Pomiary kamerowe wewnątrzkomórkowych [Na+] w mysich miocytach przedsionkowych

Podsumowanie

Wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺ ([Na⁺]_i) w miocytach serca ulega zmianie podczas chorób serca. [Nie ⁺]_i jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Wprowadzamy nowatorskie podejście do pomiaru [Na⁺]_i w świeżo wyizolowanych mysich miocytach przedsionkowych za pomocą kamery EMCCD (Electron Multipling Charged Coupled Device) i szybkiego, kontrolowanego iluminatora.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe stężenie sodu ([Na⁺]_i) jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego^Ca2+. Jego badania dostarczają informacji na temat aktywacji sarkolemmalnego wymiennika Na⁺/Ca²⁺, zachowania kanałów Na⁺ bramkowanych napięciem i ATPazy Na⁺,K⁺. Wewnątrzkomórkowa sygnalizacja Ca^{2 +} jest zmieniona w chorobach przedsionków, takich jak migotanie przedsionków. Chociaż scharakteryzowano wiele mechanizmów leżących u podstaw zmienionej wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca^{2 +}, rola [Na⁺]_i i jego rozregulowania w patologiach przedsionków jest słabo poznana. [Nie ⁺]_I w miocytach przedsionków zwiększa się w odpowiedzi na rosnące tempo stymulacji. Reagowanie na stymulację polem zewnętrznym ma zatem kluczowe znaczenie dla pomiarów [Na⁺]_i w tych komórkach. Ponadto długie przygotowanie (ładowanie barwnikiem) i czas trwania eksperymentu (kalibracja) wymagają protokołu izolacji, który daje miocyty przedsionkowe o wyjątkowej jakości. Ze względu na mały rozmiar przedsionków myszy i skład macierzy międzykomórkowej izolacja wysokiej jakości dorosłych mysich miocytów przedsionkowych jest trudna. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji oparty na perfuzji Langendorffa, który konsekwentnie zapewnia wysoką wydajność wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych.

Izoftalan benzoftalanu wiążący sód (SBFI) jest najczęściej używanym fluorescencyjnym wskaźnikiem Na⁺. SBFI może być ładowany do miocytów serca w postaci soli za pomocą szklanej pipety lub jako ester acetoksymetylowy (AM), który może przenikać przez błonę sarkolemmalną miocytu. Wewnątrzkomórkowo SBFI-AM jest deestryfikowany przez esterazy cytozolowe. Ze względu na zmienność penetracji błony i deestryfikacji cytozolu, każda komórka musi być kalibrowana in situ. Zazwyczaj pomiary [Na⁺]_i za pomocą epifluorescencji całych komórek SBFI są wykonywane przy użyciu rurki fotopowielacza (PMT). Ta eksperymentalna konfiguracja pozwala na pomiar tylko jednej komórki w tym samym czasie. Ze względu na długość ładowania barwnika miocytów i kalibrację po każdym eksperymencie, wydajność danych jest niska. W związku z tym opracowaliśmy technikę pomiaru [Na⁺]_i opartą na kamerze EMCCD. Takie podejście pozwala na jednoczesne pomiary [Na⁺]_i w wielu miocytach, co znacznie zwiększa wydajność eksperymentalną.

Wprowadzenie

W chorobach przedsionków (np. migotanie przedsionków [AF]) wewnątrzkomórkowa sygnalizacja Ca²⁺ jest głęboko zmieniona¹. Podczas gdy wiele mechanizmów leżących u podstaw "przebudowanej" wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ w AF zostało dobrze scharakteryzowanych^2,3, rola, jaką może odgrywać zmienione wewnątrzkomórkowe stężenie sodu ([Na⁺]_i) jest słabo poznana. [Nie ⁺]_i jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Badanie [Na⁺]_i może dostarczyć informacji na temat aktywacji sarkolemmalnego wymiennika Na⁺/Ca²⁺ (NCX), zachowania kanałów Na⁺ i Na⁺,K⁺-ATPazy (NKA)⁴. Wcześniej wykazaliśmy, że wysokie wskaźniki _aktywacji przedsionków, występujące podczas migotania przedsionków, prowadzą do znacznego zmniejszenia [Na⁺]i ¹. Wcześniejsze prace wykazały wzrost gęstości prądu NCX (I_NCX) i poziomów ekspresji białek w AF³. Odnotowano również wzrost późnej składowej zależnego od napięcia prądu Na⁺ (I_{Na, późny}) w izolowanych miocytach przedsionków od pacjentów z migotaniem przedsionków⁵. Tak więc istnieją dowody na głębokie zmiany w wewnątrzkomórkowej homeostazie Na⁺ w AF. Wiarygodne i powtarzalne pomiary [Na⁺]_i w izolowanych miocytach przedsionków są zatem potrzebne, aby lepiej zrozumieć patologię migotania przedsionków. W tym miejscu pokazujemy, jak w powtarzalny sposób wyizolować wysokiej jakości mysie miocyty przedsionkowe, które nadają się do pomiarów [Na⁺]_i. Skoncentrowaliśmy nasz zoptymalizowany protokół izolacji komórek przedsionków na mysich miocytach przedsionków, ponieważ transgeniczne (TG) mysie modele migotania przedsionków stały się istotną częścią badań nad migotaniem przedsionków⁶. Myszy te są często dostępne tylko w ograniczonej liczbie, a przedsionki są często zwłókniałe, co prowadzi do wyzwań związanych z izolacją komórek.

Ogólnie, [Na⁺]_i w żywotnych komórkach można mierzyć za pomocą wskaźników fluorescencyjnych^7,8, lub za pomocą różnych typów mikroelektrod⁹. Techniki oparte na mikroelektrodach wymagają penetracji błony sarkolemmalnej. Technika ta jest zatem ograniczona do większych komórek i nie jest odpowiednia dla małych i wąskich miocytów przedsionkowych, których integralność komórkowa jest łatwo zagrożona.

Izoftalan benzoftalanu wiążący sód (SBFI) jest wskaźnikiem fluorescencyjnym, który ulega dużemu przesunięciu długości fali po związaniu Na^{+ 7}. SBFI jest wzbudzany naprzemiennie przy długości fali 340 nm i 380 nm, a emitowana fluorescencja jest zbierana po przejściu przez filtr emisyjny (510 nm). Proporcje sygnałów na dwóch długościach fal wzbudzenia (F_340/380) mogą zniwelować lokalną długość ścieżki, stężenie barwnika i niezależne od długości fali zmiany intensywności oświetlenia i skuteczności wykrywania. Gdy w każdej komórce przeprowadza się kalibrację in situ przy użyciu roztworów o znanym stężeniu sodu ([Na⁺]), stosunek F_340/380 uzyskany podczas doświadczenia daje precyzyjne i czułe pomiary [Na⁺]_i. Podobnie jak wszystkie wskaźniki Na⁺, SBFI wykazuje również pewne powinowactwo do K⁺_. Zastosowanie przedstawionej tutaj metody kalibracji pozwala na niezawodne "zaciśnięcie" [Na⁺]_i i wewnątrzkomórkowego stężenia potasu ([K⁺]_i) podczas procesu kalibracji, dzięki czemu [Na⁺]_i może być niezawodnie skalibrowane nawet wtedy, gdy wynosi <10% [K⁺]_i ¹⁰.

Wprowadzamy nowatorską technikę opartą na kamerze EMCCD do pomiarów ratiometrycznych [Na⁺]_i za pomocą SBFI. Kamera EMCCD po raz pierwszy umożliwia jednoczesne pomiary [Na⁺]_i (i kalibrację) w wielu celach. Jest to szczególnie korzystne w warunkach eksperymentalnych, w których liczba zwierząt jest ograniczona (np. transgeniczne modele myszy). Zazwyczaj pomiary [Na⁺]_i przy użyciu SBFI są wykonywane przy użyciu lampy fotopowielacza (PMT) w celu zebrania epifluorescencji całych komórek^1,11. Podczas gdy PMT oferują bardzo dobrą rozdzielczość czasową sygnału fluorescencji, rozdzielczość przestrzenna jest bardzo niska, a eksperymenty są ograniczone do jednej komórki na raz.

Nasz nowatorski protokół umożliwia wysoce powtarzalne i czułe pomiary [Na⁺]_i. Jest zoptymalizowany pod kątem jednoczesnego nabywania zmian w [Na⁺]_i w wielu mysich miocytach przedsionkowych, ale można go dostosować do wielu innych typów komórek.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Maryland w Baltimore.

1. Izolacja miocytów przedsionkowych z dorosłych mysich serc

1. Umieść każdą mysz w precyzyjnym waporyzatorze i komorze indukcyjnej gazowanej izofluranem w 100% tlenie.
2. Ustawić przepływ izofluranu na 1% do momentu, gdy zwierzę przestanie reagować na leczenie, przed podaniem dootrzewnowego (IP) wstrzyknięcia heparyny (1–1,25 U/g) 15 minut przed eutanazją.
3. Głęboko znieczulij mysz, zwiększając znieczulenie izofluranem do 5% i potwierdź głęboką płaszczyznę znieczulenia przez uszczypnięcie stopy.
4. Wykonaj eutanazję, wykonując szybką torakotomię¹²; użyj standardowych kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć klatkę piersiową. Biernie zmobilizuj serce i płuco, odizoluj łuk aorty, przytrzymaj kleszczami i przetnij aortę, aby usunąć serce.
5. Umieść serce w lodowatym buforze do izolacji komórek nominalnie wolnym od Ca²⁺ (CIB, Tabela 1).
6. Kankaniuluj aortę za pomocą kaniuli 22 G i zawiąż za pomocą jedwabnego szwu pod mikroskopem świetlnym z 3-krotnym powiększeniem w roztworze CIB (Rysunek 1A,B).
7. Upewnij się, że kaniula znajduje się znacznie powyżej zatok aortalnych, podając roztwór CIB przez kaniulę podłączoną do strzykawki i potwierdź perfuzję tętnicy wieńcowej pod mikroskopem.
   UWAGA: Ten krok jest ważny, aby zapewnić prawidłową perfuzję tkanki przedsionkowej, ponieważ wykazano, że anatomia tętnicy wieńcowej jest bardzo zmienna u myszy¹³.
8. Zamontuj serce na grawitacyjnym zestawie Langendorffa i wykonuj perfuzję roztworem CIB wolnym od Ca^{2 +} przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby wypłukać pozostałą krew, aż eluat będzie klarowny (Rysunek 1C).
9. Przejść na roztwór enzymatyczny (Tabela 2) i stosować perfuzję przez 3–5 minut w temperaturze 37 °C, aż tkanka przedsionkowa stanie się miękka i wiotka.
10. Wyciąć prawy i lewy przedsionek za pomocą kleszczy o wysokim poziomie uchwytu i małych nożyczek sprężynowych i przenieść do małego naczynia hodowlanego zawierającego roztwór enzymatyczny CIB użyty w kroku 1.8, ale z 0,15 mM CaCl₂ i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5–8 minut (Rysunek 1D).
11. Przenieść przedsionki do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 4 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu do przechowywania (zmodyfikowany roztwór Tyrode'a (Tabela 3) zawierający 15 mM albuminy surowicy bydlęcej i 30 mM monoksymu 2,3-butanodionu).
12. Pokrój przedsionki na małe paski tkanek (10–20, w zależności od wielkości przedsionków) za pomocą małych nożyczek sprężynowych i kleszczy o wysokim chwycie.
13. W celu dysocjacji mechanicznej delikatnie zassać zawiesinę tkankową za pomocą różnych pipet Pasteura z polerowanego ogniowo szkła z otworami między 2–5 mm. Zacznij od największej końcówki pipety i przejdź do najmniejszej końcówki pipety, zasysając 5–10 razy na pipetę.
14. Przecedzić zawiesinę komórek przez filtr 200 μm i dodawać CaCl₂ trzy razy co 10 minut, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,3 mM.

2. Ocena jakości komórek

1. Umieścić 200 μl zawiesiny komórkowej zawierającej świeżo wyizolowane miocyty przedsionków na szklanym szkiełku nakrywkowym.
2. Użyj obiektywu 10x, aby policzyć wszystkie komórki w polu widzenia i skategoryzować je jako zaokrąglone lub w kształcie pręta. Określ, ile komórek w kształcie pręcików ma wyraźne prążki krzyżowe (przełącz na obiektyw 25x, jeśli jest to trudne do określenia, patrz Rysunek 2C).
3. Powtórz kroki 2.1–2.2.
4. Oblicz procenty zaokrąglonych, w kształcie pręta i pręta z wyraźnymi komórkami prążkowanymi krzyżowo.
5. Zmodyfikuj procedurę izolacji komórek, aż 80% komórek będzie miało kształt pręcika z wyraźnym prążkiem krzyżowym.
6. Umieścić 500 μl zawiesiny komórek przedsionkowych na szkiełku nakrywkowym pokrytym lamininą i umieścić komorę komórkową na odwróconym mikroskopie. Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut. Ukrwić roztworem Tyrode'a zawierającym 1,8 mM Ca²⁺.
7. Użyj systemu stymulatora komórek, aby rozpocząć stymulację polem elektrycznym (impuls bipolarny 2 ms, 30 V) przy 0,5 Hz i policz liczbę komórek, które kurczą się w polu widzenia obiektywu 10x.
8. Powtórzyć ze stymulacją polem zewnętrznym przy 3 Hz.
9. Oblicz procent komórek reagujących na stymulację 0,5 i 3 Hz (patrz Rysunek 2B). Udoskonal protokół izolacji komórek, aż 50% komórek zareaguje na stymulację polem 3 Hz.

3. Obciążenie wskaźnika Na⁺ świeżo wyizolowanych mysich miocytów przedsionkowych

1. Należy użyć przepuszczalnego dla komórki estru acetoksymetylowego (AM) fluorescencyjnego wskaźnika izoftalanu benzofuranu wiążącego sód (SBFI-AM).
2. Aby ułatwić dyspersję barwnika i uzyskać jednorodne obciążenie komórek, należy rozpuścić SBFI w dimetylosulfotlenku (DMSO) i odpowiednich poliolach powierzchniowo czynnych (np. pluronowych), aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM SBFI w zawiesinie komórki.
3. Załaduj ogniwa SBFI na 60 minut, chroniąc przed światłem na kołysku w temperaturze pokojowej.
4. Pozwól komórkom osiąść przez 30 minut, usuń supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze do przechowywania (1-2 ml).
   UWAGA: Eksperymenty należy przeprowadzić w ciągu 4 godzin od izolacji komórek. BDM jest wypłukiwany przez perfuzję roztworem Tyrode'a przed rozpoczęciem eksperymentów¹⁴.

4. Oprzyrządowanie, pomiary [Na⁺]_i i kalibracja [Na⁺]_i

UWAGA: Rysunek 3 przedstawia schemat ścieżki światła dla eksperymentalnego instrumentarium.

1. Przygotować roztwory kalibracyjne o rosnących stężeniach Na⁺, jak opisano w tabelach 4–6.
2. Do każdego roztworu kalibracyjnego dodać środek permeabilizujący gramicydynę D (10 μM; z roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °C) oraz inhibitor ATPazy Na⁺, K⁺ strofantydynę (100 μM, z roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °C). Dobrze odwiruj lub użyj sonikatora, aby upewnić się, że gramicidyna i strofantydyna są całkowicie rozpuszczone.
3. Napełnić wielobębnowy system perfuzyjny roztworami kalibracyjnymi zawierającymi zwiększające się [Na⁺]_o przygotowanymi w krokach 4.1 i 4.2. Podłącz do komory komórkowej przy użyciu niskich szybkości perfuzji (~ 1 ml / min; szybkość perfuzji może się różnić w zależności od objętości komory komórkowej).
4. Podłączyć ssanie do komory celi i zebrać perfuzat do odpowiedniego (szklanego) pojemnika na podłodze.
5. Zatrzymaj perfuzję i odsysanie.
6. Po 30 minutach deestryfikacji SBFI, umieść 100 μl skoncentrowanej (krok 3.5), obciążonej barwnikiem zawiesiny komórek na szkiełku nakrywkowym pokrytym lamininą powyżej pola widzenia obiektywu 40x mikroskopu odwróconego.
7. Użyj szybko przełączającego się iluminatora z ksenonowym źródłem światła o mocy 300 W. Uzyskanie obrazowania w szerokim polu widzenia dzięki dwóm długościom fali wzbudzenia (340 nm i 380 nm) przy użyciu szybko przełączających się luster skanujących i filtrów wzbudzenia o wąskim paśmie (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm).
8. Zoptymalizuj pole widzenia kamery EMCCD. Większy obszar obserwacji wymaga dłuższego czasu wyświetlania obrazu. Dłuższe czasy ramkowania prowadzą do większego wybielania wskaźnika. W ten sposób zrównoważ pole widzenia, rozmiar i czas klatek, aby nie doszło do zauważalnego wyblaknięcia sondy.
9. Określ, że w podzbiorze komórek przedsionkowych, które nie są obciążone SBFI, występuje tylko minimalna fluorescencja wewnętrzna, upewniając się, że wewnętrzna fluorescencja komórek jest podobna do fluorescencji tła (jak pokazano na Rysunek 4).
10. Określ odpowiednią częstotliwość próbkowania w zależności od projektu eksperymentalnego (częstotliwość próbkowania może być niska, ponieważ zmiany w [Na⁺]_i są stosunkowo powolne (np. jeden punkt danych pozyskiwany co 10–20 s).
11. Tłumienie światła wzbudzającego poprzez zastosowanie odpowiednich filtrów o neutralnej gęstości (ND) oraz poprzez odpowiednie zmniejszenie natężenia źródła światła (np. poprzez zmianę intensywności w oprogramowaniu operacyjnym).
12. Zebrać światło emisyjne o długości fali 510 ± 40 nm za pomocą odpowiednich filtrów za pomocą kamery EMCCD podłączonej do mikroskopu odwróconego.
13. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) dla każdej komórki i ROI w tle (patrz Rysunek 4). Odejmij tło od zarejestrowanych sygnałów F₃₄₀ i F₃₈₀ (w trybie online lub podczas analizy danych).
14. Rozpocznij pobieranie danych.
15. Uruchom ponownie perfuzję i odsysanie. Wykonuj fuzję przez 10-15 minut roztworem Tyrode'a zawierającym 1,8 mM Ca²⁺ i zapisz stabilną linię bazową F_340/380 przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Upewnij się, że rejestrujesz stabilną linię bazową przez 10–15 minut. Jeśli dojdzie do bielenia (np. zmniejszenie linii bazowej F_340/380), należy dążyć do dalszego tłumienia intensywności oświetlenia poprzez zwiększenie gęstości filtra ND, zmniejszenie intensywności sygnału światła wzbudzenia i/lub czas akwizycji (patrz kroki 4.10–4.11).
16. Rozpocznij pomiar [Na⁺]_i zgodnie z pytaniem badawczym.

5. [Na⁺]_Kalibracja

1. Po zakończeniu eksperymentu (krok 4.16) należy przeprowadzić kalibrację sygnału F_340/380 w każdej komórce in situ.
2. Skalibruj sygnał F_340/380 poprzez perfuzję miocytów obciążonych SBFI roztworami kalibracyjnymi (przygotowanymi w krokach 4.1–4.3).
3. Bezpiecznik stopniowy, aby podnieść [Na⁺]_o od 0 do 20 mM. Poczekaj na stabilny sygnał F_340/380 przed przejściem do następnego stężenia (~5 minut w zależności od natężenia przepływu; patrz Rysunek 3B i Rysunek 5A).
   UWAGA: Zależność między sygnałem F_340/380 a [Na⁺] roztworów kalibracyjnych musi być liniowa, aby zapewnić prawidłową kalibrację sygnału F_340/380 (Rysunek 5 i Rysunek 6).

Wyniki

Ocena jakości komórek przedsionkowych
Świeżo wyizolowane miocyty przedsionkowe oceniano pod kątem morfologii komórek oraz reaktywności na stymulację elektryczną, zgodnie z opisem w protokole, podczas sześciu kolejnych izolacji komórek przedsionkowych. Dane przedstawione na Rysunku 2 wykazują bardzo wysoki odsetek prętowatych miocytów przedsionkowych z zachowanymi wyraźnymi prążkami poprzecznymi. Podobnie, około 50% komórek przedsionkowych...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy nowatorską technikę opartą na kamerze EMCCD do jednoczesnego pomiaru ilościowego [Na⁺]_i w wielu żywotnych miocytach przedsionków przy użyciu izoftalanu benzofuranu wiążącego sód (SBFI). Opisane tutaj podejście jest pierwszym, które pozwala na jednoczesny pomiar [Na⁺]_i w wielu komórkach. Głównymi zaletami nowego protokołu są (i) znaczny wzrost wydajności eksperymentalnej oraz (ii) zmniejszenie intensywności i czasu trwania oświetlenia ze względu na wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monoksymus 2,3-butanodionu (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Filtr wzbudzenia	Chroma	ET40X	25 mm
380 Filtr wzbudzenia	Chroma	ET80X	25 mm
510	Filtr emisyjny Chroma	ET510/80m	25 mm
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Pułapka bąbelkowa	BD Medical Technologies	904477	Wykonane na zamówienie z 5 ml strzykawki Luer Lok, która znajduje się w ścieżce rurki od roztworu perfuzującego do roztworu kaniuli
CaCl2	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Wykonane na zamówienie z igły 22 G x 1/2 cala. Przyciąć do 1 cala i przeszlifować dystalną końcówkę 1 mm.
Komora			Wykonana na zamówienie z otworem, który może bezpiecznie utrzymać szklaną szkiełko pokrywy o średnicy 25 mm oraz z pokrywą z portem wlotowym i wylotowym do perfuzji.
Kąpiel z wodą obiegową	VWR
Collagenaza II	Worthington	LS004176	Specyficzna aktywność 290 U/g
Kreatynina	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus iluminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Kamera EMCCD	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Drobne nożyczki	Fine Science Tools	14060-10
Kleszcze Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Szkło Szkiełka nakrywkowe	VWR	4838089	koło 25 mm
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Wewnętrzna rurka silikonowa	VWR Rurki silikonowe marki VWR
Mikroskop odwrócony	Instrumenty Nikon Narzędzia
Glukonian	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4 Aparat
Langendorff
	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	>0,5-2,0 mg/ml
Przewód zewnętrzny	VWR
Petriego 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Proteaza XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Szew jedwabny	Fine Science Tools	18020-50	Średnica 0,12 mm
Małe nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15000-03
Kleszcze o standardowym wzorze	Narzędzia do nauki o narodzinach	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Kleszcze do wiązania szwów	Narzędzia do nauki	00272-13
Tauryna	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Filtr odblaskowy 0,1 ND	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Odblaskowy filtr 0,2 ND Filtr		NDUV02B	25 mm
UVFS Odblaskowy 0,3 ND	Thorlabs
	NDUV03B 25 mm UVFS Odblaskowy filtr 0,5 ND	NDUV05B	25 mm
Filtr odblaskowy UVFS 1 ND NDUV010B			25 mm

komórkowa VWRselect izolacyjne NikonTE 2000 U K perfuzyjny Calbiochem 529568 MgCl2.6H2O *Sigma-Aldrich M0250 Stymulator komórek MyoPacer IonOptix Na Glukonian szalka Nożyczki chirurgiczne o narodzinach