Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59599

⸱

8 listopada 2019

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Streszczenie

Mikroskopia pojedynczej cząsteczki (SM) jest używana do badania dynamicznych oddziaływań molekularnych biomolekuł znakowanych fluoroforem w czasie rzeczywistym. Jednak fluorofory są podatne na utratę sygnału w wyniku fotowybielania przez rozpuszczony tlen (O2). Aby zapobiec fotowybielaniu i przedłużyć żywotność fluoroforu, stosuje się systemy oczyszczania tlenu (OSS) w celu redukcjiO2. Komercyjnie dostępny OSS może być zanieczyszczony nukleazami, które uszkadzają lub rozkładają kwasy nukleinowe, co zakłóca interpretację wyników eksperymentalnych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania wysoce aktywnej protokatechuaty-3,4-dioksygenazy Pseudomonas putida (PCD) bez wykrywalnego zanieczyszczenia nukleazą. PCD może skutecznie usuwać reaktywne formyO2 poprzez konwersję substratu kwasu protokatechowego (PCA) do kwasu 3-karboksylowego, cis-mukonowego. Metoda ta może być stosowana w każdym układzie wodnym, w którymO2 odgrywa szkodliwą rolę w pozyskiwaniu danych. Metoda ta jest skuteczna w wytwarzaniu wysoce aktywnego, wolnego od nukleaz PCD w porównaniu z dostępnym na rynku PCD.

Wprowadzenie

Biofizyka pojedynczej cząsteczki (SM) to szybko rozwijająca się dziedzina, która zmienia sposób, w jaki patrzymy na zjawiska biologiczne. Dziedzina ta ma unikalną zdolność łączenia podstawowych praw fizyki i chemii z biologią. Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z metod biofizycznych, która pozwala osiągnąć czułość SM. Fluorescencja służy do wykrywania biomolekuł poprzez łączenie ich z małymi organicznymi fluoroforami lub kropkami kwantowymi1. Cząsteczki te mogą emitować fotony, gdy są wzbudzane przez lasery, a następnie nieodwracalnie fotowybielane2. Fotowybielanie występuje, gdy etykiety fluorescencyjne ulegają uszkodzeniom chemicznym, które niszczą ich zdolność do wzbudzania na pożądanej długości fali2,3. Obecność reaktywnych form tlenu (ROS) w buforze wodnym jest główną przyczyną fotowybielania2,4. Dodatkowo, ROS może uszkadzać biomolekuły i prowadzić do błędnych obserwacji w eksperymentach SM5,6. Aby zapobiec uszkodzeniom oksydacyjnym, można zastosować systemy oczyszczania tlenu (OSS)3,7,8. System oksydazy/katalazy glukozowej (GODCAT) jest skuteczny w usuwaniu tlenu8, ale wytwarza potencjalnie szkodliwe nadtlenki jako produkty pośrednie. Mogą one być szkodliwe dla biomolekuł będących przedmiotem zainteresowania w badaniach nad SM.

Alternatywnie, protokatechuat 3,4 dioksygenaza (PCD) skutecznie usunie O2 z roztworu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA)7,9. PCD jest metaloenzymem, który wykorzystuje żelazo niehemowe do koordynowania PCA i katalizowania reakcji otwarcia pierścienia katecholowego za pomocą rozpuszczonego O210. Wykazano, że ta jednoetapowa reakcja jest ogólnie lepszym OSS poprawiającym stabilność fluoroforu w eksperymentach SM7. Niestety, wiele dostępnych na rynku enzymów OSS, w tym PCD, zawiera zanieczyszczające nukleazy11. Zanieczyszczenia te mogą prowadzić do uszkodzenia substratów na bazie kwasów nukleinowych stosowanych w eksperymentach SM. Prace te pozwolą na wyjaśnienie protokołu oczyszczania opartego na chromatografii do stosowania rekombinowanego PCD w systemach SM. PCD może być szeroko stosowany w każdym eksperymencie, w którym ROS uszkadzają podłoża potrzebne do akwizycji danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wywołanie ekspresji PCD u E. coli

  1. Połącz 1 μl plazmidu ekspresyjnego PCD pVP91A-pcaHG (20 ng / μL, Rysunek 1A) i 20 μl E. coli BL21 (20 μl dostępnych na rynku komórek, > 2 x 106 jtk / μg plazmidu) w probówce. Przesuń rurkę, aby wymieszać. Umieść probówkę na lodzie na 5 minut.
  2. Umieść przemianę w temperaturze 42 °C na 30 s. Następnie lód 2 min.
  3. Dodaj 80 μL pożywki SOC (super optymalny bulion z tłumieniem katabolitu: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy). Wytrząsać przy 225 obrotach na minutę (obr./min) 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Umieść reakcję przemiany na agarze LB Amp (1L agaru Luria Bulith: 10 g NaCl, 10 g bakto-tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru, 50 μg/ml ampicyliny; 25 ml na szalkę Petriego o średnicy 10 cm).
  5. Inkubować płytkę pokrywką skierowaną w dół w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
  6. Zaszczepić 50 ml LB Amp (1L LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 50 μg/ml ampicyliny) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml z jedną kolonią. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
  7. Przenieść 20 ml kultury do 4-litrowej kolby z 1 l LB Amp. Wstrząsnąć z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 °C.
  8. Co godzinę mierzy się kulturę OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm). Gdy OD600 w kulturze zbliża się do 0,5, zwiększ częstotliwość pomiarów do co 15 minut. Pożądana gęstość kultury wynosi 0,5 OD600.
  9. Przenieść kolbę o pojemności 4 l do pojemnika z lodem. Zamieszać kolbę w łaźni lodowej, aby obniżyć temperaturę hodowli.
    nuta: Czas spędzony na lodzie powinien być ograniczony do minimum, aby komórki pozostały aktywne metabolicznie. Idealnie byłoby, gdyby komórki znajdowały się na lodzie krócej niż 10 minut.
  10. Pomyślną indukcję PCD można zaobserwować poprzez analizę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Zbierz 1 ml nieindukowanej kultury do probówki. Odwirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g w mikrofugach w temperaturze otoczenia. Zdekantować supernatant.
    1. Rozpuść granulowane komórki w 150 μl PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
    2. Dodaj równą objętość 2X barwnika ładującego (1,2% SDS, 30% glicerolu, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% błękitu bromofenolowego, 15% β-merkaptoetanolu). Skręć próbkę, aby dokładnie wymieszać.
    3. Gotować próbkę przez 3 minuty i przenieść do lodu. Próbka może być przechowywana w zamrażarce o temperaturze -20 °C do przyszłej analizy.
      nuta: PBS jest dostępny w handlu z lub bez CaCl2 i MgCl2. Wiele laboratoriów będzie miało PBS bez CaCl2 i MgCl2 dla metod hodowli komórkowych. Nie znaleźliśmy żadnej różnicy w PBS z lub bez CaCl2 i MgCl2.
  11. Przenieść 4-litrową kolbę do inkubatora w temperaturze 17 °C z wytrząsaniem 180 obr./min. Kontynuuj monitorowanie OD600 co 20 minut.
  12. Przy 0,7 OD600 dodać izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do 0,5 mM końcowego stężenia (0,25 M roztworu podstawowego) i 10 mg/l sześciowodnego siarczanu amonu żelaza (II) (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/ml roztworu podstawowego). Geny PCD pcaH i pcaG są indukowane z promotora T5 przez dodanie IPTG (Figura 1A). Siarczan żelaza jest wiązany przez PCD i jest niezbędny do aktywności katalitycznej poprzez koordynację tlenu podczas otwierania katecholu.
  13. Wstrząsać kulturą przy 180 obr./min w temperaturze 17 °C przez 18 godzin.
  14. Umieścić kolbę hodowlaną w lodzie, jak w ppkt 1.2. Pobrać 1 ml indukowanych komórek dla SDS-PAGE, jak w ppkt 1.3.
  15. Wlać kulturę bakteryjną do butelek odpowiednich do odwirowania. Kulturę o pojemności 1 l można odwirować w 4 butelkach o stożkowym dnie, o pojemności 1 250 ml. Osadzać kulturę w temperaturze 4 °C przez 20 minut w temperaturze 3000 x g. Zdekantować supernatanty. Utylizować odpowiednio bakteryjne odpady płynne.
  16. Pipetować w celu ponownego zaparcia granulek w 25 ml zimnego PBS (CaCl2 i MgCl2 są opcjonalne) na 1 l kultury.
  17. Przenieść zawiesinę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml (1 probówka o pojemności 50 ml na 1 l kultury). Osadzać komórki w roztworze 3000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i odpowiednio zutylizować.
  18. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu do lizy (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazolu, 10% glicerolu, 800 ng/ml pepstatyny, 1 μg/ml leupeptyny i 87,1 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)) przez pipetowanie. Zamrozić zawiesinę za pomocą ciekłego azotu w kolbie Dewara. Probówki z próbkami należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Oczyściliśmy PCD z granulek przechowywanych w temperaturze -80 °C przez rok bez widocznej utraty aktywności.
  19. Porównaj komórki nieindukowane i indukowane za pomocą SDS-PAGE.
    nuta: Nie mieliśmy żadnych trudności z indukcją heterodimeru PCD. Zalecamy jednak przetestowanie indukcji przed kontynuowaniem oczyszczania w przypadku, gdy którykolwiek z odczynników nieoczekiwanie wygasł.
    1. Zmontuj tabliczki do SDS-PAGE (wymiary: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm grubości). Żel do układania w stosy to 1,5 ml 6% poliakrylamidu (6% akrylamidu, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED). Żel rozdzielczy to 3,5 ml 12% poliakrylamidu (12% akrylamidu, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED). Włóż 10-dołkowy grzebień do warstwy układania.
    2. Załadować 10 μl nieindukowanych i indukowanych próbek bakteryjnych. Załaduj 4 μl wstępnie wybarwionych markerów masy cząsteczkowej dla białek (Rysunek 1B).
    3. Elektroforezę żelu pod napięciem 16,5 V/cm około 1 godziny. Błękit bromofenolowy powinien dotrzeć do dna żelu.
    4. Umieść żel w plamie Coomassie Blue (10% kwasu octowego, 40% metanolu, 0,1% barwnika Coomassie Blue) w plastikowej wannie. Plama powinna całkowicie zanurzyć żel. Bejcować w temperaturze otoczenia przez 20 min. Delikatny obrót podczas barwienia jest opcjonalny.
    5. Zastąp roztwór barwnikiem (10% kwas octowy, 40% metanol). Inkubować w temperaturze otoczenia z opcjonalnym delikatnym obracaniem, aż pasma białkowe będą łatwo widoczne.
    6. Zastąp odplamienie wodą dejonizowaną. Wśród białek bakteryjnych indukowane podjednostki PCD powinny być widoczne w indukowanych komórkach. Podjednostka PCD znakowana heksahistydyną pcaH ma masę cząsteczkową 28,3 kDa, a podjednostka pcaG wynosi 22,4 kDa. Jeśli podjednostki PCD nie są widoczne, należy przeprowadzić nową indukcję pochodzącą z nowej kolonii.

2. Oczyszczanie PCD metodą chromatografii powinowactwa niklowego

  1. Rozmrozić na lodzie jedną probówkę o pojemności 50 ml indukowanych komórek. Całkowite rozmrożenie próbki może zająć 2-3 godziny.
  2. Trzymając probówkę na lodzie, sonikuj próbkę o amplitudzie 30% przez 1 minutę, włączając i wyłączając co 1 s. Użyj stożkowego mikrokońcówki (średnica 0,125 cala). Maksymalna moc wynosi 400 W, a częstotliwość 20 kHz i przypada na 1 L osadu hodowlanego.
  3. Po sonikacji dodać lizozym do końcowego stężenia 0,2 mg/ml (10 mg/ml roztworu podstawowego) i trzymać na lodzie przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wlej lizat bakteryjny do wstępnie schłodzonej butelki z poliwęglanu (wymiary: 25 mm x 89 mm). Butelka powinna być kompatybilna z wirnikiem ultrawirówki o stałym kącie. Inne rurki i/lub wirniki mogą być zastąpione, ale końcowa siła grawitacji powinna być zachowana.
  5. Wirować przez 60 minut w temperaturze 120 000 x g w temperaturze 4 °C. Szczątki komórkowe utworzą osad. Supernatant może mieć postać żółtą.
    1. Osad może być włączony do późniejszej analizy SDS-PAGE w celu określenia rozpuszczalności PCD (Rysunek 1B). Rozpuścić osad przez wirowanie w 10 ml PBS. Przenieść 150 μl do probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj próbkę dla SDS-PAGE jak w 1.3.
  6. Wlać supernatant do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zwróć uwagę na głośność. Zanieczyszczenie supernatantu bakteryjnym DNA może prowadzić do uzyskania lepkiej próbki. Genomowe DNA bakterii może blokować przepływ w kolumnie. Etap ultrawirowania 2.2 należy powtórzyć w celu osadzenia DNA bakterii. Kulka z tego drugiego obrotu może nie być dobrze widoczna lub może być przezroczysta.
  7. Przygotować 500 ml buforu Ni A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 10% glicerolu, 800 ng / ml pepstatyny, 1 μg / ml Leupeptyny i 87,1 μg / ml PMSF) i 500 ml buforu Ni B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerolu, 800 ng / ml pepstatyny, 1 μg / ml Leupeptyny, i 87,1 μg/ml PMSF, 250 mM imidazolu, pH 8,0). Przepuść oba Ni przez filtry porowe 0,2 μm.
  8. Próbka, i system FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek) znajdują się w chłodzonym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C. Przemyć pompę A buforem Ni A i pompę B buforem Ni B. Przemyć układ 20 mM imidazolem (8% bufor Ni B, 92% bufor Ni A) do momentu ustabilizowania się UV i przewodności. Rutynowo przepływamy z prędkością 5 ml/min z limitem ciśnienia 1,0 MPa. Natężenie przepływu i limit ciśnienia powinny być określone przez specyfikacje zastosowanego przyrządu FPLC.
  9. Przygotuj kolumnę z 1,5 ml żywicy naładowanej niklem (wymiary: 110 mm długości x 5 mm). Zdolność wiązania żywicy wynosi 50 mg/ml i toleruje ciśnienie 1 MPa. Kolumnę można przelać i przechowywać w temperaturze 4 °C przed oczyszczeniem.
    nuta: Rozmiar kolumny może być proporcjonalnie zwiększony, aby pomieścić więcej niż jedną probówkę o pojemności 50 ml indukowanych komórek, jeśli wymagana jest większa ilość białka. Preferujemy świeżą kolumnę dla każdego preparatu, aby upewnić się, że żadne resztki białka nie zanieczyszczają pożądanego przez nas białka. Jednak żywice niklowe mogą być poddawane recyklingowi zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Przymocuj kolumnę z żywicą naładowaną niklem do FPLC. Przepuścić przez kolumnę 20 ml 92% buforu Ni A i 8% buforu Ni B (20 mM imidazolu) przy 0,5 ml/min z ograniczeniem ciśnienia 0,5 MPa przez kolumnę w celu zrównoważenia. W czasie rzeczywistym FPLC powinien mierzyć A280 (absorbancja UV 280 nm), a także przewodność. Jeśli wartości te nie ustabilizują się po przejściu 20 ml objętości przez kolumnę, należy przepłynąć, aż się ustabilizują.
  11. Załadować próbkę do kolumny (~10 ml) z prędkością 0,15 ml/min. Ustawić limit ciśnienia na 0,5 MPa. Zbierz przepływ.
  12. Przemyć kolumnę 20 ml buforu Ni o stężeniu 20 mM imidazolu (92% buforu Ni A i 8% buforu Ni B). Zachowaj popłucz w probówce o pojemności 50 ml do analizy. Przemyć kolumnę 15 ml 50% buforu Ni A i 50% buforu Ni B (125 mM imidazolu). Zebrać elucję w 19 frakcjach o objętości 0,8 ml. Przemyć kolumnę 15 ml 100% buforu Ni B. Zebrać dodatkowe 75 frakcji po 0,2 ml. Niektóre heterodimery PCD będą eluować w płukaniu 50% buforem Ni B, ale większość heterodimeru będzie eluować w płukaniu 100% buforem Ni B.
  13. Przeanalizuj zebrane frakcje na 12% żelach SDS-PAGE, aby potwierdzić obecność PCD. Dodaj równe objętości barwnika 2X ładującego do frakcji przepływu, mycia i piku A280. Gotować przez 3 minuty. Przełóż na lód. Wlej dwa 12% żele SDS-PAGE (jak w kroku 1.7). Powtórzyć metodę żelową zgodnie z opisem w ppkt 1.7.

3. Test aktywności nukleazy

  1. Na podstawie analizy SDS-PAGE zidentyfikuj frakcje powinowactwa do niklu, które zawierają prawie czystą PCD. Połączyć 5 μl frakcji chromatograficznej i 500 ng 3 kb superskręconego plazmidu pXba+ w buforze reakcyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) o końcowej objętości 50 μL.
    1. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Obejmują kontrolę ujemną (bez dodatku białka) i kontrolę pozytywną (dostępną w handlu PCD). Zatrzymaj reakcję za pomocą 10 μl roztworu zatrzymującego (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
    3. Próbki mogą być przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy. Każdy superskręcony plazmid może być użyty w teście nukleazy, o ile produkty reakcji superskręconego i zrelaksowanego koła mogą być rozwiązane przez elektroforezę w żelu agarozowym.
  2. Wlej 120 ml 1% żelu agarozowego do 1X buforu etydynowego TAE (40 mM octanu tris, 1 mM EDTA, 0,5 μg/ml bromku etydyny) w odlewie żelowym (wymiary: 15 x 10 cm). Użyj grzebienia z 15 dołkami (wymiary studzienki: 5 mm x 1,5 mm). Gdy żel stwardnieje, zanurz go w 1X buforze etydyny TAE.
  3. Przeanalizować 30 μl reakcji za pomocą żelu agarozowego. Elektroforeza przy 10 V/cm w temperaturze otoczenia przez około 1 godzinę. Przód barwnika Orange G powinien znajdować się na końcu żelu.
  4. Użyj skanera fluorescencyjnego, aby natychmiast zobrazować sygnał bromku etydyny żelu. Jeśli użyto plazmidu o wielkości 3 kb, najwolniejszym pasmem będą zrelaksowane okręgi o długości ~3,5 kb, liniowe DNA będzie przebiegać przy 3 kb, a plazmid superskręcony będzie miał najszybszą ruchliwość przy ~2 kb.
    1. Oblicz całkowitą objętość pikseli każdego pasa ruchu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Określ objętość pikseli różnych gatunków DNA, takich jak superskręcone, liniowe i nacięte okręgi. Użyj tych wartości, aby określić procentowy udział każdego gatunku DNA. Na przykład zwiększona obecność wyszczerbionych kółek związanych z frakcją w porównaniu z kontrolą ujemną wskazuje na obecność nukleazy. Objętość pikseli wyciętych okręgów w pasie jest dzielona przez wartość piksela całkowitego DNA. Określ wartość procentową, mnożąc tę liczbę przez 100.
  5. Połącz frakcje z drugiego piku elucji, które zawierają prawie czysty heterodimer PCD na podstawie analizy SDS-PAGE i mają minimalną lub niewykrywalną aktywność nukleazy. Nasza typowa łączna objętość to ~2 mL.
  6. Załadować próbkę do filtra odśrodkowego z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kDa. Wirować w obrotowym wiadrze, wirować przy 4000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można użyć wirnika o stałym kącie nachylenia 35° przy 7500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Powtarzać wirowanie, aż końcowa objętość retentatu wyniesie 100-200 μl.
    2. Odwrócić jednostkę filtrującą i odzyskać retentat przez odwirowanie przy 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.

4. Oczyszczanie PCD metodą chromatografii wykluczającej rozmiar

  1. Przygotować bufor do chromatografii wykluczającej (SEC) o objętości 250 ml (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerolu, 0,1 mM EDTA, 800 ng/ml pepstatyny, 1 μg/ml leupeptyny i 87,1 μg/ml PMSF). Przepuścić bufor przez filtr porowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Wszystkie czynności należy wykonać w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 4 °C. Oczyszczanie SEC jest opcjonalne, ale białko powinno być przechowywane w buforze działającym SEC. W przypadku pominięcia oczyszczania SEC, retentat zebrany w ppkt 3.6.2. należy dializować w 1 l buforu SEC w rurkach dializacyjnych MWCO (odcięta masa cząsteczkowa) o masie cząsteczkowej 10 kDa w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Zrównoważyć usieciowaną kolumnę agarozową SEC (chromatografia wykluczania wielkości) (wymiary: 10 mm x 300 mm; objętość złoża 24 ml; objętość próbki 25 - 500 μl; limit ciśnienia 1,5 MPa; 2 x 10 Limit wykluczenia6 Da; separacja od 1 do 300 kDa) z buforem do pracy SEC przy 0,5 ml/min.
    nuta: W razie potrzeby można użyć kolumn SEC o alternatywnym rozmiarze.
  3. Załadować skoncentrowane frakcje do pętli iniekcyjnej o objętości 200 μl. Załadować próbkę z prędkością 0,5 ml/min do kolumny. Rozdzielczość SEC wzrasta wraz ze zmniejszaniem objętości ładunku. Eluować za pomocą 23 ml buforu SEC i zebrać 94 frakcje po 250 μl. Chromatogram SEC powinien rozdzielić pojedynczy pik A280, który jest heterodimerem PCD. Okazuje się, że PCD eluuje 8,9 ml. Czas elucji zmieni się w zależności od alternatywnych kolumn SEC.

5. Testy utleniania PCA i aktywności nukleazy

  1. Reakcje do oznaczania zarówno utleniania PCA, jak i aktywności nukleazy przeprowadza się w 96-dołkowej płytce o płaskim dnie. Zebrać reakcje na 96-dołkowej płytce na lodzie w chłodni o temperaturze 4 °C, aby zapobiec przedwczesnej katalizie. Połączyć w końcowej objętości 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/ml superskręconego plazmidu pXba+ i 10 μL poszczególnych frakcji PCD SEC.
    nuta: Frakcje PCD SEC powinny być dodawane jako ostatnie i bezpośrednio przed analizą, ponieważ białko rozpocznie katalizę w momencie dodawania.
  2. Utlenianie PCA metodą PCD powoduje zmniejszenie absorbancji PCA przy długości fali 290 nm (A290). Przenieść 96-dołkową płytkę do uchwytu czytnika płytek ustawionego na temperaturę wewnętrzną 37 °C. Wsunąć uchwyt płytki do przyrządu i mierzyć A290 w odstępach 20 s przez 1 godzinę. Niech przyrząd potrząśnie płytką 5 s przed każdym odczytem.
  3. Po 1 godzinie zakończ reakcje, dodając 10 μl roztworu zatrzymującego (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
  4. Przygotuj, załaduj i uruchom żel agarozowy jak w kroku 3.2.
  5. Zobrazuj i przeanalizuj żel agarozowy jak w kroku 3.3.
  6. Wybrać frakcje o największej aktywności utleniania PCA i braku zaobserwowanego zanieczyszczenia nukleazą do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C. Zmierzyć A280.
  7. Obliczyć całkowite stężenie PCD przy użyciu A280 i współczynnika ekstynkcji (ε280) wynoszącego 734 700 M-1 cm-1.
  8. Szybkie zamrażanie poszczególnych frakcji w ciekłym azocie. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Alternatywnie połącz aktywne, wolne od nukleaz frakcje, podwielokrotność i zamroź w ten sam sposób. Nasza typowa wydajność to 1-2 mg PCD na l hodowli. Typowe zastosowanie w eksperymencie SM to 3 μg PCD. Stosowaliśmy PCD przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku bez spadku aktywności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dostępny komercyjnie pochłaniacz tlenu PCD jest często zanieczyszczony nukleazą DNA. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników w badaniach fluorescencyjnych, szczególnie w tych analizujących DNA lub białka oddziałujące z DNA. Stwierdziliśmy, że rekombinowany PCD, będący heterodimerem białek pcaH i pcaG z tagiem heksahistydynowym, może być ekspresowany w E. coli (Rycina 1). Heterodimer jest najpierw oczyszczany za pomocą chromatog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Systemy oczyszczania tlenu są powszechnie stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w celu zmniejszenia fotobielenia 3,7,8. Te techniki mikroskopowe są często używane do obserwacji interakcji kwasów nukleinowych lub białek z kwasami nukleinowymi 1,13,14. Zanieczyszczenie OSS nukleazami może prowadzić do fałszywych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH GM121284 i AI126742 do KEY.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148β ME
30% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu, 29:1Bio-Rad161-0156
Kwas octowy, Certyfikat lodowcowy ACSFisherl ChemicalA38C-212
Agar, granulowanyBD BiosciencesDF0145-17-0
System AKTA FPLCOczyszczacz AKTA do spraw nauk przyrodniczych GE Healthcare: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 i Frac-920
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 EMDMilliporeUFC20102410 kDa MWCO
Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)SigmaF-2262
Tabletki nadsiarczanu amonu (APS)AmrescoK833-100TABS
AmpicylinaAmresco0339-25G
Bacto TryptoneBD BiosciencesDF0123173
Dodatek do odwodnionych pożywek hodowlanych BD Bacto: Ekstrakt drożdżowy z butelkiVWR90004-092
BIS-TRIS propan, >=99,0% (miareczkowanie)Sigma-AldrichB6755-500G
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
Coomassie Brilliant BlueAmresco0472-50G
Costar 96– Dobrze płaskie– Dolna płyta EIABio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT
buforowana fosforanem Dulbecco 500MLSigma-AldrichD8537-500MLPBS
Bromek etydynyThermo Fisher ScientificBP1302
GlicerolFisher ScientificG37-20
Granulowany bulion LB MillerEMD Biosciences1.10285.0500
Hi-Res Standard AgarozaAGTC BioproductsAG500D1
ImidazolSigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
LeupeptinRoche11017128001
Lizozym z Białka Jaja KurzegoSigma-AldrichL6876-1G
mikroobjętościowy chlorku magnezuAmresco0288-1KG
z możliwością kuwetowaniaThermo FisherND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml)Qiagen30430
Novagen BL21 Competent CellsEMD Millipore69-449-3W zestawie
Orange GFisher Scientific0-267
PepstatinGold BiotechnologyP-020-25
PMSFAmresco0754-25G
Kwas protokatechowyFisher ScientificICN15642110PCA
Dodecylosiarczan soduP212121CI-00270-1KG
Czytnik mikropłytek SpectraMax M2Urządzenia molekularne
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 250 mlThermo Fisher Scientific09-741-04
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 500 mlThermo Fisher Scientific09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Healthcare Nauki przyrodnicze17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
Typhoon 9410 w trybie zmiennymGE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
Sól fizjologiczna Sześciowodny spektrofotometr , nośnik SOCKamera fluorescencyjna

Bibliografia

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409(2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja i oczyszczanie PCDchromatografia powinowactwa do nikluchromatografia elowamikroskopia pojedynczych cz steczeksystem usuwania tlenuprotok transformacji plazmidowejindukcja hodowli bakteryjnejtest aktywno ci nukleazy
Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.