Artykuł metodologiczny

Patrząc na zewnątrz: izolacja polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice

DOI:

10.3791/59590

⸱

27 maja 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane są protokoły izolacji cyjanobakteryjnych polimerów węglowodanowych uwalnianych i izolacji ich egzoproteomów. Obie procedury obejmują kluczowe etapy uzyskiwania polimerów lub białek o wysokim stopniu czystości, które można wykorzystać do dalszej analizy lub zastosowań. Można je również łatwo dostosować do konkretnych potrzeb użytkownika.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie mogą aktywnie wydzielać do środowiska zewnątrzkomórkowego szeroki zakres biomolekuł, takich jak heteropolisacharydy i białka. Identyfikacja i charakterystyka tych biomolekuł może poszerzyć wiedzę na temat ich ścieżek wydzielania i pomóc w manipulowaniu nimi. Co więcej, niektóre z tych biomolekuł są również interesujące pod względem zastosowań biotechnologicznych. Opisano tutaj dwa protokoły łatwej i szybkiej izolacji polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice. Metoda izolacji uwolnionych polimerów węglowodanowych opiera się na konwencjonalnych technikach wytrącania polisacharydów w roztworach wodnych z użyciem rozpuszczalników organicznych. Metoda ta zachowuje właściwości polimeru i jednocześnie pozwala uniknąć obecności zanieczyszczeń pochodzących z resztek komórkowych i pożywki hodowlanej. Pod koniec procesu liofilizowany polimer jest gotowy do użycia lub scharakteryzowania lub może być poddany dalszym rundom oczyszczania, w zależności od końcowego przeznaczenia zastosowania. Jeśli chodzi o izolację egzoproteomu sinicowego, technika ta opiera się na stężeniu pożywki bezkomórkowej po usunięciu głównych zanieczyszczeń przez odwirowanie i filtrację. Strategia ta pozwala na niezawodną izolację białek, które docierają do środowiska zewnątrzkomórkowego za pośrednictwem transporterów błonowych lub pęcherzyków błony zewnętrznej. Białka te można następnie zidentyfikować za pomocą standardowych technik spektrometrii mas. Przedstawione tutaj protokoły mogą być stosowane nie tylko do szerokiej gamy sinic, ale także do innych szczepów bakterii. Co więcej, procedury te można łatwo dostosować do końcowego zastosowania produktów, wymaganego stopnia czystości i szczepu bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie są powszechnie uznawane za źródło naturalnych produktów o obiecujących zastosowaniach biotechnologicznych/biomedycznych. Dlatego zrozumienie mechanizmów wydzielania sinic i optymalizacja metod ekstrakcji/odzyskiwania są niezbędne do wdrożenia cyjanobakterii jako wydajnych fabryk komórek mikrobiologicznych.

Wiele szczepów sinic jest w stanie wytwarzać zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe (EPS), głównie tworzone przez heteropolisacharydy, które pozostają związane z powierzchnią komórki lub są uwalniane do podłoża1. Te uwolnione polimery węglowodanowe mają odmienne cechy w porównaniu z innymi bakteriami, co czyni je odpowiednimi do szerokiego zakresu zastosowań (np. leki przeciwwirusowe2, immunostymulujące3, przeciwutleniacz4, metal-chelating5, emulgujące6 i środki dostarczające leki7,8). Metodologia izolacji tych polimerów w dużej mierze przyczynia się nie tylko do poprawy wydajności, ale także do zwiększenia czystości i specyficznych właściwości fizycznych otrzymanego polimeru9. Zdecydowana większość tych metod izolacji polimerów opiera się na strategiach wytrącania z pożywki hodowlanej, które są łatwe do zrealizowania ze względu na silny anionowy charakter polimeru9,10. Ponadto usunięcie rozpuszczalników stosowanych na etapie wytrącania można szybko osiągnąć poprzez odparowanie i/lub liofilizację. W zależności od przewidywanego zastosowania, różne etapy mogą być łączone po lub przed wytrącaniem polimeru w celu dostosowania produktu końcowego, które obejmują obróbkę kwasem trichlorooctowym (TCA), filtrację lub oczyszczanie kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) 10.

Cyjanobakterie są również zdolne do wydzielania szerokiej gamy białek poprzez szlaki zależne od transporterów błonowych (klasyczne)11 lub za pośrednictwem pęcherzyków (nieklasyczne)12. W związku z tym analiza egzoproteomu sinic stanowi niezbędne narzędzie, zarówno do zrozumienia/manipulowania mechanizmami wydzielania białek sinicowych, jak i do zrozumienia specyficznej funkcji zewnątrzkomórkowej tych białek. Wiarygodna izolacja i analiza egzoproteomów wymaga koncentracji środowiska zewnątrzkomórkowego, ponieważ obfitość wydzielanych białek jest stosunkowo niska. Ponadto inne etapy fizyczne lub chemiczne (np. wirowanie, filtracja lub wytrącanie białek) mogą zoptymalizować jakość uzyskanego egzoproteomu, wzbogacając zawartość białka13 i unikając obecności zanieczyszczeń (np. pigmentów, węglowodanów itp.)14,15 lub przewaga białek wewnątrzkomórkowych w próbkach. Jednak niektóre z tych kroków mogą również ograniczać zestaw białek, które można wykryć, co prowadzi do stronniczej analizy.

Ta praca opisuje skuteczne protokoły izolacji uwolnionych polimerów węglowodanowych i egzoproteomów z pożywek hodowlanych cyjanobakterii. Protokoły te można łatwo dostosować do konkretnych celów badania i potrzeb użytkownika, przy jednoczesnym zachowaniu przedstawionych tutaj podstawowych kroków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja cyjanobakteryjna z węglowodanowego polimeru

  1. Izolacja polimerów i usuwanie zanieczyszczeń
    1. Hodować szczep sinic w standardowych warunkach [np. 30 °C w reżimie 12 godzin światła (50 μE m−2s−1)/12 godzin ciemności, z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min]. Zmierz wzrost przy użyciu standardowych protokołów [np. gęstość optyczna przy 730nm (OD 730 nm), chlorofil a, sucha masa itp.), a następnie zmierz produkcję uwolnionych polisacharydów zgodnie z metodą kwasu fenolowo-siarkowego16.
    2. Przenieść kulturę do membran dializacyjnych (12-14 kDa odcięcia masy cząsteczkowej) i dializować w co najmniej 10 objętościach wody dejonizowanej przez 24 godziny, ciągle mieszając.
      UWAGA: W zależności od objętości posiewu do dializy i składu pożywki może być konieczna zmiana wody do dializy.
    3. Odwirować kulturę przy stężeniu 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej fiolki i wyrzucić osad (komórki).
    4. Ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń, takich jak resztki ściany komórkowej lub lipopolisacharydy (LPS).
    5. Przenieść supernatant do szklanej zlewki i wyrzucić osad.
  2. Wytrącanie polimeru
    1. Dodać 2 objętości 96% etanolu do supernatantu.
    2. Zawiesinę inkubować w temperaturze 4 °C, co najmniej przez noc.
    3. Odzysk polimerów
      1. W przypadku małych lub niewidocznych ilości wytrąconego polimeru: odwirować zawiesinę o stężeniu 13 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml lub 2 ml autoklawowanej wody dejonizowanej. Przenieść zawiesinę wodną do fiolki.
        UWAGA: Supernatant należy wyrzucić delikatnie, ponieważ może on łatwo ulec ponownemu zawieszeniu.
      2. W przypadku widocznych/dużych ilości wytrąconego polimeru: zebrać wytrącony polimer za pomocą sterylnych metalowych kleszczyków do fiolki. Ściśnij polimer i wyrzuć nadmiar etanolu.
    4. Opcjonalnie: w zależności od wymaganego stopnia oczyszczenia polimeru, powtórzyć etap wytrącania z 96% etanolem po ponownym zawieszeniu polimerów w wodzie dejonizowanej.
  3. Liofilizacja polimeru
    1. Przechowywać fiolki z wytrąconym polimerem w temperaturze -80 °C, co najmniej przez noc.
    2. Liofilizować (liofilizować) polimer przez co najmniej 48 godzin (nie dopuścić do rozmrożenia zawiesiny przed liofilizacją).
    3. Wysuszony polimer należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie polimeru w eksykatorze, ponieważ z czasem może on wchłonąć wodę.

2. Izolacja egzoproteomu sinic

  1. Średnie stężenie
    1. Hodować sinice w standardowych warunkach [np. 30 °C w reżimie 12 godzin światła (50 μE m−2s−1)/12 godzin ciemności, z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min]. Monitoruj wzrost sinicy za pomocą standardowych procedur (np. OD730 nm, chlorofil a, sucha masa itp.).
    2. Odwirować kultury przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieść sklarowany osad do kolby i wyrzucić osad z komórek.
    4. Przefiltrować zdekantowane medium przez filtr o wielkości porów 0,2 μm.
      UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu na krótki okres czasu, jeśli podłoże jest utrzymywane w temperaturze 4 °C.
    5. Zagęścić pożywkę około 500 razy (biorąc pod uwagę początkową objętość przefiltrowanego podłoża), używając koncentratorów odśrodkowych o nominalnej masie cząsteczkowej granicznej wynoszącej 3 kDa. Wirowanie powinno odbywać się przy 4 000 x g (maksymalnie 1 h na rundę wirowania) w temperaturze 15 °C.
      UWAGA: W przypadku większości marek koncentratorów urządzenie filtrujące należy przed użyciem przepłukać przez odwirowanie ultraczystą wodą. Gdy filtr jest mokry, nie pozwól mu wyschnąć. Pozostaw wystarczającą ilość płynu na zbiorniku, gdy urządzenie nie jest używane.
      UWAGA: Obniżenie temperatury wirowania do 4 °C może być pomocne, jeśli celem jest badanie aktywności białek, chociaż wydłuży to czas niezbędny do zagęszczenia próbki. Protokół może być wstrzymany między etapami wirowania na krótkie okresy czasu, jeśli pożywka jest utrzymywana w temperaturze 4 °C.
    6. Przepłukać ścianki zbiornika próbki urządzenia filtrującego zagęszczoną próbką i przenieść zawartość do probówki mikrowirówkowej.
    7. Wykonać dodatkowy etap mycia zbiornika próbki urządzenia filtrującego autoklawowaną pożywką hodowlaną, aby zapewnić maksymalny odzysk egzoproteomu.
      UWAGA: Aby określić procentowo odzysk, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Próbki egzoproteomu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Dodanie inhibitorów proteazy jest zalecane w przypadku długotrwałego przechowywania.
  2. Analiza egzoproteomu
    1. Określ ilościowo zawartość białka za pomocą testu białka BCA w 96-dołkowej płytce zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Oddzielić białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), stosując standardowe protokoły barwienia (np. barwienie Coomassie blue, srebro).
    3. Wytnij pasma/obszary żelu będące przedmiotem zainteresowania i zbierz je w różnych probówkach do mikrowirówek zawierających odpowiednie objętości ultraczystej wody.
    4. Kontynuuj identyfikację i analizę białek za pomocą spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie opisanej metody ekstrakcji uwolnionych polimerów węglowodanowych z kultur cyjanobakterii jest przedstawione w Rysunek 1. Wytrącone polimery od umiarkowanego producenta EPS cyjanobakterii Synechocystis sp. PCC 6803 i wydajnego producenta EPS Cyanothece sp. CCY 0110 pokazano na Rysunek 2. W Rysunek 3 pokazane są liofilizowane polimery o różnym stopniu zanieczyszczenia, co podkreśla znaczenie etapów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy wydzielania bakteryjnego i zbadać uwolnione produkty, niezwykle ważne jest wykazanie skutecznej izolacji i analizy biomolekuł obecnych w zewnątrzkomórkowym środowisku bakteryjnym (takich jak uwolnione polimery węglowodanowe i białka).

Sinicze zewnątrzkomórkowe polimery węglowodanowe są niezwykle złożone, głównie ze względu na liczbę i proporcje różnych cukrów prostych, które wchodzą w ich skład1. Konwencjonalne metody stosowane do izolacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) poprzez COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugalia 2020, oraz przez portugalskie fundusze poprzez FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior w ramach projektu POCI-01-0145-FEDER-028779 oraz grantu SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Membrany do dializyMedicell Membranes Sp. z o.o. DTV.12000.07Rurka wiskanka Rozmiar 7, średnica 23,8 mm, szerokość 39-41 mm 30m rolka 
Etanol 96%AGA - &Aaostry; lcool e Gé neros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Fermentacja alkoholu etylowego 96% AGA
PES Filtr 0,2 μ mFisher Scientific, Lda15206869Filtr strzykawkowy polistyren 33MM 0,2&mikro; M STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Sp. z o.o.UFC900324Filtry odśrodkowe o nominalnej masie cząsteczkowej 3 kDa
Thermo Scientific  Test białkowy Pierce BCAFisher Scientific, Lda10741395Zielono-niebieski, precyzyjny, kompatybilny z detergentem odczynnik do pomiaru całkowitego stężenia białka
Koncentrat koloidalny Brillant Blue G Sigma Aldrich Quí mika SLB2025-1EACoomassie niebieska 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polimery w glowodanowe cyjanobakteriiizolacja bia ekwytr canie polimer wzag szczanie egzoproteomufiltracja od rodkowawytr canie etanolemproces liofilizacjispektrometria masadaptacja szczep w bakteryjnychzastosowania biotechnologiczne

Powiązane artykuły