2. Pobieranie niestandardowej bazy danych OpenProt

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak uzyskać niestandardową bazę danych. Jeśli niestandardowa baza danych nie jest potrzebna, przejdź do następnej sekcji.

  1. Przejdź do witryny OpenProt (www.openprot.org) i otwórz stronę Szukaj, korzystając z linku z menu górnej strony.
  2. Kliknij interesujący Cię gatunek na podstawie analizowanych danych eksperymentalnych.
  3. Wprowadź listę interesujących genów lub transkryptów.
    1. W przypadku korzystania z listy genów wprowadź ją w polu Zapytanie genowe.
    2. W przypadku korzystania z listy transkrypcji wprowadź ją w polu Zapytanie transkrypcji.
  4. Zaznacz dowolne pole, które ma zastosowanie do żądanej bazy danych.
    1. Nie klikaj na żadne pole, aby uzyskać tabelę zawierającą wszystkie rodzaje białek obsługiwanych przez OpenProt: RefProt, Isoforms i AltProts.
    2. Kliknij Pokaż tylko białka z dowodami eksperymentalnymi, aby uzyskać tabelę zawierającą wszystkie typy białek (RefProts, Isoforms i AltProts), które zostały wykryte co najmniej raz przez MS i/lub dla których zebrano dowody translacji na podstawie danych profilowania rybosomów.
    3. Podobnie, kliknij Pokaż tylko białka wykryte przez SM lub Pokaż tylko białka wykryte przez profilowanie rybosomów, aby uzyskać tabelę zawierającą wszystkie typy białek, które zostały wykryte co najmniej raz odpowiednio przez SM lub przez profilowanie rybosomów.
    4. Kliknij Pokaż tylko AltProts lub Pokaż tylko izoformy, aby uzyskać tabelę zawierającą odpowiednio tylko AltProts lub tylko izoformy.
    5. Kliknij zarówno Pokaż tylko AltProts, jak i Pokaż tylko izoformy, aby uzyskać tabelę zawierającą oba typy białek.
      UWAGA: Możliwe są wszystkie kombinacje filtrów.
  5. Po ustawieniu wszystkich żądanych parametrów kliknij Szukaj. Dane wyjściowe tabeli pojawią się poniżej pól zapytania wyszukiwania.
  6. Kliknij przycisk Pobierz Fasta w prawym górnym rogu tabeli wyjściowej. Spowoduje to wygenerowanie pliku Fasta zawierającego wszystkie białka wynikające z poszukiwanej listy genów lub transkryptów.
  7. Należy pamiętać, że ze względów obliczeniowych OpenProt przechowuje maksymalnie 2 000 elementów do odpytywania (genów lub transkryptów) jednocześnie. W przypadku listy powyżej tego limitu można wygenerować kilka fasta, a następnie połączyć je (jak opisano poniżej); lub po prostu pobierz całą bazę danych OpenProt i przefiltruj uzyskany plik zgodnie z potrzebami.
    1. Umieść całą listę genów lub transkryptów na podlistach zawierających 2,000 wpisów lub mniej. Dla każdej podlisty pobierz plik Fasta zgodnie z powyższym opisem (kroki od 3.3 do 3.6).
    2. Zaloguj się do europejskiej instancji Galaxy (lub dowolnej innej, w której dostępne są narzędzia proteomiczne) https://usegalaxy.eu/.
    3. Utwórz nową historię i zaimportuj wszystkie pobrane bazy danych OpenProt (po jednej na podlistę genów lub transkryptów), klikając logo przesyłania w lewym górnym rogu ekranu.
    4. Skorzystaj z narzędzia Fasta Merge Files and Filter Unique Sequences opracowanego przez programistów GalaxyP (https://github.com/galaxyproteomics/). Wybierz opcję Scal wszystkie Fasta i wprowadź wszystkie zaimportowane bazy danych OpenProt .
      UWAGA: Każde narzędzie można przeszukiwać za pomocą pola zapytania po lewej stronie ekranu
    5. Wybierz opcję tylko dostęp, aby ocenić jednolitość sekwencji i skopiuj regułę parsowania identyfikatora OpenProt (>(.*)\|), a następnie kliknij przycisk Wykonaj.
    6. Zwróć uwagę, że wszystkie pliki zostały połączone w unikalny plik Fasta bez nadmiarowości, który teraz pojawia się w panelu historii po prawej stronie ekranu. Stanowi to roboczą bazę danych.

3. Obsługa bazy danych

UWAGA: Od teraz platforma Galaxy będzie używana, ale te same zasady można zastosować do innych programów proteomicznych.

  1. Zaloguj się do europejskiej instancji Galaxy (lub dowolnej innej, w której dostępne są narzędzia proteomiczne) https://usegalaxy.eu/.
  2. Utwórz nową historię i zaimportuj pobraną bazę danych OpenProt, klikając logo przesyłania w lewym górnym rogu ekranu.
  3. Przejdź do strony przepływu pracy i zaimportuj przepływ pracy Obsługa bazy danych (materiał uzupełniający S1), klikając logo przesyłania w lewym górnym rogu środkowego panelu.
  4. Kliknij Uruchom przepływ pracy i wybierz zaimportowaną bazę danych OpenProt jako input.
    UWAGA: Ten przepływ pracy dołączy repozytorium CRAPome do OpenProt fasta i wygeneruje sekwencje wabiące (sekwencje odwrotne)24. Jeśli pożądana jest lista zwodzików losowych, można to zrobić, zmieniając ten parametr w narzędziu DecoyDatabase.
  5. Zmień nazwę uzyskanego pliku Fasta na coś znaczącego. Baza danych jest gotowa do wykorzystania do analiz proteomicznych.

4. Przygotowanie pliku spektrometrii mas

UWAGA: Większość narzędzi proteomicznych dostępnych na instancjach Galaxy używa formatu mzML, a wyszukiwarki peptydów preferują dane w trybie centroidowym.

  1. Otwórz bezpłatne narzędzie MSConvert z pakietu ProteoWizard i prześlij plik danych do analizy25.
  2. Wybierz katalog dla danych wyjściowych i żądany format pliku do mzML.
  3. Ustaw filtr wybierania wartości szczytowych za pomocą algorytmu falkowego (CWT) na poziomach MS1 i MS2 i rozpocznij konwersję26.

5. Identyfikacja/kwantyfikacja peptydów i białek

UWAGA: Ta część potoku korzysta z narzędzi z pakietu OpenMS, wszechstronnego i łatwego w użyciu frameworka18.

  1. Zaloguj się do europejskiej instancji Galaxy (lub dowolnej innej, w której dostępne są narzędzia proteomiczne) https://usegalaxy.eu/.
  2. Utwórz nową historię i przenieś poprzednio utworzoną bazę danych (krok 3.5) do tej nowej historii za pomocą przeciągania i upuszczania.
  3. Zaimportuj przekształcony plik danych mzML (krok 4.3), klikając logo Prześlij w lewym górnym rogu ekranu.
  4. Przejdź do strony przepływu pracy i zaimportuj żądany przepływ pracy, klikając logo przesyłania w lewym górnym rogu środkowego panelu.
    UWAGA: Eksperymenty MS są różnie projektowane w zależności od pożądanego wyniku końcowego. Przepływy pracy są dostępne dla dwóch częstych projektów: identyfikacji białek i kwantyfikacji białek w oparciu o znakowanie stabilnych izotopów (SIL). Jednak instancja Galaxy zawiera wiele innych narzędzi, które będą obsługiwać inne typy analiz proteomicznych27,28.
    1. W celu zaprojektowania identyfikacji białka należy zaimportować przepływ pracy podany w Materiałach uzupełniających S2. Podczas korzystania z tego przepływu pracy nie należy używać kompresji zlip podczas konwersji plików (krok 4.2)
    2. W celu ilościowego określenia białka w oparciu o projekt znakowania stabilnych izotopów, należy zaimportować przepływ pracy podany w Materiałach uzupełniających S3.
  5. Wybierz pozycję Uruchom przepływ pracy i przejrzyj różne parametry.
    1. Wybierz zaimportowany plik danych mzML jako dane wejściowe, a wcześniej utworzoną bazę danych (krok 3.5) jako plik Fasta bazy danych.
    2. Ponieważ przepływ pracy korzysta z wyszukiwarki X!Tandem, zaimportuj domyślny plik konfiguracyjny X!Tandem (dostarczony w Materiałach uzupełniających S4)29, klikając logo przesyłania w lewym górnym rogu ekranu.
    3. Przepływ pracy wykorzystuje wiele wyszukiwarek (MS-GF+ i X!Tandem). Dołącz inne wyszukiwarki lub wybierz jedną, po prostu dodając lub usuwając narzędzia z przepływu pracy30,31.
      UWAGA: Zaleca się korzystanie z wielu wyszukiwarek, ponieważ zwiększa to czułość i czułość analizy32.
    4. Aby uwzględnić znaczny wzrost rozmiaru podczas korzystania z całej bazy danych OpenProt, należy użyć rygorystycznego FDR15. Domyślnie podany przepływ pracy jest ustawiony na 0,001% FDR, odpowiedni do użycia całej bazy danych OpenProt. W przypadku innych baz danych można to edytować do dowolnej żądanej wartości.
      UWAGA: Należy pamiętać o dostosowaniu parametrów różnych narzędzi w zależności od użytego spektrometru mas i protokołu eksperymentalnego (błąd jonów i fragmentów prekursorowych, modyfikacje stałe i zmienne, zastosowany enzym itp.).
  6. Opcjonalnie pobierz dane wyjściowe dla każdego kroku przepływu pracy do analizy magazynowania lub kontroli jakości, klikając wybrany krok w panelu historii, a następnie klikając logo Zapisz, które pojawi się pod spodem.

6. Kontrola jakości

UWAGA: Ponieważ proteomika oparta na MS jest wynikiem złożonego procesu, w którym każdy krok musi być zoptymalizowany, aby uzyskać powtarzalne wyniki, kontrola jakości jest konieczną procedurą w przepływie pracy33.

  1. Wspólnym wskaźnikiem wydajności jest kilka wskaźników, takich jak liczba dopasowań spektrum peptydów (PSM), liczba zidentyfikowanych peptydów i białek. Uruchom narzędzie File Info na danych wyjściowych IDFilter (oznaczonych na zielono w Rysunek 2), aby podać takie metryki.
  2. Chociaż nie ma to zastosowania do każdej identyfikacji, zwłaszcza w przypadku dużych zbiorów danych, raporty dotyczące nowych białek powinny być zawsze starannie oceniane. Kontrola wyniku białka, pokrycia sekwencji i widm potwierdzających odkrycie ma kluczowe znaczenie. Aby to zrobić, użyj narzędzia TOPPview z frameworka OpenMS; Jest on powszechnie dostępny i dobrze udokumentowany18,34,35.

7. Eksploracja bazy danych OpenProt

UWAGA: Po pewnym zidentyfikowaniu nowego białka przewidzianego przez OpenProt (numery dostępu zaczynające się od IP_ dla AltProts i II_ dla nowych izoform), można uzyskać więcej informacji biologicznych ze strony internetowej OpenProt 15.

  1. Przejdź do witryny OpenProt : www.openprot.org i otwórz stronę Szukaj, korzystając z linku w górnym menu strony.
  2. Kliknij interesujący nas gatunek (taki sam jak ten, w którym zidentyfikowano białko) i wprowadź numer dostępu do białka w polu zapytania Białko.
  3. Kliknij na szukaj, a pojawi się tabela zawierająca podstawowe informacje na temat poszukiwanego białka. Tabela zawiera: długość białka (w aminokwasie), jego masę cząsteczkową (kDa) i punkt izoelektryczny, dowody eksperymentalne za pomocą MS lub profilowania rybosomów (Translation Evidence, TE) oraz przewidywania funkcjonalne, takie jak przewidywane domeny i ortologia białek (dla 10 gatunków obsługiwanych przez OpenProt, v1.3). Tabela zawiera również informacje o powiązanym genie i transkryptacie oraz lokalizacji białka w transkryptie.
  4. Kliknij link Szczegóły, aby uzyskać więcej informacji. Nowo otwarta strona zawiera przeglądarkę genomu, która jest wyśrodkowana na pytanym białku oraz informacje, takie jak współrzędne genomowe i transkryptomiczne oraz obecność motywu Kozaka lub miejsca inicjacji translacji o wysokiej wydajności (TIS)36,37.
  5. Kliknij linki Białko lub DNA na karcie informacyjnej, aby uzyskać odpowiednio sekwencje białka lub DNA.
  6. Przeglądaj szczegółowe informacje na temat dowodów na stwardnienie rozsiane, profilowanie rybosomów, wykrywanie, ochronę i zidentyfikowane domeny białkowe, klikając na górne zakładki15.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej przepływ pracy został zastosowany do zestawu danych MS dostępnego w repozytorium PRIDE38,39. W pierwotnym badaniu opracowano metodę (iMixPro), wykorzystującą znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich z eksperymentów z oczyszczaniem powinowactwa MS (AP-MS) 38. Krótko mówiąc, eksperyment AP-MS polega na użyciu przeciwciał związanych z kulkami w celu pobrania interesującego białka (przynęty) i jego interaktorów (ofiar). Zebrane białka są następnie trawione i przygotowywane do stwardnienia rozsianego. Metoda przygotowania próbki i ustawienia urządzenia są opisane w pierwotnym badaniu oraz w repozytorium PRIDE (PXD004246). Wyzwaniem w takich eksperymentach jest obfitość wyników fałszywie dodatnich, zwłaszcza spowodowanych wiązaniem białek z kulkami, ale nie z przynętą. W tym przypadku użyliśmy SILAC do wygenerowania różnych proporcji izotopów między prawdziwymi ofiarami a fałszywie dodatnimi: 3 próbki kontrolne (bez przynęty) hodowane w lekkim podłożu, 1 próbka wyrażająca przynętę hodowaną w lekkim podłożu i 1 próbka wyrażająca przynętę hodowaną w ciężkim podłożu są przetwarzane za pomocą kulek i dalszej analizy spektrometrii mas. Dzięki takiej konstrukcji niespecyficzne białka wiążące się z kulkami będą miały stosunek ciężkiego do światła wynoszący 1:4; gdy prawdziwe ofiary będą miały stosunek 1:138.

Ponownie przeanalizowaliśmy ich dane AP-MS za pomocą bazy danych OpenProt; przynęty zawierały trzy endogenne białka (PTPN14, JIP3 i IQGAP1) oraz dwa białka o nadmiernej ekspresji (RAF1 i RNF41). Ponieważ w eksperymentach wykorzystano SILAC, do kwantyfikacji białek wykorzystano przepływ pracy Galaxy (Materiał uzupełniający S3, Rysunek 2). Przepływ pracy został uruchomiony przy użyciu całej bazy danych OpenProt (OpenProt_all) lub ograniczonej bazy danych OpenProt (OpenProt_2pep, zawierającej tylko białka wykryte wcześniej z co najmniej dwoma unikalnymi peptydami).

Identyfikacja i kwantyfikacja białek były dobre i powtarzalne w różnych używanych bazach danych. Jak pokazano w Rysunek 3, większość białek zidentyfikowanych w oryginalnym artykule została również zidentyfikowana przy użyciu bazy danych OpenProt_2pep lub OpenProt_all (szczegółowa lista jest dostępna w Materiałach uzupełniających S5). Wynik ten pokazuje, że opisany tutaj potok i bazy danych OpenProt są w stanie zapewnić identyfikację i kwantyfikację białek porównywalną z obecnymi procedurami opartymi na bazach danych UniProtKB classs40. Jednak wykorzystanie baz danych OpenProt ma wyjątkową zaletę, ponieważ umożliwia wykrywanie nowych i wcześniej niewykrywalnych białek, jak wykazano w tym studium przypadku.

11 dobrze wspieranych białek (1 Isoform i 10 AltProts), ale obecnie nieopisanych w bazach danych, zostało zidentyfikowanych we wszystkich zestawach danych, z pewnymi peptydami, przy użyciu bazy danych OpenProt_2pep (wszystkie akcesje białek, wraz z liczbą peptydów wspierających, są dostępne w Materiale Uzupełniającym S5). Ta baza danych pozwala na użycie tradycyjnego 1% FDR, ponieważ wzrost przestrzeni wyszukiwania pozostaje umiarkowany. Te 11 białek nie zostało zidentyfikowanych w pierwotnym badaniu, ponieważ nie było ich w bazie danych.

29 nowych białek (16 izoform i 13 AltProts) odkryto we wszystkich zestawach danych, z peptydami peptydowymi, korzystając z bazy danych OpenProt_all (wszystkie akcesje białek, wraz z liczbą peptydów wspierających, są dostępne w Materiałach Uzupełniających S6). Jak pokazano na Rysunek 3, zalecany rygorystyczny FDR nie wpłynął na najbardziej pewną identyfikację białek, chociaż zmniejszył całkowitą liczbę zidentyfikowanych białek. W porównaniu z bazą danych z OpenProt_2pep można z całą pewnością zidentyfikować większą liczbę nowych białek. Wszystkie te nowe białka są nieobecne w bazie danych OpenProt_2pep. Podkreśla to kluczową rolę wybranej bazy danych w proteomice opartej na stwardnieniu rozsianym.

Odkryto jedno nowe białko jako interaktor białka RAF1 (IP_637643). Korzystając ze strony internetowej OpenProc, można zobaczyć, że białko to nie zostało do tej pory wykryte przez stwardnienie rozsiane ani profilowanie rybosomów (OpenProt v1.3). Białko ma długość 46 aminokwasów i może dać tylko dwa unikalne peptydy podczas trawienia tryptycznego. Peptyd wykryty w zbiorze danych RAF1 AP-MS (frakcja 18) miał dobrej jakości spektrum, jak pokazano na Rysunek 4, i wykazywał stosunek ciężkiego do światła wynoszący 1,09. Białko jest kodowane w genie NANOGNBP1, który jest pseudogenem NANOGNB. Transkrypt (ENST00000448444), obecnie oznaczony jako niekodujący, został wykryty w kilku tkankach zgodnie z GTEx portal40. Białko zawiera przewidywaną domenę funkcjonalną związaną z wiązaniem DNA (Gene Ontology GO:0003677)41.

figure-results-1
Rysunek 1: Wybór bazy danych dla wykresu analiz proteomicznych. Analizy danych z państw członkowskich, w szczególności wybór bazy danych, zależą od celów badania. Trzy wspólne cele są oznaczone kolorem niebieskim (klasyczny potok proteomyczny), zielonym (wyczerpujące wyszukiwanie proteomiczne) i pomarańczowym (odkrycie proteomiczne). Każdy cel zależy od odpowiedniej bazy danych i potoku. Pojedyncze narzędzie identyfikacyjne może być wykorzystane do wyczerpujących i klasycznych procesów proteomicznych. W przypadku potoku odkrywania proteomicznego zdecydowanie zalecamy korzystanie z wielu silników identyfikacji. Zalecane FDR są oznaczone kolorem czerwonym, a rozmiary baz danych białek są oznaczone szarymi polami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Graficzna reprezentacja zastosowanego przepływu pracy w Galaxy. Przedstawienie krok po kroku przepływu pracy analizy proteomicznej używanej do ponownej analizy danych Eyckermana i wsp. data38. Pliki wejściowe, wyszukiwanie peptydów i kwantyfikacja białek są oznaczone pomarańczowymi polami. Niebieskie pola odpowiadają używanym narzędziom, a szare pola odpowiadają wygenerowanym plikom wyjściowym. Różne wyszukiwarki (MS-GF+ i X!Tandem) są oznaczone różnymi kolorami (odpowiednio czerwonym i fioletowym), a także strzałkami wskazującymi ich niezbędne dane wejściowe i wyjściowe. W zielonym polu znajduje się narzędzie generujące listę identyfikacji białek. Gdy generowanych jest wiele wyjść, to używane do dalszych kroków jest wskazywane jako najbliższe strzałce. Ten przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie w materiałach uzupełniających S2. Plik konfiguracyjny parametrów domyślnych X!Tandem jest dostępny w Materiał uzupełniający S4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie identyfikacji interaktorów dla każdej przynęty przy użyciu różnych baz danych. Diagramy Venna identyfikacji białek przy użyciu najbardziej zaufanej bazy danych OpenProt (w kolorze pomarańczowym, dowody potwierdzające co najmniej 2 unikalne peptydy, OpenProt_2pep) z 1% FDR lub całej bazy danych OpenProt (w kolorze niebieskim, OpenProt_all) z 0,001% FDR lub zgodnie z raportem w oryginalnym artykule (w kolorze szarym)38. Każdy diagram odpowiada zidentyfikowanym interaktorom dla wspomnianej przynęty: RAF1, RNF41, PTPN14, JIP3 i IQGAP1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Widmo MS/MS zidentyfikowanego peptydu MDNLWAK(13C6) z nowego białka IP_637643. Intensywność jest względna (od 0 do 100%). Wybrane piki są oznaczone kolorem czerwonym, adnotacje jonów y są oznaczone kolorem ciemnoczerwonym, a adnotacje jonów b kolorem zielonym. Wyodrębnione z oprogramowania TOPPview34. Błąd prekursora = 2,70 ppm, wynik PEP = 0,12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

termindefinicjaodniesienie
Alternatywny ORF (AltORF)niekanoniczny ORF obecnie nie jest opisywany w adnotacjach genomu, ale jest opisywany w OpenProt.15
Numer referencyjny ORF (RefORF)kanoniczny ORF z adnotacjami genomu i OpenProt.15
Białko alternatywne (AltProt)nowego białka kodowanego przez AltORF, bez istotnego podobieństwa do RefProt. Prefiks akcesyjny: IP_.15
Białko referencyjne (RefProt)białko obecnie oznaczone w bazach danych sekwencji białek, takich jak UniProtKB, Ensembl lub NCBI RefSeq, a także w OpenProt.15
Nowa izoformanowe białko kodowane za pomocą AltORF, wykazujące znaczne podobieństwo do RefProt. Prefiks akcesyjny: II_.15
OpenProt_2pep baza danychzawiera sekwencję wszystkich RefProt i nowych białek przewidzianych przez OpenProt, już wykrytych przy użyciu co najmniej 2 unikalnych peptydów.15
OpenProt_1pep baza danychzawiera sekwencję wszystkich RefProt i nowych białek przewidywanych przez OpenProt, już wykrytych za pomocą co najmniej 1 unikalnego peptydu.15
OpenProt_all bazy danychzawiera sekwencję wszystkich RefProt i nowych białek przewidzianych przez OpenProt.15

Tabela 1: Definicje terminów używanych w OpenProt i w całym protokole

Materiał uzupełniający S1: Galaxy workflow do obsługi bazy danych. Spowoduje to dołączenie sekwencji CRAPome i wabika (odwróconych) do wejściowej bazy danych. Wyjściem jest plik Fasta. Kliknij tutaj, aby pobrać.

Materiał uzupełniający S2: Galaxy workflow do identyfikacji białek. Pozwoli to zidentyfikować białka z pliku danych spektrometrii mas za pomocą dwóch wyszukiwarek (MS-GF+ i X!Tandem). Każdy parametr można dostosować zgodnie z potrzebami przed uruchomieniem przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby pobrać.

Materiał uzupełniający S3: Galaxy workflow do kwantyfikacji białek za pomocą znakowania stabilnymi izotopami (SIL). Pozwoli to na identyfikację i ilościowe określenie białek z pliku danych spektrometrii mas za pomocą dwóch wyszukiwarek (MS-GF+ i X!Tandem). Każdy parametr można dostosować, zgodnie z potrzebami, przed uruchomieniem przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby pobrać.

Materiał uzupełniający S4: Plik konfiguracyjny domyślnych parametrów X!Tandem. Ten plik XML jest niezbędny do uruchomienia narzędzia X!TandemAdapter na platformie Galaxy. Kliknij tutaj, aby pobrać.

Materiał uzupełniający S5: Ilościowe określenie białek z zestawów danych iMixPro. Pliki danych z Eyckerman et al. 201638 zostały przetworzone przy użyciu baz danych OpenProt i dla każdego warunku wymieniono ilościowe białka. Przynęty to PTPN14, JIP3, IQGAP1, RAF1 i RNF41. Nazwy genów zaznaczone na zielono odpowiadają białkom zidentyfikowanym również w oryginalnym artykule38. Nazwy genów oznaczone kolorem pomarańczowym odpowiadają znanym interaktorom według BioGrid, które nie zostały zgłoszone w oryginalnej pracy. Nazwy genów oznaczone kolorem jasnoniebieskim odpowiadają nowym białkom zidentyfikowanym jako interaktorskie (odpowiadający im numer dostępu do białka jest podany w nawiasach). Nazwy genów zaznaczone kolorem jasnoszarym i kursywą odpowiadają prawdopodobnym skażeniom (białkom keratyny). Kliknij tutaj, aby pobrać.

Materiał uzupełniający S6: Zidentyfikowano nowe białka ze zbiorów danych iMixPro. Pliki danych z Eyckerman et al. 201638 zostały przetworzone przy użyciu baz danych OpenProt i dla każdego warunku wymieniono nowe zidentyfikowane białka. Przynęty to PTPN14, JIP3, IQGAP1, RAF1 i RNF41. Podane są numery dostępu do białek, począwszy od II_ dla nowych izoform znanego białka oraz dla IP_ dla nowych białek z alternatywnego ORF (AltProt). Liczba peptydów wspomagających jest podana w nawiasach. Kliknij tutaj, aby pobrać.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas analizy danych ze spektrometrów masowych jakość identyfikacji białek zależy częściowo od dokładności wykorzystanej bazy danych 6,20. Obecne podejścia tradycyjnie wykorzystują bazy danych UniProtKB, jednak wspierają one model adnotacji genomu pojedynczego ORF na transkrypt i minimalnej długości 100 kodonów (z wyjątkiem wcześniej zademonstrowanych przykładów)40. Liczne badania łączą niedociągnięcia takich baz danych z odkryciem funkcjonalnych ORF z rzekomo niekodujących regionów 8,11,12,13. Teraz OpenProt pozwala na bardziej wyczerpującą identyfikację białek, ponieważ pobiera sekwencje białek z wielu adnotacji transkryptomu. OpenProt pobiera transkryptomy NCBI RefSeq (GRCh38.p7) i Ensembl (GRCh38.83) oraz adnotacje UniProtKB (UniProtKB-SwissProt, 2017-09-27)40,42,43. Ponieważ obecne adnotacje w niewielkim stopniu się pokrywają, OpenProt wyświetla bardziej wyczerpujący obraz potencjalnego krajobrazu proteomicznego niż w przypadku ograniczenia do jednej adnotacji15.

Ponadto, ponieważ OpenProt wymusza model policistroniczny, pozwala na wiele adnotacji białek na transkrypt. Ze względów statystycznych i obliczeniowych OpenProt nadal utrzymuje minimalny próg długości wynoszący 30 kodonów15. Przewiduje jednak tysiące nowych sekwencji białek, poszerzając tym samym zakres możliwości identyfikacji białek. Dzięki takiemu podejściu OpenProt wspiera odkrycia proteomiczne w bardziej systematyczny sposób.

Na jakość identyfikacji białek mogą mieć również wpływ stosowane parametry. Analizy proteomiczne oparte na stwardnieniu rozsianym zazwyczaj zawierają 1% białka FDR. Jednak cała baza danych OpenProt zawiera około 6 razy więcej wpisów (rysunek 1). Aby uwzględnić ten znaczny wzrost przestrzeni wyszukiwania, zalecamy użycie bardziej rygorystycznego FDR wynoszącego 0,001%. Parametr ten został zoptymalizowany przy użyciu badań porównawczych i ręcznej oceny losowo wybranych widm15. Fałszywie dodatnie wyniki są jednak nadal możliwe, dlatego zachęcamy do dokładnej kontroli i walidacji dowodów potwierdzających istnienie nowego białka. Zalecanym standardem może być identyfikacja białka z dwóch różnych serii stwardnienia rozsianego, ponieważ dane podstawowe i wyniki fałszywie dodatnie różnią się w zależności od zestawu danych15.

Dostarczony tutaj rurociąg i wykorzystany w studium przypadku może być dowolnie modyfikowany, aby dopasować go do projektu i parametrów eksperymentu. Zalecamy korzystanie z wielu wyszukiwarek, ponieważ zwiększa to czułość i czułość identyfikacji peptydów32. Ponadto zachęcamy do korzystania z bazy danych najlepiej odpowiadającej celowi eksperymentu (rysunek 1). Ponieważ korzystanie z całej bazy danych OpenProt jest zgodne z rygorystycznym FDR, prawdziwa identyfikacja może zostać utracona. W związku z tym cała baza danych powinna być przeznaczona do odkrywania nowych białek, podczas gdy klasyczne profilowanie proteomiczne powinno wykorzystywać mniejsze bazy danych OpenProt (takie jak OpenProt_2pep użyte w powyższym studium przypadku).

OpenProt obecnie przewiduje sekwencje rozpoczynające się od kodonu ATG, podczas gdy kilka badań podkreśliło inicjację translacji w innych kodonach44,45. Gdy nowe białko jest identyfikowane przez jeden lub kilka unikalnych peptydów, możliwe jest, że prawdziwym kodonem inicjacyjnym nie jest przypuszczalny ATG. Użytkownicy mogą szukać dowodów tłumaczenia na stronie internetowej OpenProt. Obecnie OpenProt raportuje zdarzenia translacji tylko wtedy, gdy dotyczą one całej przewidywanej sekwencji białek (100% pokrywania się)15. Tak więc brak dowodów translacji nie oznaczałby, że białko nie ulega translacji, ale że kodon start może nie być domniemanym ATG.

Pomimo obecnych ograniczeń, OpenProt oferuje bardziej wyczerpujące spojrzenie na potencjał kodowania genomów eukariotycznych. Bazy danych OpenProt sprzyjają odkryciom proteomicznym oraz zrozumieniu funkcji i interakcji proteomicznych. Przyszły rozwój bazy danych OpenProt będzie obejmował adnotację innych gatunków, dowody translacji z kodonu startowego innego niż ATG oraz opracowanie linii produkcyjnej w celu włączenia nowych białek do badań sekwencjonowania całego genomu i egzomu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Vivian Delcourt za pomoc, dyskusje i rady dotyczące tej pracy. X.R. jest członkiem wspieranego przez Fonds de Recherche du Québec Santé (FRQS) Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Badania te były wspierane przez Kanadyjską Katedrę Badań nad Proteomiką Funkcjonalną i Odkrywaniem Nowych Białek w ramach grantu X.R. i CIHR MOP-137056. Dziękujemy zespołowi Calcul Québec i Compute Canada za wsparcie w zakresie wykorzystania superkomputera mp2 firmy Université de Sherbrooke. Eksploatacja superkomputera mp2 jest finansowana przez Canada Foundation of Innovation (CFI), le ministère de l'Économie, de la science et de l'innovation du Québec (MESI) oraz les Fonds de Recherche du Québec - Nature et technologies (FRQ-NT). Serwer Galaxy, który został wykorzystany do niektórych obliczeń proteomicznych, jest częściowo finansowany przez Collaborative Research Centre 992 Medical Epigenetics (grant DFG SFB 992/1 2012) i niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF granty 031 A538A/A538C RBC, 031L0101B/031L0101C de. NBI-epi, 031L0106 de. STAIR (de. NBI)).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Witryna internetowa OpenProtopen sourcen/awww.openprot.org
Galaxy Serveropen sourcenie dotyczyhttps://usegalaxy.eu/
TOPPwyświetl oprogramowanieopen sourcenie dotyczywww.openms.de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A draft map of the human proteome. Nature. 509 (7502), 575-581 (2014).">Kim, M. S., et al. A draft map of the human proteome. Nature. 509 (7502), 575-581 (2014).
  2. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).">Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  3. A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).">Hein, M. Y., et al. A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  4. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).">Huttlin, E. L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  5. Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks. Nature. 545 (7655), 505-509 (2017).">Huttlin, E. L., et al. Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks. Nature. 545 (7655), 505-509 (2017).
  6. Choosing an Optimal Database for Protein Identification from Tandem Mass Spectrometry Data. Proteome Bioinformatics. , 17-29 (2017).">Kumar, D., Yadav, A. K., Dash, D. Choosing an Optimal Database for Protein Identification from Tandem Mass Spectrometry Data. Proteome Bioinformatics. , 17-29 (2017).
  7. False discovery rates in spectral identification. BMC Bioinformatics. 13 (Suppl 16), (2012).">Jeong, K., Kim, S., Bandeira, N. False discovery rates in spectral identification. BMC Bioinformatics. 13 (Suppl 16), (2012).
  8. Recognition of the polycistronic nature of human genes is critical to understanding the genotype-phenotype relationship. Genome Research. , (2018).">Brunet, M. A., Levesque, S. A., Hunting, D. J., Cohen, A. A., Roucou, X. Recognition of the polycistronic nature of human genes is critical to understanding the genotype-phenotype relationship. Genome Research. , (2018).
  9. Genome annotation past, present, and future: how to define an ORF at each locus. Genome Research. 15 (12), 1777-1786 (2005).">Brent, M. R. Genome annotation past, present, and future: how to define an ORF at each locus. Genome Research. 15 (12), 1777-1786 (2005).
  10. GENCODE: The reference human genome annotation for The ENCODE Project. Genome Research. 22 (9), 1760-1774 (2012).">Harrow, J., et al. GENCODE: The reference human genome annotation for The ENCODE Project. Genome Research. 22 (9), 1760-1774 (2012).
  11. Deep transcriptome annotation enables the discovery and functional characterization of cryptic small proteins. eLife. 6, e27860 (2017).">Samandi, S., et al. Deep transcriptome annotation enables the discovery and functional characterization of cryptic small proteins. eLife. 6, e27860 (2017).
  12. Discovery and characterization of smORF-encoded bioactive polypeptides. Nature Chemical Biology. 11 (12), 909-916 (2015).">Saghatelian, A., Couso, J. P. Discovery and characterization of smORF-encoded bioactive polypeptides. Nature Chemical Biology. 11 (12), 909-916 (2015).
  13. Small Proteins Encoded by Unannotated ORFs are Rising Stars of the Proteome, Confirming Shortcomings in Genome Annotations and Current Vision of an mRNA. Proteomics. , (2017).">Delcourt, V., Staskevicius, A., Salzet, M., Fournier, I., Roucou, X. Small Proteins Encoded by Unannotated ORFs are Rising Stars of the Proteome, Confirming Shortcomings in Genome Annotations and Current Vision of an mRNA. Proteomics. , (2017).
  14. In Search of Lost Small Peptides. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33 (1), (2017).">Plaza, S., Menschaert, G., Payre, F. In Search of Lost Small Peptides. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33 (1), (2017).
  15. OpenProt: a more comprehensive guide to explore eukaryotic coding potential and proteomes. Nucleic Acids Research. , (2018).">Brunet, M. A., et al. OpenProt: a more comprehensive guide to explore eukaryotic coding potential and proteomes. Nucleic Acids Research. , (2018).
  16. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W3-W10 (2016).">Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, W537-W544 (2018).">Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, W537-W544 (2018).
  18. OpenMS – An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163(2008).">Sturm, M., et al. OpenMS – An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163(2008).
  19. A Novel Approach to High-Quality Postmortem Tissue Procurement: The GTEx Project. Biopreservation and Biobanking. 13 (5), 311-319 (2015).">Carithers, L. J., et al. A Novel Approach to High-Quality Postmortem Tissue Procurement: The GTEx Project. Biopreservation and Biobanking. 13 (5), 311-319 (2015).
  20. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 6928(2003).">Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 6928(2003).
  21. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).">Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  22. The importance of experimental design in proteomic mass spectrometry experiments: Some cautionary tales. Briefings in Functional Genomics. 3 (4), 322-331 (2005).">Hu, J., Coombes, K. R., Morris, J. S., Baggerly, K. A. The importance of experimental design in proteomic mass spectrometry experiments: Some cautionary tales. Briefings in Functional Genomics. 3 (4), 322-331 (2005).
  23. Assessing the impact of human genome annotation choice on RNA-seq expression estimates. BMC Bioinformatics. 14 (11), S8(2013).">Wu, P. Y., Phan, J. H., Wang, M. D. Assessing the impact of human genome annotation choice on RNA-seq expression estimates. BMC Bioinformatics. 14 (11), S8(2013).
  24. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).">Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  25. Data Conversion with ProteoWizard msConvert. Proteomics: Methods and Protocols. , 339-368 (2017).">Adusumilli, R., Mallick, P. Data Conversion with ProteoWizard msConvert. Proteomics: Methods and Protocols. , 339-368 (2017).
  26. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard’s msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).">French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard’s msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
  27. APOSTL: An Interactive Galaxy Pipeline for Reproducible Analysis of Affinity Proteomics Data. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4747-4754 (2016).">Kuenzi, B. M., et al. APOSTL: An Interactive Galaxy Pipeline for Reproducible Analysis of Affinity Proteomics Data. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4747-4754 (2016).
  28. msCompare: a framework for quantitative analysis of label-free LC-MS data for comparative candidate biomarker studies. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (6), (2012).">Hoekman, B., Breitling, R., Suits, F., Bischoff, R., Horvatovich, P. msCompare: a framework for quantitative analysis of label-free LC-MS data for comparative candidate biomarker studies. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (6), (2012).
  29. X!!Tandem, an improved method for running X!tandem in parallel on collections of commodity computers. Journal of Proteome Research. 7 (1), 293-299 (2008).">Bjornson, R. D., et al. X!!Tandem, an improved method for running X!tandem in parallel on collections of commodity computers. Journal of Proteome Research. 7 (1), 293-299 (2008).
  30. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nature Communications. 5, 5277(2014).">Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nature Communications. 5, 5277(2014).
  31. SearchGUI: An open-source graphical user interface for simultaneous OMSSA and X!Tandem searches. Proteomics. 11 (5), 996-999 (2011).">Vaudel, M., Barsnes, H., Berven, F. S., Sickmann, A., Martens, L. SearchGUI: An open-source graphical user interface for simultaneous OMSSA and X!Tandem searches. Proteomics. 11 (5), 996-999 (2011).
  32. Combining results of multiple search engines in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (9), 2383-2393 (2013).">Shteynberg, D., Nesvizhskii, A. I., Moritz, R. L., Deutsch, E. W. Combining results of multiple search engines in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (9), 2383-2393 (2013).
  33. Quality control in mass spectrometry-based proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 697-711 (2018).">Bittremieux, W., et al. Quality control in mass spectrometry-based proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 37 (5), 697-711 (2018).
  34. OpenMS and TOPP: Open Source Software for LC-MS Data Analysis. Data Mining in Proteomics: From Standards to Applications. , 353-367 (2011).">Bertsch, A., Gröpl, C., Reinert, K., Kohlbacher, O. OpenMS and TOPP: Open Source Software for LC-MS Data Analysis. Data Mining in Proteomics: From Standards to Applications. , 353-367 (2011).
  35. OpenMS – A platform for reproducible analysis of mass spectrometry data. Journal of Biotechnology. 261, 142-148 (2017).">Pfeuffer, J., et al. OpenMS – A platform for reproducible analysis of mass spectrometry data. Journal of Biotechnology. 261, 142-148 (2017).
  36. Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation. Gene. 299 (1-2), 1-34 (2002).">Kozak, M. Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation. Gene. 299 (1-2), 1-34 (2002).
  37. Quantitative analysis of mammalian translation initiation sites by FACS-seq. Molecular Systems Biology. 10, 748(2014).">Noderer, W. L., et al. Quantitative analysis of mammalian translation initiation sites by FACS-seq. Molecular Systems Biology. 10, 748(2014).
  38. Intelligent Mixing of Proteomes for Elimination of False Positives in Affinity Purification-Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3929-3937 (2016).">Eyckerman, S., et al. Intelligent Mixing of Proteomes for Elimination of False Positives in Affinity Purification-Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3929-3937 (2016).
  39. 2016 update of the PRIDE database and its related tools. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D447-D456 (2016).">Vizcaíno, J. A., et al. 2016 update of the PRIDE database and its related tools. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D447-D456 (2016).
  40. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D158-D169 (2017).">Bateman, A., et al. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  41. Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D331-D338 (2017).">The Gene Ontology Consortium Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources. Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D331-D338 (2017).
  42. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Research. 44, D733-D745 (2016).">O’Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Research. 44, D733-D745 (2016).
  43. Ensembl 2018. Nucleic Acids Research. 46 (D1), D754-D761 (2018).">Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Research. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  44. Translation of 5’ leaders is pervasive in genes resistant to eIF2 repression. eLife. 4, e03971(2015).">Andreev, D. E., et al. Translation of 5’ leaders is pervasive in genes resistant to eIF2 repression. eLife. 4, e03971(2015).
  45. The translation of non-canonical open reading frames controls mucosal immunity. Nature. 564, 434-438 (2018).">Jackson, R., et al. The translation of non-canonical open reading frames controls mucosal immunity. Nature. 564, 434-438 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

OpenProt DatabaseMass Spectrometry ProteomicsNon Canonical ORFsNovel Protein DiscoveryPolycistronic AnnotationFalse Discovery RateProteomic LandscapeProtein IdentificationDatabase MiningProteomics Workflow

Related Articles