Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Podsumowanie

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Streszczenie

Mikroskopia pojedynczej cząsteczki (SM) jest używana do badania dynamicznych oddziaływań molekularnych biomolekuł znakowanych fluoroforem w czasie rzeczywistym. Jednak fluorofory są podatne na utratę sygnału w wyniku fotowybielania przez rozpuszczony tlen (_O2). Aby zapobiec fotowybielaniu i przedłużyć żywotność fluoroforu, stosuje się systemy oczyszczania tlenu (OSS) w celu redukcji_O2. Komercyjnie dostępny OSS może być zanieczyszczony nukleazami, które uszkadzają lub rozkładają kwasy nukleinowe, co zakłóca interpretację wyników eksperymentalnych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania wysoce aktywnej protokatechuaty-3,4-dioksygenazy Pseudomonas putida (PCD) bez wykrywalnego zanieczyszczenia nukleazą. PCD może skutecznie usuwać reaktywne formy_O2 poprzez konwersję substratu kwasu protokatechowego (PCA) do kwasu 3-karboksylowego, cis-mukonowego. Metoda ta może być stosowana w każdym układzie wodnym, w którym_O2 odgrywa szkodliwą rolę w pozyskiwaniu danych. Metoda ta jest skuteczna w wytwarzaniu wysoce aktywnego, wolnego od nukleaz PCD w porównaniu z dostępnym na rynku PCD.

Wprowadzenie

Biofizyka pojedynczej cząsteczki (SM) to szybko rozwijająca się dziedzina, która zmienia sposób, w jaki patrzymy na zjawiska biologiczne. Dziedzina ta ma unikalną zdolność łączenia podstawowych praw fizyki i chemii z biologią. Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z metod biofizycznych, która pozwala osiągnąć czułość SM. Fluorescencja służy do wykrywania biomolekuł poprzez łączenie ich z małymi organicznymi fluoroforami lub kropkami kwantowymi¹. Cząsteczki te mogą emitować fotony, gdy są wzbudzane przez lasery, a następnie nieodwracalnie fotowybielane². Fotowybielanie występuje, gdy etykiety fluorescencyjne ulegają uszk....

Protokół

1. Wywołanie ekspresji PCD u E. coli

1. Połącz 1 μl plazmidu ekspresyjnego PCD pVP91A-pcaHG (20 ng / μL, Rysunek 1A) i 20 μl E. coli BL21 (20 μl dostępnych na rynku komórek, > 2 x 10⁶ jtk / μg plazmidu) w probówce. Przesuń rurkę, aby wymieszać. Umieść probówkę na lodzie na 5 minut.
2. Umieść przemianę w temperaturze 42 °C na 30 s. Następnie lód 2 min.
3. Dodaj 80 μL pożywki SOC (super optymalny bulion z tłumieniem katabolitu: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% trypton, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM MgSO₄, 10 mM MgCl₂, 20 mM glukozy). Wytrząsać przy 22....

Wyniki

Dostępny komercyjnie pochłaniacz tlenu PCD jest często zanieczyszczony nukleazą DNA. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników w badaniach fluorescencyjnych, szczególnie w badaniach analizujących DNA lub białka oddziałujące z DNA. Stwierdziliśmy, że rekombinowany PCD, będący heterodimerem białek pcaH i pcaG z znacznikami heksahistydynowymi, może być eksprymowany w E. coli (Rysunek 1). Heterodimer jest w pierwszej kolejności oczys.......

Dyskusja

Systemy oczyszczania tlenu są powszechnie stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w celu zmniejszenia fotobielenia ^3,7,8. Te techniki mikroskopowe są często używane do obserwacji interakcji kwasów nukleinowych lub białek z kwasami nukleinowymi ^1,13,14. Zanieczyszczenie OSS nukleazami może prowadzić do fałszywych.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	β ME
30% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu, 29:1	Bio-Rad	161-0156
Kwas octowy, Certyfikat lodowcowy ACS	Fisherl Chemical	A38C-212
Agar, granulowany	BD Biosciences	DF0145-17-0
System AKTA FPLC	Oczyszczacz AKTA do spraw nauk przyrodniczych GE Healthcare	: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 i Frac-920
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 EMD	Millipore	UFC201024	10 kDa MWCO
Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)	Sigma	F-2262
Tabletki nadsiarczanu amonu (APS)	Amresco	K833-100TABS
Ampicylina	Amresco	0339-25G
Bacto Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
Dodatek do odwodnionych pożywek hodowlanych BD Bacto: Ekstrakt drożdżowy z butelki	VWR	90004-092
BIS-TRIS propan, >=99,0% (miareczkowanie)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue	Amresco	0472-50G
Costar 96– Dobrze płaskie– Dolna płyta EIA	Bio-Rad	2240096EDU
DTT	P212121	SV-DTT
buforowana fosforanem Dulbecco 500ML	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	PBS
Bromek etydyny	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glicerol	Fisher Scientific	G37-20
Granulowany bulion LB Miller	EMD Biosciences	1.10285.0500
Hi-Res Standard Agaroza	AGTC Bioproducts	AG500D1
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250-250G
IPTG	Goldbio	I2481C25
Leupeptin	Roche	11017128001
Lizozym z Białka Jaja Kurzego	Sigma-Aldrich	L6876-1G
mikroobjętościowy chlorku magnezu	Amresco	0288-1KG
z możliwością kuwetowania	Thermo Fisher	ND-2000C
NaCl	P212121	RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml)	Qiagen	30430
Novagen BL21 Competent Cells	EMD Millipore	69-449-3	W zestawie
Orange G	Fisher Scientific	0-267
Pepstatin	Gold Biotechnology	P-020-25
PMSF	Amresco	0754-25G
Kwas protokatechowy	Fisher Scientific	ICN15642110	PCA
Dodecylosiarczan sodu	P212121	CI-00270-1KG
Czytnik mikropłytek SpectraMax M2	Urządzenia molekularne
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 250 ml	Thermo Fisher Scientific	09-741-04
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną PES > 500 ml	Thermo Fisher Scientific	09-741-02
Superose 12 10/300 GL	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	17517301
TEMED	Amresco	0761-25ML
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
Typhoon 9410 w trybie zmiennym	GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086

Sól fizjologiczna Sześciowodny spektrofotometr , nośnik SOCKamera fluorescencyjna