Opisujemy nowatorski system analizy chodu, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER), zautomatyzowany system o otwartym dostępie do kwantyfikacji cech chodu u szczurów, który wykorzystuje nowatorską półprzezroczystą podłogę do automatycznego ilościowego określania chodu. System ten został zwalidowany przy użyciu haloperidolowego modelu choroby Parkinsona.
Artykuł metodologiczny
Analiza odcisków łap w nagraniach ze wzmocnieniem kontrastowym (PrAnCER): tani, zautomatyzowany system analizy chodu o otwartym dostępie do oceny deficytów motorycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza chodu jest używana do ilościowego określenia zmian w funkcjach motorycznych w wielu modelach chorób gryzoni. Pomimo znaczenia oceny chodu i funkcji motorycznych w wielu obszarach badań, dostępne opcje komercyjne mają kilka ograniczeń, takich jak wysokie koszty i brak dostępnego, otwartego kodu. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy PrAnCER, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings, do automatycznej kwantyfikacji chodu. Nagrania ze wzmocnionym kontrastem są uzyskiwane przy użyciu półprzezroczystej podłogi, która zasłania obiekty nie stykające się z powierzchnią, skutecznie izolując odciski łap szczura podczas chodzenia. Korzystając z tych filmów, nasz prosty program niezawodnie mierzy różne parametry chodu czasoprzestrzennego. Aby wykazać, że PrAnCER może dokładnie wykrywać zmiany w funkcjach motorycznych, zastosowaliśmy haloperidolowy model choroby Parkinsona (PD). Przetestowaliśmy szczury przy dwóch dawkach haloperidolu: wysokiej dawce (0,30 mg / kg) i niskiej dawce (0,15 mg / kg). Haloperidol znacznie wydłużał czas trwania postawy i powierzchnię kontaktu tylnej łapy w warunkach niskiej dawki, czego można się spodziewać w modelu PD. W warunkach wysokiej dawki stwierdziliśmy podobny wzrost powierzchni kontaktowej, ale także nieoczekiwany wzrost długości kroku. Dzięki dalszym badaniom odkryliśmy, że ta zwiększona długość kroku jest zgodna ze zjawiskiem ucieczki usztywnienia, powszechnie obserwowanym przy wyższych dawkach haloperidolu. W ten sposób zespół projektu PrAnCER był w stanie wykryć zarówno oczekiwane, jak i nieoczekiwane zmiany we wzorcach chodu gryzoni. Dodatkowo potwierdziliśmy, że PrAnCER jest spójny i dokładny w porównaniu z ręczną oceną parametrów chodu.
Wprowadzenie
Gryzonie są powszechnie używane jako modele do badania szerokiego zakresu chorób i urazów, w tym artretyzmu1, Choroba Parkinsona (PD)2,3, zaburzenia nerwowo-mięśniowe4,5, wodogłowie6, oraz uraz rdzenia kręgowego7. W tych warunkach objawy, takie jak ból, równowaga i funkcje motoryczne, można zmierzyć, badając wzorce chodu zwierząt. Wzorce te są określane ilościowo za pomocą zestawu parametrów chodu czasoprzestrzennego, które podsumowują lokalizację i czas odcisków łap, a także obszar kontaktu łapy z podłożem.
Chociaż istnieje wiele opcji analizy chodu, obecne systemy mają kilka wad. W tradycyjnych testach atramentu i papieru, łapy zwierzęcia są pokrywane atramentem, zanim przejdzie ono przez arkusz białego papieru (Rysunek 1A). Uzyskane odciski łap można następnie zmierzyć pod kątem długości kroku i szerokości podpory, ale nie można ocenić kluczowych parametrów chodu skroniowego, takich jak prędkość lub czas trwania kroku. Nowoczesne systemy oparte na wideo są bardziej niezawodne, ale analiza wideo wymaga pracochłonnego oceniania klatka po klatce, chyba że używany jest odpowiedni zautomatyzowany system8. Obecnie dostępnych jest wiele komercyjnych zautomatyzowanych systemów oceniania, ale systemy te mogą być zbyt drogie. Ponadto systemy te opierają się na przezroczystej podłodze lub, w niektórych przypadkach, bieżniach, które zmieniają naturalny ruch. Wykazano, że bieżnie maskują deficyty motoryczne w niektórych modelach chorób9, podczas gdy przezroczysta podłoga (Rysunek 1B) powoduje, że myszy spędzają więcej czasu na obrzeżach otwartego pola, co wskazuje na zwiększony niepokój10. Idealnie byłoby, gdyby aparat do analizy chodu nie polegał na żadnym z nich, wytwarzając najbardziej naturalne wzorce ruchowe przy najmniejszym obciążeniu zwierzęcia.
Dostępne opcje open-source i komercyjne wykorzystują różne metody, aby przezwyciężyć trudności związane z izolacją odcisku stopy od ciała zwierzęcia pomimo zmiennych warunków oświetleniowych, koloru zwierzęcia i kształtów druku. Niektóre zwiększają kontrast stykających się łap za pomocą powierzchni, które uwalniają światło w odpowiedzi na nacisk7,11,12, ale są one drogie i technicznie trudne do zbudowania. Inne systemy wykorzystują wiele kątów widzenia, które pozwalają na obserwację koordynacji całego ciała8,13. Chociaż opcje te oferują korzyści w zakresie pomiaru dodatkowych parametrów motorycznych poza chodem, są niepotrzebnie skomplikowane w przypadku prostej analizy chodu. Co więcej, wszystkie te techniki opierają się na przezroczystej podłodze, która zmienia naturalne zachowanie.
PrAnCER opiera się na tym, co nazywamy Nagraniami o Wzmocnionym Kontraście, które wykorzystują kombinację oświetlenia i półprzezroczystej podłogi, aby zwiększyć wykrywalność odcisków. Patrząc od dołu, tworzy to obraz o wysokim kontraście (odcisk łapy), jednocześnie zasłaniając widok obiektów, które nie mają kontaktu z powierzchnią (ciało zwierzęcia) (Rysunek 1D). Patrząc z góry, podłoga wydaje się nieprzezroczysta. Wynikające z tego wydolność łap w naszej metodzie pozwala na dokładną identyfikację różnych cech chodu i lokomotoryki przez nasz nowo opracowany zautomatyzowany system. W niniejszym badaniu opisujemy aparat, nasz protokół analizy chodu oraz nasz automatyczny system punktacji, PrAnCER. Nasz aparat jest łatwy w montażu, a PrAnCER może być używany do oceny deficytów motorycznych w szerokim zakresie modeli chorób i urazów.
Aby zademonstrować, że PrAnCER może być używany do wykrywania nieprawidłowych wzorców chodu, użyliśmy haloperidolowego modelu PD, prostego modelu przejściowej indukcji zmian lokomotorycznych14. Haloperidol jest antagonistą receptora dopaminowego szeroko stosowanym jako lek przeciwpsychotyczny1. Wpływa na układy motoryczne poprzez zmianę sygnalizacji dopaminy w prążkowiu, ważnym elemencie szlaku motorycznego w zwojach podstawy 14. Nawet pojedyncza dawka haloperidolu szybko obniża zewnątrzkomórkowy poziom dopaminy w prążkowiu, powodując zaburzenia motoryczne podobne do parkinsonowskich15. Efekty behawioralne to sztywność mięśni, akinezja i katalepsja, która jest definiowana jako niezdolność do powrotu do normalnej postawy po umieszczeniu w nietypowej pozycji11,16. Ostre dawki haloperidolu powodują deficyty lokomotoryczne identyfikowalne w teście funkcji motorycznych Rotarod17. Doszliśmy do wniosku, że zaburzenia lokomotoryczne za pośrednictwem haloperidolu będą również widoczne w wielu cechach dostępnych do automatycznej analizy chodu.
Chociaż reakcje na haloperidol różnią się znacznie w różnych badaniach, kataleptyczne efekty haloperidolu pojawiają się przy dawkach 0,5 mg/kg i wyższych, podczas gdy zmniejszona responsywność i upośledzenie motoryczne są wykrywalne przy niższych dawkach (0,1 - 0,3 mg/kg)16,17. Starając się uniknąć kataleptycznego działania haloperidolu, zdecydowaliśmy się przetestować dwie dawki haloperidolu: wysoką dawkę (0,30 mg/kg) i niską dawkę (0,15 mg/kg). Jak pokazano w Tabeli 1, w Eksperymencie 1 badano wpływ haloperidolu w dużej dawce, podczas gdy w Eksperymencie 2 testowano działanie haloperidolu w małej dawce. Zastosowaliśmy projekt wewnątrzobiektowy, w którym każdy szczur był testowany w warunkach wysokiej dawki, niskiej dawki i kontroli (sól fizjologiczna). Kolejność warunków była zrównoważona u szczurów. Przewidywaliśmy, że ostre podanie haloperidolu spowoduje zaburzenia chodu podobne do tych występujących w innych modelach PD, takie jak zmniejszona prędkość, zmniejszona długość kroku i dłuższy czas trwania postawy3,14,18,19. Zaobserwowaliśmy zmiany w zachowaniu, w tym akinezję, po podaniu haloperidolu w obu dawkach. W warunkach niskiej dawki szczury miały znacznie wydłużony czas trwania postawy i obszar kontaktu z tylną łapą, zgodnie z oczekiwaniami. Te zmiany chodu są porównywalne do powolnych, powolnych kroków powszechnych wśród pacjentów z PD2,20. Jednak w warunkach wysokiej dawki zaobserwowaliśmy wzrost długości kroku, a także wzrost powierzchni kontaktu łapy. Chociaż wzrost długości kroku był nieoczekiwany, dalszy przegląd literatury wykazał, że jest to prawdopodobnie część wywołanej przez haloperidol reakcji usztywniającej i ucieczki. Dochodzimy do wniosku, że PrAnCER jest rzeczywiście w stanie wykryć podobne do parkinsonowskich zmiany w chodzie gryzoni, zgodne ze stosowaniem neuroleptyków.
Protokół
Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Brown.
1. Aparatura do analizy chodu
- Przygotuj chodnik do analizy chodu składający się z przezroczystego chodnika z pleksi (36" dł. x 3" szer. x 4,5" wys.) umieszczonego na przezroczystej podłodze z pleksi (Rysunek 2A). Spraw, aby podłoga z pleksi była półprzezroczysta, przykrywając ją kawałkiem welinu z włókna bawełnianego o grubości 16 funtów, przyciętego na tę samą szerokość co chodnik.
UWAGA: Istnieją inne metody wytwarzania półprzezroczystej podłogi. - Umieść kamerę o liczbie klatek na sekundę wynoszącej co najmniej 30 klatek na sekundę (kl./s) bezpośrednio pod chodnikiem, aby uchwycić środek toru (Rysunek 2B).
- Zabezpiecz pasek świateł LED 12 V z 18 diodami LED/stopę w odległości około 2 cali od podłogi chodnika i 1 cal nad nią, aby oświetlić tor.
2. Przygotowanie zwierząt
- Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w wiwarium przez co najmniej 1 tydzień przed obsługą. Z szczurami należy obchodzić się przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem eksperymentu. W badaniu wykorzystano 8 samców szczurów Long Evans w wieku około 3 miesięcy.
- Przyzwyczaj zwierzęta do pomieszczenia do testów i chodnika do chodu przy wyłączonym świetle w pomieszczeniu
- Umieść klatkę domową szczura na poziomie powierzchni na końcu chodnika chodu, aby służyła jako skrzynka na bramki. Należy pamiętać, że jeśli klatka domowa jest głęboka, szczury w podeszłym wieku lub z upośledzeniem ruchowym mogą skorzystać z rampy lub stopnia, aby zapewnić łatwiejszy dostęp do klatki domowej.
- Pozwól szczurowi przejść od ręki eksperymentatora w dół chodnika, aby dotrzeć do swojej domowej klatki.
- Szczury często zatrzymują się na końcu chodnika, aby się rozejrzeć, zanim zeskoczą do klatki domowej. Jeśli szczur potrzebuje więcej niż 1 minutę, aby opuścić chodnik, zachęć go do wejścia do klatki domowej delikatnym pchnięciem.
- Jeśli szczur się odwróci, użyj małego kawałka pleksi, aby zablokować "początkowy" koniec chodnika. Powtórz w sumie 3 biegi.
- Przyzwyczajaj się przez co najmniej 2 dni lub do momentu, gdy szczury będą czuły się komfortowo, przechodząc przez chodnik w stałym tempie bez zamarzania.
3. Procedura testowania chodu
- Dostosuj ustawienia w oprogramowaniu kamery internetowej, aby uzyskać jak najwyraźniejszy obraz odcisków łap. Wyłącz światła w pomieszczeniu na czas wszystkich testów chodu.
- Rejestruj każdy przebieg oddzielnie i odpowiednio oznacz go do użycia z programem do automatycznej analizy.
- Upewnij się, że na welinie nie ma plam ani zanieczyszczeń. Rozpocznij nagrywanie na kilka sekund przed wejściem szczura na chodnik i zatrzymaj się, gdy szczur opuści chodnik i wejdzie do swojej klatki domowej.
- Kontynuuj, aż zostaną ukończone trzy dopuszczalne przebiegi lub upłynie 10 minut.
- Przetrzyj chodnik etanolem między każdym szczurem i wymień welin w razie potrzeby.
UWAGA: Dopuszczalna próba jest definiowana jako taka, w której zwierzę chodzi konsekwentnie i bez przerwy przez pierwsze 4 kroki biegu. Jeśli jest to trudne do osiągnięcia, dostosuj kryteria tak, aby uwzględniały próby, w których w dowolnym momencie przebiegu występują 4 następujące po sobie kroki, które występują bez przerw lub nagłego przyspieszenia.
4. Zautomatyzowana analiza PrAnCER
- Umieść wszystkie filmy do analizy w folderze.
- Uruchom PrAnCER, uruchamiając skrypt Pythona PrAnCER. PrAnCER przeanalizuje filmy w oparciu o kroki zilustrowane na Rysunek 3 i Rysunek 4.
- W menu podręcznym wybierz określony folder, naciskając przycisk Wybierz folder. W razie potrzeby wybierz niestandardowe opcje analizy. Szczegółowe opisy poszczególnych parametrów znajdują się klikając w znak zapytania obok nich. Kliknij przycisk Kontynuuj po zakończeniu.
- Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na wyświetlonym obrazie chodnika. Aby to zrobić, kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zdefiniować górną krawędź i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zdefiniować dolną krawędź. Jeśli wyświetlone okno jest poprawne, naciśnij N, aby kontynuować. Jeśli nie, naciśnij Z, aby cofnąć. Po naciśnięciu N program uruchomi się automatycznie.
- Po zakończeniu PrAnCER zakończ program, naciskając Enter w terminalu.
- Aby ręcznie przejrzeć wyniki wyjściowe przez PrAnCER, uruchom skrypt GaitEditorGUI w języku Python i wybierz odpowiedni plik .mp4 dla każdego filmu. W razie potrzeby popraw błędnie zidentyfikowane lub scalone wydruki.
- Aby wyodrębnić parametry chodu przestrzennego i czasowego, uruchom skrypt ParameterAnalyzer języka Python. Wybierz liczbę odcisków palców do analizy oraz folder z filmami do analizy, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj. Spowoduje to wyświetlenie pliku .csv dla każdego filmu zawierającego szereg typowych parametrów chodu, które są opisane w Tabeli 2 i zilustrowane w Rysunek 5.
UWAGA: Pełne skrypty, a także instrukcje dotyczące odczytywania i analizowania danych, są dostępne na GitHubie autora (www.github.com/hayleybounds). Zaimplementowaliśmy ten algorytm przy użyciu darmowej biblioteki Pythona OpenCV21. Na GitHubie znajdują się również instrukcje dotyczące tworzenia naszego chodnika do analizy chodu.
Wyniki
Procedura z użyciem haloperidolu
Opracowaliśmy ten system analizy chodu w celu porównania parametrów chodu u szczurów kontrolnych z parametrami u szczurów eksperymentalnych, u których oczekiwano wystąpienia różnych zaburzeń lokomocyjnych, chodu i równowagi. Zastosowaliśmy schemat badawczy wewnątrzobiektowy, w którym każdy szczur był badany w warunkach podania soli fizjologicznej, wysokiej dawki haloperidolu oraz niskiej dawki haloperidolu. Szczury podzielono na dwie grupy (A i B), aby umożliwić zastosowanie kontrbalansowania; testy chodu były kontrbalansowane pod kątem pory dnia oraz kolejności warunków. Każdy test był oddzielony odstępem 48 h. Szczury poddano lekkiej anestezji izofluranem przed wykonaniem dokanałowych (IP) wstrzyknięć soli fizjologicznej lub haloperidolu. Chód badano 1 h po wstrzyknięciu, kiedy stężenie haloperidolu powinno osiągnąć poziom szczytowy15,16,17.
Wyniki behawioralne
Zaobserwowaliśmy wyraźne zmiany w zachowaniu zwierząt leczonych haloperidolem. W warunkach stosowania wysokiej dawki u pięciu z ośmiu szczurów wystąpiły okresy znieruchomienia na początku ścieżki, podczas których zwierzęta nie reagowały na dotyk eksperymentatora i stawiały opór przy próbach przemieszczenia. W niektórych przypadkach stan ten utrzymywał się przez kilka minut, aż do momentu usunięcia szczura ze ścieżki. W innych przypadkach znieruchomiały szczur nagle zaczynał szybko się poruszać lub „skakać” wzdłuż ścieżki, po czym powracał do stanu znieruchomienia pod jej koniec. W warunkach stosowania niskiej dawki u 3 z 8 szczurów wystąpiły podobne okresy znieruchomienia. Przy tej dawce odnotowano tylko jeden przypadek zachowania polegającego na skakaniu. Nie zaobserwowano żadnych skoków u zwierząt leczonych solą fizjologiczną.
Przeanalizowano wpływ haloperidolu na następujące parametry chodu: szerokość podparcia, długość kroku, prędkość kroku, czas trwania fazy podparcia, stosunek fazy podparcia do fazy przeniesienia, maksymalną powierzchnię kontaktu oraz odległość między kończynami. Ponieważ wiele parametrów chodu dla kończyn przednich i tylnych jest identycznych, a haloperidol zazwyczaj wywiera jednolity wpływ na wszystkie kończyny, obliczono parametry tylko dla kończyn tylnych i nie rozdzielono danych dla kończyn lewej i prawej. Dla każdego szczura obliczono średnią wartość każdego parametru chodu ze wszystkich użytecznych przebiegów z każdego dnia testowego. Wszystkie parametry (z wyjątkiem zmienności prędkości) obliczono jako średnią dla pierwszych 4 użytecznych kroków w przebiegu. Aby ocenić, czy każda dawka haloperidolu istotnie wpłynęła na chód, zastosowano test t dla prób zależnych. W Eksperymencie 1 odnotowano istotny wzrost długości kroku (Rycina 6A; t(7) = -2,962, p = 0,021) oraz maksymalnej powierzchni kontaktu (Rycina 6A; t(7) = -2,51, p = 0,04) u zwierząt leczonych wysoką dawką haloperidolu. Szerokość podparcia, prędkość, czas trwania fazy podparcia oraz stosunek fazy podparcia do fazy przeniesienia nie wykazały istotnych zmian. W Eksperymencie 2 zwierzęta otrzymujące niską dawkę haloperidolu wykazały istotny wzrost czasu trwania fazy podparcia (Rycina 6B; t(7) = -2,4, p = 0,044) oraz maksymalnej powierzchni kontaktu (Rycina 6B; t(7) = -3,085, p = 0,018) w porównaniu do stanu kontrolnego z solą fizjologiczną. Żadne inne parametry chodu nie były istotne. Dodatkowo stwierdzono istotną różnicę między grupą z wysoką a niską dawką haloperidolu w odniesieniu do szerokości podparcia (Rycina 6C; t(7) = 2,651, p = 0,033), maksymalnej powierzchni kontaktu (Rycina 6C; t(7) = 4,635, p = 0,002) oraz odległości między kończynami (Rycina 6C; t(7) = 3,098, p = 0,017).
Dokładność lokalizacji i błędy w systemie zautomatyzowanym
Aby ocenić dokładność PrAnCER, porównaliśmy jego zautomatyzowaną analizę z manualną oceną 21 losowo wybranych filmów z oddzielnej grupy 6 szczurów kontrolnych. Na potrzeby oceny ręcznej filmy przekształcono w sekwencje obrazów, które następnie wykorzystano do ręcznego zaznaczania lokalizacji odcisków. W celu zwiększenia wydajności analizę ograniczyliśmy do danych przestrzennych mierzonych wyłącznie z odcisków tylnych łap. Wyznaczyliśmy średnią długość kroku oraz BOS dla każdego filmu i porównaliśmy je z wartościami uzyskanymi automatycznie. Podczas gdy średnia długość kroku nie różniła się istotnie między oceną manualną a analizą PrAnCER (Rysunek 7B; t(20) = -0,01, p = 0,9), wartość BOS była istotna (Rysunek 7A; t(20) = -2,21, p = 0,038). Chociaż ocena automatyczna i manualna były ogólnie dobrze skorelowane, system zautomatyzowany wykazał średnio o 5% większą wartość BOS. Różnica ta może wynikać z wariancji w wyborze centroidu, a nie z błędów detekcji. W ocenie manualnej lokalizację odcisku zaznaczano poprzez rysowanie owalu wokół podstawy każdego odcisku tylnej łapy, ponieważ ręczne odtworzenie metody szacowania środka masy stosowanej przez PrAnCER byłoby trudne. Wyraźną tendencją było zawyżanie BOS przez PrAnCER, co może wynikać z faktu, że niektóre zwierzęta mogą rozstawiać palce w sposób asymetryczny, co powoduje, że PrAnCER rejestruje bardziej ekstremalne centroidy niż w ocenie manualnej. Inne systemy również odnotowały istotne zwiększenie BOS pomiędzy oceną manualną a zautomatyzowaną, mimo spójnych pomiarów długości kroku17. Biorąc pod uwagę zaobserwowane niewielkie różnice oraz zgodność z innymi systemami, stwierdzamy, że PrAnCER jest wiarygodnym narzędziem do pomiaru parametrów chodu.
Ważne jest, aby zaznaczyć, że wszystkie analizy dokładności przeprowadzono po manualnej korekcie wyników automatycznych za pomocą interfejsu graficznego (GUI) programu PrAnCER. Podobnie jak w istniejących systemach komercyjnych, krok ten jest niezbędny zarówno do poprawiania błędów w punktacji, jak i do eliminowania serii, które nie spełniają kryteriów22. PrAnCER został skonfigurowany tak, aby dopuszczać więcej wyników fałszywie dodatnich, ponieważ są one łatwiejsze do skorygowania post hoc. Podczas manualnej korekty ponad 50 filmów nigdy nie zaobserwowano, aby PrAnCER nie wykrył rzeczywistego odcisku stopy. Odnotowano jednak inne rodzaje błędów. Dzieliły się one na 3 kategorie: fałszywe wykrycia (wykrycie obiektu niebędącego odciskiem jako odcisku), błędne klasyfikacje (przypisanie odcisku do niewłaściwej kończyny przedniej/tylnej lub lewej/prawej) oraz błędne połączenia (nieprawidłowe scalenie dwóch odcisków). Błędy te są łatwo korygowane w dołączonym GUI i zazwyczaj występują w niewielkim odsetku filmów nagranych w normalnych warunkach. Nawet przy zastosowaniu takich korekt, PrAnCER znacznie zmniejsza nakład pracy ręcznej związanej z analizą chodu. Szacujemy, że w przypadku każdego filmu uruchomienie programu PrAnCER i korekta ewentualnych błędów zajmuje około 3 min, podczas gdy manualne punktowanie i analiza tego samego filmu trwałyby prawie 10 min.
Rysunek 1. Porównanie metod analizy chodu. (A) Tradycyjna metoda z użyciem tuszu i papieru pozwala na uzyskanie niedokładnych odciśnięć kształtu i położenia łap. (B) Nagranie wideo z przezroczystą podłogą zapewnia szczegółowy widok odcisków łap, lecz zawiera wiele wyróżniających się cech ciała szczura, co komplikuje automatyczną ocenę. (C) Umieszczenie lekkiego papieru nad przezrozystą podstawą powoduje powstawanie szumów w obrazie i utratę szczegółów. (D) Zastosowanie pergaminu do stworzenia półprzezroczystego podłoża pozwala na uzyskanie bardzo szczegółowych odbitek przy jednoczesnym wizualnym wyeliminowaniu ciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Schematyczny rysunek urządzenia do analizy chodu oraz rejestracji wideo. (A) Szczur przechodzi przez przejrzysty korytarz z półprzezroczystą podłogą do klatki docelowej, będąc w tym czasie rejestrowanym z poziomu dołu. W tym przypadku podłogę przezroczystą pokryto welinem, aby uczynić ją półprzezroczystą. Korytarz jest oświetlony taśmami LED umieszczonymi wzdłuż jego długości na poziomie między stopami a ciałem zwierzęcia. (B) Zrzut ekranu z nagrania wideo demonstrujący działanie półprzezroczystej podłogi. Wyraźnie widoczne są dwie łapy, natomiast ciało szczura jest w zasadzie niewidoczne. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 3. Proces detekcji jednej klatki odcisku łapy. (A) Oryginalny obraz zostaje poddany odszumianiu, a następnie odejmowaniu tła (B). (C) Zastosowano algorytm wykrywania krawędzi, a wyniki przekształcono w serię współrzędnych X, Y nazywanych konturami (D). (E) Kontury są grupowane według bliskości, a następnie wyznacza się otoczkę wypukłą (ramkę ograniczającą) grupy, aby uzyskać pojedynczy kontur obejmujący wydruk. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 4. Konwersja poszczególnych detekcji w sklasyfikowany odcisk. (A) W pierwszej kolejności odciski łap są identyfikowane w zestawie klatek. (B) Poszczególnym wykrytym obiektom przypisuje się numer identyfikujący je jako odcisk, reprezentujący pojedyncze postawienie jednej łapy (C). (D) Na koniec są one klasyfikowane jako lewe lub prawe na podstawie ich położenia względem linii środkowej ścieżki zwierzęcia oraz jako przednie lub tylne na podstawie ich położenia względem poprzednich odcisków łap. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5. Ilustracja analizowanych parametrów chodu. (A) Przykład wyniku przedstawiający identyfikację i lokalizację odcisków łap. Pierwotnie wykryte krawędzie zaznaczono kolorem czarnym. Końcowe wykryte łapy oraz przybliżony obszar zaznaczono kolorami wskazującymi klasyfikację łap. Na tej ilustracji kolor żółty oznacza przednią lewą, zielony: tylną lewą, cyjanowy: przednią prawą, a magenta: tylną prawą. Kolory te można jednak zmienić w skrypcie Python zgodnie z preferencjami użytkownika. (B) Wykres ilustrujący dwa główne parametry czasowe: czas kontaktu każdej łapy z podłożem (faza podparcia) oraz czas przebywania w powietrzu (faza przeniesienia). Kolorowe bloki oznaczają fazę podparcia, a białe przestrzenie oznaczają fazę przeniesienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6. Wpływ haloperidolu na chód. (A) Wyniki eksperymentu 1: wysoka dawka haloperidolu (HalH) istotnie zwiększoną długość kroku oraz maksymalną powierzchnię kontaktu w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną (Sal). (B) Eksperyment 2 przyniósł bardziej typowe objawy parkinsonowskie; mała dawka haloperidolu (HalL) znacząco zwiększono czas trwania fazy podparcia oraz maksymalną powierzchnię kontaktu. (C) Porównując warunki z zastosowaniem haloperidolu w obu eksperymentach, stwierdzono, że wysoka dawka haloperidolu zwiększyła powierzchnię podparcia, maksymalną powierzchnię kontaktu oraz odległość między kończynami w porównaniu z warunkiem niskiej dawki. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n = 8. Różnice w teście t dla par próbek były następujące: # p < 0,05, ## p < 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 7. Dokładność analizy automatycznej. (A) System zautomatyzowany znacząco różni się od oceny manualnej podczas pomiaru BOS, choć może to wynikać z różnic w manualnym wyborze centroidów, a nie z błędów detekcji. (B) System zautomatyzowany nie wykazuje istotnych różnic w porównaniu z oceną manualną w zakresie długości kroku. Wyniki dokładności są zgodne z wynikami uzyskanymi przy użyciu innych dostępnych systemów. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n = 21. Różnice w teście t dla próbek sparowanych były następujące: # p < 0.05. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8. Porównanie parametrów czasowych. Temporalne wzorce chodu u zwierzęcia traktowanego solą fizjologiczną (A) oraz niska dawka haloperydolu (B). (C) Ilustracja reakcji ucieczkowej z usztywnieniem mięśni u szczura po podaniu wysokiej dawki haloperidolu. Tak jak w Rycina 5kolorowe bloki wskazują momenty, w których łapa była w kontakcie z podłożem (faza podparcia), a białe przestrzenie wskazują momenty, w których łapa znajdowała się w powietrzu (faza przeniesienia). Skróty: FL, przód lewo; HL, lewa tylna; FR, przód prawa strona; HR, prawa tylna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Doświadczenie 1 | Doświadczenie 2 | |||||||
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Test 6 | Test 7 | Test 8 | |
| Grupa A | HalH | Sal | HalH | Sal | Sal | HalL | Sal | HalL |
| Grupa B | Sal | HalH | Sal | HalH | HalL | Sal | HalL | Sal |
Tabela 1. Plan eksperymentalny. Tabela ta przedstawia plan eksperymentalny zastosowany w niniejszym badaniu. Zastosowano schemat wewnątrzgrupowy, w którym każda szczur była badana w warunkach podania wysokiej dawki haloperidolu (HalH), niskiej dawki haloperidolu (HalL) oraz soli fizjologicznej (Sal). Szczury podzielono na dwie grupy; badania zrównoważono pod kątem pory dnia oraz kolejności warunków.
| Parametr | Definicja |
| Długość kroku | Odległość między kolejnymi kontaktami tej samej łapy |
| Długość kroku | Odległość między kolejnymi kontaktami przeciwstawnych przednich lub tylnych łap wzdłuż osi kierunku ruchu |
| Podstawa podparcia (BOS) | Odległość między kolejnymi przeciwstawnymi przednimi lub tylnymi łapami prostopadła do osi kierunku ruchu |
| Maksymalna powierzchnia styku | Maksymalna wykryta powierzchnia odcisku tylnej łapy |
| Odległość między kończynami | Odległość między ipsylateralną przednią a tylną łapą |
| Czas trwania fazy podparcia | Czas kontaktu łapy z podłożem |
| Czas trwania ruchu wahadłowego | Czas, w którym łapa nie stykała się z podłożem |
| Stosunek szerokości stania do rozgnięcia (SSR) | Czas trwania fazy podporowej/czas trwania fazy przenoszenia |
| Prędkość dyskretna | Długość kroku/(czas trwania fazy podparcia + czas trwania fazy przenoszenia) dla łapy |
| Prędkość średnia | Średnia z prędkości dyskretnych w okresie wykorzystanym w analizie |
| Zmienność prędkości | Procentowa zmiana dyskretnych prędkości podczas biegu |
| Prędkość przebiegu | Czas przejścia przez tunel/długość tunelu |
Tabela 2. Opis parametrów chodu.Tabela ta opisuje najczęściej stosowane parametry chodu; te wykorzystane w niniejszym badaniu zaznaczono pogrubieniem.
Dyskusja
W tym badaniu przetestowaliśmy PrAnCER, nowy zautomatyzowany system analizy chodu, który wykorzystuje filmy ze wzmocnieniem kontrastowym wykonane przy użyciu półprzezroczystej podłogi, aby zasłonić ciało zwierzęcia i uzyskać wyraźnie zdefiniowane odciski łap w celu łatwego automatycznego wykrywania. PrAnCER dokładnie identyfikuje odciski łap i jest wrażliwy na zmiany w funkcjonowaniu motorycznym. Użyliśmy PrAnCER do oceny zmian chodu w ostrym haloperidolowym modelu PD. Chociaż haloperidol nie indukował oczekiwanych deficytów motorycznych solidnego modelu PD, byliśmy jednak w stanie wykazać, że PrAnCER może dokładnie wykrywać zmiany we wzorcach chodu. Na koniec określiliśmy ilościowo dokładność PrAnCER i wykazaliśmy, że jego pomiar kluczowych parametrów chodu jest porównywalny z pomiarem ręcznej oceny.
W obu stanach leczonych haloperidolem zaobserwowaliśmy dużą częstość występowania zachowań związanych z zamarzaniem (akinezja), po których następowała reakcja ucieczki polegająca na bieganiu lub skakaniu do przodu. Podczas gdy akinezję obserwowano w podobnej dawce (0,25 mg/kg) w kilku badaniach16,23, to zachowanie ograniczające nie jest zgodne z typowymi objawami Parkinsona 3,14,19,24. Co ciekawe, odkryliśmy, że leczenie wysokimi dawkami haloperidolu skutkowało znacznie wydłużeniem kroku. Odkrycie to było początkowo zaskakujące, ponieważ inne modele haloperidolu PD wykazały zmniejszenie długości kroku 3,19. Mają one jednak sens w świetle wzorca zachowania "usztywnienie-ucieczki" opisanego przez De Rycka i in. (1980), którzy stwierdzili, że szczury biegną, aby uciec po okresach akinetycznych, a chody z dużą prędkością, takie jak bieganie i podskakiwanie, są związane ze zwiększoną długością kroku 4,25 (Figura 8C). Leczenie wysoką dawką skutkowało również znacznie zwiększonym maksymalnym obszarem kontaktu tylnych łap. Leczenie haloperidolem w niskiej dawce spowodowało bardziej charakterystyczne zmiany chodu w chorobie Parkinsona, w tym znaczne wydłużenie czasu trwania postawy i maksymalnego obszaru kontaktu (ryc. 8A-B). Wyniki te mogą być odzwierciedleniem sztywności mięśni związanej z akinezją wywołaną haloperidolem.
Pomimo nietypowego zachowania polegającego na ucieczce usztywniającej, udało nam się wykazać, że PrAnCER rzeczywiście może wykryć zmiany w chodzie. Wykazaliśmy, że w odpowiednich warunkach oświetleniowych półprzezroczysta podłoga może wytwarzać wysoce kontrastowy i szczegółowy obraz łap. W niniejszym badaniu wykonaliśmy przezroczystą podłogę półprzezroczystą, pokrywając ją welinem. Ten sam efekt można osiągnąć, umieszczając na przezroczystej podłodze inną półprzezroczystą powłokę, taką jak Mylar. Alternatywnie, sama podłoga może być półprzezroczysta, stosując np. matową pleksi. Przezroczysta podłoga i prosty chodnik z pleksi są niedrogie i można je zbudować w jedno popołudnie. Nasz system analizy oparty na detekcji krawędziowej jest odporny na wiele zmian w aparacie i oferuje regulowane progi, aby dostosować system do różnych konfiguracji, modeli chorób lub mniejszych zwierząt, takich jak myszy.
Niektóre analizy parametrów chodu zostały zmienione w stosunku do konwencjonalnych formuł ze względu na aspekty chodnika. Na przykład nasza metoda obliczania prędkości różni się od innych badań chodu; półprzezroczysta podłoga w połączeniu z oświetleniem LED zasłania widok ciała, dzięki czemu nie jest możliwe śledzenie pozycji ciała w celu obliczenia prędkości, jak to zwykle ma miejsce. W tym badaniu prędkość obliczono, dzieląc odległość przebytą między dwoma kontaktami tej samej łapy przez czas od pierwszego kontaktu do drugiego kontaktu. Oczywiście można zastosować inne formuły. Na przykład, jeśli potrzebna jest ogólna miara prędkości, można podzielić odległość od średniej lokalizacji łap przednich na początku i na końcu biegu przez czas trwania biegu.
Nasza analiza potwierdza, że chociaż nie jest identyczny z ręcznym ocenianiem, nasz zautomatyzowany system działa z dużą dokładnością i generuje wiarygodne pomiary chodu. Opisywana tutaj aparatura została zoptymalizowana pod kątem prostej, taniej analizy funkcji motorycznych. Można jednak wprowadzić kilka zmian, które zwiększyłyby użyteczność PrAnCER. Jednym z ograniczeń naszego systemu jest to, że półprzezroczysta podłoga, umożliwiając doskonałe wykrywanie łap, zasłania oś ciała zwierzęcia. Chociaż nie uznaliśmy tego za konieczne, można temu zaradzić, dodając do systemu kamerę górną. Kolejnym ulepszeniem byłoby użycie kamery wideo o większej liczbie klatek na sekundę. Chociaż udało nam się uzyskać spójne szacunki parametrów czasowych, dokładność tych pomiarów jest zagrożona przy liczbie klatek na sekundę poniżej 100 kl./s 8. Dodanie szybkiej kamery wideo nie wymagałoby żadnych zmian w oprogramowaniu analitycznym, a jednocześnie zwiększyłoby dokładność i precyzję pomiarów czasowych. Dodatkowo, kilka innych systemów chodu wykorzystuje lustro do jednoczesnego rejestrowania bocznych i brzusznych widoków szczura 2,8,13. Dodanie tej cechy do naszego aparatu pozwoliłoby na dokładniejsze określenie prędkości i lepszą obserwację zachowania podczas biegów.
W tym badaniu wykazaliśmy, że zastosowanie półprzezroczystej podłogi skutecznie izoluje odciski łap, blokując widoczność obiektów niestykających się z podłogą chodnika. Opracowaliśmy zautomatyzowany system punktacji, który wykorzystuje ten odcisk łapy o wysokim kontraście do dokładnej identyfikacji łap. Wykazaliśmy, że ten system, PrAnCER, określa ilościowo parametry chodu z dokładnością porównywalną z systemami komercyjnymi. Ustaliliśmy, że podanie dużej dawki haloperidolu zwiększyło długość kroku i maksymalną powierzchnię kontaktu w porównaniu z solą fizjologiczną. Chociaż zmiana ta jest przeciwieństwem tego, czego się spodziewaliśmy, dalszy przegląd istniejącej literatury wskazuje, że jest ona prawdopodobnie częścią zachowania ucieczki obserwowanego w odpowiedzi na ostre podanie haloperidolu. Leczenie haloperidolem w małych dawkach skutkowało bardziej typowymi objawami choroby Parkinsona, takimi jak wydłużenie czasu trwania postawy i maksymalna powierzchnia kontaktu. Dochodzimy do wniosku, że chociaż ostre podawanie haloperidolu w dużych dawkach jest słabym modelem do badania zaburzeń chodu związanych z PD, nasze badanie wykazało jednak zdolność PrAnCER do dokładnego wykrywania zmian w funkcjach motorycznych. Mamy nadzieję, że w przyszłości uda nam się jeszcze bardziej zweryfikować PrAnCER poprzez badanie zmian lokomotorycznych w innych modelach choroby.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Carney Institute for Brain Science na Uniwersytecie Browna.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| chodowy aparat chodnikowy< / strong> | |||
| 1/4" przezroczysta pleksi | RISD 3D Store, Providence, RI | Przybliżona cena: 50 < USD / > < mocny> kawałek przycięty do 3 1/2 "szer. x 36" dł.; 2 sztuki przycięte do 4 1/2" szer. x 36" dł. Uwaga: Zrobiliśmy nasz chodnik o długości 36 cali w oparciu o istniejący stół z pleksi, który mieliśmy w domu, w razie potrzeby można go łatwo wydłużyć. | |
| 1/4" przezroczysta pleksi | RISD 3D Store, Providence, RI | Przybliżona cena: 10 < br / > < mocny>4 sztuki, przycięty do 1 "W na 4" L < / mocny> Zostaną one wykorzystane do utrzymania tunelu na miejscu | |
| 10 elementów ramowych serii 80/20, profil rowkowy T 1 "x 1" | 80/20 Inc. | 1010-S | Przybliżona cena: 16 < USD / > < mocny>2 sztuki przycięte do 36 "L< / mocny> |
| 12V Elastyczne taśmy LED, paski świetlne LED 16,4 stopy / 5 m, światło dzienne białe | Przybliżona cena Amazon | : 10 USD | |
| Klej Bostik Blu-Tack | Amazon | Przybliżona cena: 8 USD | |
| Welin kreślarski Clearprint 1000H, włókno bawełniane 16 LB | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Przybliżona cena: 50 < USD / > < mocny> przycięty do 4 "szer. x 36" dł. Uwaga: Ten konkretny welin jest dostępny w postaci rolki; Trzymaliśmy go na rolce i przycięliśmy do 4 "W. Mylar lub matowa pleksi mogą być również używane zamiast welinu, ale ustawienia wykrywania oprogramowania kamery musiałyby zostać dostosowane. |
| Kamera internetowa Logitech HD Pro C920, 1080p | Amazon | Przybliżona cena: 50 USD | |
| Mobilny wózek na biurko do laptopa z regulacją wysokości | Amazon | Przybliżona cena: 40 < USD / > Mały stół do umieszczenia domowej klatki zwierząt na końcu chodnika. | |
| Plastikowa rampa | Magazyn | Przybliżona cena: 6 USD Opcjonalnie: rampa pomagająca zwierzętom zejść do klatki domowej | |
| Statyw stołowy RetiCAM z 3-kierunkową głowicą obrotową / pochyloną | Przybliżona cena Amazon | 30 USD | |
| SCIGRIP #16 cement rozpuszczalnikowy do akrylu - przezroczysty, średnio treściwy | Amazon | Przybliżona cena: 8 USD | |
| Stół z pleksi | Przybliżona cena: 15 USD | ||
| Seria 80/20 elementów ramowych, profil z rowkiem T 1,5 "x 1,5" | 80/20 Inc. | 1515 | Przybliżona cena: 110 USD < br / > < mocny>6 sztuk przyciętych do 36 "L, 2 sztuki przycięte do 12" Z obydwoma końcami gwintowanymi standardowymi gwintami 5 / 16-18 Rama do blatu i nóg z pleksi |
| Seria 15 3-drożna - jasnokwadratowa złączka narożna | 80/20 Inc. | 14177 | Przybliżona cena: 24 USD < mocne>4 złącza < / strong> Aby połączyć blat i nogi |
| 1/4" przezroczysty arkusz pleksi | RISD 3D Store, Providence, RI | Przybliżona cena: 50 < > USD cięte na 15 "szer. x 39" L< / mocny> | |
| 5 / 16-18 x 1" Śruba z kulistym | 80/20 Inc. | 3118 | Przybliżona cena: 5 < > ilość = 12< / mocny> |
| Deluxe Nóżki poziomujące, 5 / 16-18 x 2 " | 80/20 Inc. | 2194 | Przybliżona cena: 50 < zł / > < mocny> Ilość = 4 < / mocny> Na nogi stołu |
| " T” Uchwyt klucz sześciokątny z końcówką kulistą, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Przybliżona cena: $ 5 |
Bibliografia
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
Przedruki i uprawnienia
