Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59609

⸱

10 lipca 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Streszczenie

Spektroskopia sił pojedynczych komórek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM-SCFS) jest potężnym narzędziem do badania właściwości biofizycznych żywych komórek. Technika ta pozwala na badanie siły i dynamiki interakcji na żywej błonie komórkowej, w tym między komórkami, receptorem i ligandami, a także wielu innych wariantów. Działa również jako mechanizm dostarczania fizycznego lub biochemicznego bodźca do pojedynczych komórek w sposób kontrolowany czasowo, umożliwiając w ten sposób monitorowanie określonej aktywacji komórek i późniejszych zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek. Kluczowym krokiem w tych pomiarach AFM-SCFS jest funkcjonalizacja wspornika AFM, czyli innymi słowy, przymocowanie interesującego obiektu do wspornika. W tym miejscu przedstawiamy metody modyfikacji wsporników AFM za pomocą pojedynczej limfocytu T i pojedynczego kulki polistyrenowej odpowiednio do badań immunologicznych. Pierwsza z nich obejmuje biokompatybilny klej, który łączy pojedyncze limfocyty T z końcówką płaskiego wspornika w roztworze, podczas gdy druga opiera się na kleju epoksydowym do przyczepności pojedynczej kulki w środowisku powietrznym. Dostępne są również dwie aplikacje immunologiczne związane z każdą modyfikacją wspornika. Opisane tutaj metody można łatwo dostosować do różnych typów komórek i cząstek stałych.

Wprowadzenie

Mikroskopia sił atomowych (AFM), wszechstronne narzędzie, znalazło wiele zastosowań w badaniach biologii komórki1,2,3,4,5. Oprócz możliwości obrazowania w wysokiej rozdzielczości, natywna funkcja sondowania siły umożliwia badanie właściwości biofizycznych żywych komórek bezpośrednio in situ na poziomie pojedynczej komórki6,7. Należą do nich sztywność struktur subkomórkowych, a nawet całych komórek8,9,10,11,12, specyficzne siły wiązania liganda/receptora na poziomie pojedynczej cząsteczki na powierzchni komórki13 oraz siły adhezji między pojedynczymi parami cząstek stałych i komórek lub między dwiema komórkami1,2,14,15. Te dwie ostatnie są często klasyfikowane jako spektroskopia sił jednokomórkowych (SCFS)16. Dzięki łatwo dostępnym wspornikom o różnej stałej sprężystości, zakres sił dostępny dla AFM jest dość szeroki od kilku pikonewtonów (pN) do mikroniutonów (μN), co odpowiednio pokrywa cały zakres zdarzeń komórkowych obejmujących siły od kilkudziesięciu pN, takich jak wiązanie pojedynczej cząsteczki na podstawie receptora, do nN, takich jak fagocytarne zdarzenia komórkowe15. Ten duży zakres siły dynamicznej sprawia, że AFM ma przewagę nad innymi technikami sondowania siły, takimi jak pęseta optyczna/magnetyczna i sonda siły biomembranowej, ponieważ są one bardziej odpowiednie do pomiarów słabej siły, przy sile zwykle mniejszej niż 200 pN17,18. Ponadto AFM może funkcjonować jako wysoce precyzyjny manipulator do dostarczania różnych bodźców do pojedynczych komórek w sposób zdefiniowany czasoprzestrzennie4,19. Jest to pożądane w przypadku badań aktywacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. W połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek, późniejsza odpowiedź komórkowa na określony bodziec może być monitorowana jednocześnie, co sprawia, że SCFS oparty na AFM jest niezwykle wytrzymały jako obrazowanie optyczne, zapewniając praktyczne narzędzie do badania sygnalizacji komórkowej. Na przykład, AFM został wykorzystany do określenia szczepów wymaganych do wywołania stanów przejściowych wapnia w osteoblastach20. W tej pracy stany przejściowe wapnia śledzono fluorescencyjnie za pomocą obrazowania ratiometrycznego wapnia po zastosowaniu miejscowych sił na hodowane osteoblasty z końcówką AFM. Ostatnio AFM został wykorzystany do rozciągania włókien kolagenowych, na których rosły komórki gwiaździste wątroby (HSC), a ta mechanicznie transdukowana aktywacja HSC była monitorowana w czasie rzeczywistym przez fluorescencyjny bioczujnik Src, którego fosforylacja reprezentowana przez intensywność fluorescencji bioczujnika jest skorelowana z aktywacją HSC3.

W eksperymentach SCFS opartych na AFM, właściwa funkcjonalizacja wsporników AFM jest kluczowym krokiem w kierunku udanych pomiarów. Ponieważ nasze zainteresowania badawcze koncentrują się na aktywacji komórek odpornościowych, rutynowo funkcjonalizujemy wsporniki cząstkami stałymi, takimi jak pojedyncze cząstki stałe, które mogą wywołać fagocytozę i/lub silne odpowiedzi immunologiczne4,14,15 oraz pojedyncze limfocyty T, które mogą tworzyć synapsę immunologiczną z komórkami prezentującymi antygen, takie jak aktywowane komórki dendrytyczne (DC)2. Pojedyncze cząstki stałe są zwykle sprzężone z wspornikiem za pomocą kleju epoksydowego w środowisku powietrznym, podczas gdy pojedyncze limfocyty T, ze względu na ich nieadhezyjny charakter, są funkcjonalizowane do wspornika za pomocą biokompatybilnego kleju w roztworze. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania tych dwóch rodzajów modyfikacji wsporników i podajemy również dwa powiązane zastosowania. Pierwszym zastosowaniem jest zbadanie interakcji limfocytów T/DC z AFM-SCFS w celu zrozumienia mechanizmu supresyjnego regulatorowych limfocytów T z punktu widzenia mechaniki komórki. Drugi polega na połączeniu AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek w celu monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów na cząstkę stałą w czasie rzeczywistym, aby ujawnić mechanizm molekularny niezależnej od receptora fagocytozy za pośrednictwem fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP2)-mezyny. Celem tego protokołu jest zapewnienie ram odniesienia dla zainteresowanych badaczy w celu zaprojektowania i wdrożenia własnych warunków eksperymentalnych z analizą pojedynczych komórek opartą na AFM do badań immunologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół eksperymentu na myszach jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Tsinghua

1. Funkcjonalizacja wspornika pojedynczymi limfocytami T

  1. Przygotowanie komórek śledziony myszy
    1. Uśmierć mysz (wiek 8-16 tygodni (obie płcie); np. szczep C57BL/6) przy użyciu dwutlenku węgla, a następnie wykonaj zwichnięcie szyi.
    2. Oczyść mysz 75% etanolem i wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej, a następnie przeprowadź splenektomię.
    3. Zhomogenizuj śledzionę w 4 mL PBS zawierającego 2% surowicy płodowej cieląt (FBS) za pomocą szkiełek podstawnych i usuń agregaty oraz zanieczyszczenia, przepuszczając zawiesinę komórkową przez nylonowy sitko o rozmiarze oczek 70 μm.
    4. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 5 min, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 2 mL buforu do lizy czerwonych krwinek (zrównoważonego w temperaturze pokojowej) przez 5 min. Przerwij reakcję lizy, dodając 8 mL roztworu PBS.
    5. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 5 min i resuspenduj komórki w PBS zawierającym 2% FBS i 1 mM EDTA (oznaczonym jako Roztwór A) do gęstości 1 x 108 komórek/mL, zazwyczaj od 0,25 do 2 mL w zależności od gęstości komórek. Przenieś resuspendowane komórki do polistyrenowej probówki o dnie okrągłym o pojemności 5 mL (12 x 75 mm).
  2. Przygotowanie limfocytów T CD4+ myszy
    1. Do próbki komórek uzyskanej w kroku 1.1.5 dodaj 50 μL/mL surowicy szczurzej (patrz Tabela materiałów) oraz 50 μL/mL koktajlu do izolacji limfocytów T CD4+ (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    2. Wymieszaj na wortexie zapasowy roztwór cząsteczek magnetycznych powlekanych streptawidyną (patrz Tabela materiałów) przez 30 s lub do momentu, gdy cząsteczki wydadzą się równomiernie rozproszone.
    3. Dodaj 75 μL/mL cząsteczek magnetycznych powlekanych streptawidyną do próbki komórek. Wymieszaj i inkubuj przez 2,5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj Roztwór A, aby dopełnić próbkę komórek do 2,5 mL i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
    5. Umieść probówkę z próbką (bez nakrętki) w magnesie (patrz Tabela materiałów) i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przelej wzbogaconą zawiesinę komórkową do nowej polistyrenowej probówki o dnie okrągłym o pojemności 5 mL.
    6. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 500 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspenduj wzbogacone limfocyty T w 50 μL Roztworu A.
      UWAGA: Wzbogacone limfocyty T CD4+ zawierają zarówno konwencjonalne, jak i regulatorowe limfocyty T.
  3. Separacja regulatorowych limfocytów T od konwencjonalnych limfocytów T
    1. Do wzbogaconej próbki limfocytów T uzyskanej w kroku 1.2.6 dodaj 25 µL blokera FcR (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Do próbki limfocytów T dodaj 25 μL koktajlu do selekcji pozytywnej regulatorowych limfocytów T (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    3. Do próbki limfocytów T dodaj 10 μL koktajlu selekcyjnego PE (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Wymieszaj na wortexie zapasowy roztwór cząsteczek magnetycznych powlekanych dekstranem (patrz Tabela materiałów) przez 30 s lub do momentu, gdy cząsteczki wydadzą się równomiernie rozproszone.
    5. Dodaj 10 μL cząsteczek magnetycznych powlekanych dekstranem do próbki limfocytów T. Wymieszaj i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj Roztwór A, aby dopełnić próbkę limfocytów T do 2,5 mL i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
    7. Umieść probówkę z próbką limfocytów T (bez nakrętki) w magnesie i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przelej nadsącz do nowej probówki.
      UWAGA: Nadsącz zawiera wzbogacone konwencjonalne limfocyty T CD4+.
    8. Odwiruj wzbogacone konwencjonalne limfocyty T CD4+ przy 50 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 4 mL RPMI1640 zawierającego 10% FBS, 0,05 mM β-merkaptoetanolu, 0,01 M HEPES i 1% penicyliny/streptomycyny (oznaczonego jako Medium B).
    9. Wyjmij z magnesu probówkę, w której wzbogacono regulatorowe limfocyty T. Dodaj do niej 2,5 mL Roztworu A i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Włóż probówkę z powrotem do magnesu, inkubuj przez 5 min, a następnie ostrożnie zlej i odrzuć nadsącz. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.
    10. Resuspenduj wzbogacone regulatorowe limfocyty T w 2 mL Medium B.
    11. Inkubuj zarówno oczyszczone konwencjonalne limfocyty T, jak i regulatorowe limfocyty T z 10 U/mL hIL-2 przez noc lub przez co najmniej 4 h w 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przed użyciem do funkcjonalizacji wsporników.
  4. Przygotowanie komórek dendrytycznych
    1. Przygotuj roztwór piranha, mieszaninę 30% H2O2 (30%) i 70% H2SO4 (stężony) (v/v). Powoli wlej 3 mL H2O2 do 7 mL H2SO4 przy ciągłym mieszaniu i chłodzeniu.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór piranha jest silnie żrący i może powodować oparzenia oraz niszczyć tkanki ciała. Dlatego bezpieczniej jest używać roztworu piranha pod wyciągiem i nosić odpowiedni sprzęt ochronny, ponieważ mieszanina może rozpryskiwać się wokół zlewki. Po użyciu zneutralizuj roztwór NaOH do pH 7.
    2. Zanurz szklaną lamellkę o średnicy 24 mm w roztworze piranha na 30 min, a następnie dokładnie wypłucz sterylną wodą ultrapure.
    3. Zanurz parę ostrych pęset w 75% etanolu na 30 min w celu zimnej dezynfekcji.
    4. Za pomocą pęsety wprowadź oczyszczone szklane lamellki do 6-dołkowej płytki hodowlanej.
    5. Przechyl plastikową szalkę hodowlaną o średnicy 6 cm, w której uprawiano komórki DC2.4, z 4 mL Medium B i odessij całe medium. Dodaj 2 mL PBS do szalki hodowlanej, aby wypłukać komórki DC2.4, a następnie odlej PBS. Powtórz ten etap płukania jeszcze dwa razy.
    6. Dodaj 1 mL 0,25% trypsyny z EDTA do szalki hodowlanej na 2 min. Dodaj 1 mL Medium B do szalki, aby zakończyć reakcję trawienia enzymatycznego. Przenieś strawioną zawiesinę komórkową do probówki 15 mL.
    7. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 5 min i resuspenduj komórki DC2.4 do gęstości 2 x 105 komórek/mL w Medium B.
    8. Wysiej komórki DC2.4 na szklanych lamellkach przygotowanych w kroku 1.4.4 i inkubuj komórki przez noc w wilgotnej komorze w 37 °C z 5% CO2.
      UWAGA: Aby zmierzyć siły oddziaływania między dwiema pojedynczymi komórkami, konieczne jest zastosowanie stosunkowo niskiego stężenia komórek DC2.4 (tj. <10% konfluencji), aby zapewnić odpowiednie odstępy między komórkami.
  5. Przygotowanie wspornika AFM
    UWAGA: Wsporniki odpowiednie do eksperymentów spektroskopii sił pojedynczych komórek to takie z niskimi stałymi sprężystości, zazwyczaj w zakresie 0,01-0,06 N/m. W tym przypadku do funkcjonalizacji pojedynczych komórek i pojedynczych cząstek stałych preferowane są miękkie wsporniki bez końcówki.
    1. Oczyść wsporniki poprzez traktowanie roztworem piranha, plazmą lub czyszczenie UV-ozonem.
    2. Zamontuj oczyszczony wspornik w głowicy skanującej AFM.
    3. Przygotuj czystą komorę z próbką wypełnioną czystą wodą i skalibruj wspornik w roztworze wodnym, najpierw wykonując krzywą siły na szklanym podłożu w celu uzyskania czułości (nachylenie dopasowania liniowego w części odpychającej krzywej zbliżania), a następnie rejestrując widmo szumu termicznego, aby wyznaczyć stałą sprężystości zgodnie z instrukcją obsługi AFM.
    4. Wyjmij głowicę skanującą AFM z roztworu, umyj zamontowany wspornik kilkoma kroplami czystego etanolu i pozostaw wspornik suchy na głowicy skanującej.
  6. Przytwierdzanie pojedynczych limfocytów T do wspornika
    1. Wstępnie podgrzej obudowę środowiska dla żywych komórek z 5% CO2 do 37 °C.
    2. Zamontuj szklaną lamellkę z wyhodowanymi na niej komórkami DC2.4 z kroku 1.4.8 w zestawie komory z próbką, natychmiast dodaj do komory 60 µL Medium B, a następnie umieść zestaw na stole próbkowym AFM.
    3. Dodaj inkubowane z hIL-2 limfocyty T CD4+ (konwencjonalne lub regulatorowe) do komory z próbką.
      UWAGA: Całkowita objętość próbki nie powinna przekraczać 1 mL.
    4. Odczekaj, aż dodane limfocyty T CD4+ całkowicie opadną na dno lamellki.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza będą powodować duże zakłócenia w eksperymencie, dlatego zaleca się unikania jakichkolwiek pęcherzyków powietrza w krokach 1.6.2 i 1.6.3.
    5. Dodaj kroplę 2 μL biokompatybilnego kleju na koniec zamontowanego wspornika za pomocą pipety, jak pokazano na Rysunku 1, a następnie szybko umieść głowicę skanującą na stole z próbką, pozwalając, aby wspornik pokryty biokompatybilnym klejem zanurzył się w roztworze.
      OSTRZEŻENIE: Nie dotykaj blokiem szklanym ani wspornikiem końcówki pipety. Ponieważ użyty tutaj biokompatybilny klej jest podatny na utlenianie w powietrzu, ten krok należy wykonać jak najszybciej.
    6. Zlokalizuj zdrowy limfocyt T pod końcówką wspornika w sposób przybliżony pod mikroskopem, przesuwając stół z próbką, a następnie precyzyjnie dostosuj pozycjonowanie, przesuwając głowicę skanującą.
      UWAGA: Zdrowy limfocyt T CD4+ zazwyczaj ma stosunkowo duży rozmiar, gładkie krawędzie i jest optycznie przepuszczalny w obrazowaniu w jasnym polu.
    7. Obniżaj wspornik ręcznie z krokami zaczynając od 50 μm, a następnie stopniowo 10, 5, 2 i 0,5 μm, sterując silnikami krokowymi. Zablokuj pozycję silników krokowych i dostosuj pozycjonowanie głowicy skanującej dla lepszego wyrównania między końcówką wspornika a komórką, gdy wspornik nawiąże trwały kontakt z docelowym limfocytem T, co objawi się niewielkim przesunięciem pozycji wiązki laserowej w fotodetektorze, odpowiadającym typowemu zakresowi sił 0,5-1,5 nN.
      UWAGA: Ten krok można również wykonać poprzez uruchomienie pojedynczego pomiaru siły, w którym punkt nastawczy (siła przyłożona do komórki) i czas kontaktu mogą być dokładnie zdefiniowane w oprogramowaniu. Jednak ze względu na nieprzylepną naturę limfocytów T, podejście ręczne zapewnia większą elastyczność w kontrolowaniu celowania, pozycjonowania i czasu kontaktu niż automatyczne zbliżanie i działa niezawodnie dla adhezji limfocytów T. Przyszli eksperymentatorzy powinni wypróbować zarówno zbliżanie ręczne, jak i automatyczne, aby sprawdzić, które lepiej sprawdza się w ich systemach badawczych.
    8. Cofnij wspornik po 30 s kontaktu.
      UWAGA: Jeśli komórka porusza się wraz ze wspornikiem, przytwierdzenie zakończyło się sukcesem. Jeśli nie, powtórz krok 1.6.6, ale na innym limfocycie T. Biokompatybilny klej łatwo utlenia się. Kroki 1.6.5-1.6.7 powinny zostać ukończone w ciągu 5 min. Ponadto, jeśli ten sam wspornik zawiedzie trzy razy przy próbie przytwierdzenia limfocytu T, należy użyć nowego wspornika i ponownie rozpocząć procedurę przytwierdzania od Kroku 1.5.2.

Schemat przygotowania biokompatyjnego kleju; końcówka pipety i sprężyna na bloczku szklanym w celu precyzyjnej aplikacji.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie nakładania małej kropli biokompatybilnego kleju na zamocowany wspornik. Dźwignia jest zamocowana za pomocą sprężyny zaciskowej do uchwytu z bloku szklanego, który jest zainstalowany na głowicy skanującej AFM (nie przedstawiono tutaj). Gdy głowica skanująca spoczywa na wypoziomowanej powierzchni, dźwignia jest zorientowana pionowo, jak pokazano na rysunku. Około 2 µL biokompatybilny klej można nanieść na końcówkę wspornika za pomocą mikropipety. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Spektroskopia sił pojedynczych interakcji limfocytów T z komórkami dendrytycznymi
    UWAGA: Aby badać interakcje komórka-komórka, wymagany jest AFM z zakresem Z większym niż konwencjonalne 10-15 μm, aby w pełni oddzielić obie komórki. AFM użyty w tej procedurze posiada zakres Z wynoszący 10 μm, co jest wystarczające do oddzielenia limfocytu T od komórki dendrytycznej po kontakcie między komórkami.
    1. Ustaw przymocowany limfocyt T nad oddzielną komórką DC2.4, przesuwając stolik z próbką i/lub głowicę skanującą (patrz Rysunek 2).
    2. Ustaw odpowiednie parametry i przeprowadź spektroskopię sił.
      UWAGA: Typowo stosuje się następujące kluczowe ustawienia: Setpoint 0,5 nN, Pulling Length 50 μm, Z movement Constant Speed, Extend Speed 5 μm/s, Contact Time 10 s, Delay Mode Constant Force. Dla każdej pary T-DC zbieranych jest 20 powtórzeń krzywych siły, a do dalszej analizy wykorzystuje się minimum 14 krzywych siły.
    3. Zamontuj nową, oczyszczoną dźwignię (cantilever), skalibruj ją w czystej wodzie zgodnie z krokiem 1.5.3, a następnie wróć do tej samej próbki komórek T-DC, aby powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 dla innej pary T-DC. Przebadaj co najmniej 5 par dla każdego stanu doświadczalnego.

Doświadczenie z klejem biokompatybilnym; schemat i obraz mikroskopowy adhezji tkanki (T) do DC.
Rycina 2: Konfiguracja eksperymentalna pomiaru siły między pojedynczą limfocytem T a komórką dendrytyczną. (A) Schematyczny rysunek konfiguracji doświadczalnej, w której limfocyt T przytwierdzony do wspornika jest zbliżany do komórki dendrytycznej (DC) wyhodowanej na podłożu w celu pomiaru sił. (B) Obraz w jasnym polu kantylewera z funkcjonalizacją limfocytem T oraz komórką dendrytyczną. Pasek skali, 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Funkcjonalizacja wspornika pojedynczymi kuleczkami polistyrenowymi

  1. Przygotowanie pojedynczych kulek
    1. Rozcieńczyć zawiesinę stokową kulek polistyrenowych o średnicy 6 μm w 10% etanolu.
      UWAGA: Stężenie rozcieńczonego roztworu kulek powinno być na tyle niskie, aby po naniesieniu na powierzchnię szklanego szkiełka nakrywkowego poszczególne kulki były dobrze odseparowane, bez znacznego skupiania się po odparowaniu rozpuszczalnika.
    2. Oczyścić szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 24 mm etanolem i usunąć kurz za pomocą strumienia powietrza N2.
    3. Zamocować oczyszczone szkiełko nakrywkowe w zgromadzeniu komory próbki i umieścić zgromadzenie w mikroskopie.
    4. Nanieść kroplę rozcieńczonego roztworu kulek po lewej stronie, ale blisko środka szkiełka nakrywkowego (patrz Rycina 3) i sprawdzić odstępy między kulkami po odparowaniu rozpuszczalnika w świetle przechodzącym pod mikroskopem z użyciem obiektywu 20x. Przejść do następnego kroku, jeśli poszczególne kulki są dobrze odseparowane.
    5. Zanurzyć końcówkę mikropipety lub wykałaczkę w dobrze wymieszanym kleju epoksydowym, a następnie przenieść niewielką ilość kleju w trzy oddzielne miejsca za pomocą kolejnych delikatnych dotknięć po prawej stronie, ale blisko środka szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Trzy plamki kleju powinny być wyrównane w pionie (patrz Rycina 3). Ostatnia plamka z najmniejszą ilością kleju zostanie wykorzystana później.

Schemat manipulacji koralikami; ruch końcówki w przód i w tył; proces powiększania warstwy epoksydowej.
Rysunek 3: Schematyczny przedstawienie przebiegu procesu funkcjonalizacji pojedynczych kulek na wsporniku. Po lewej stronie podłoża przygotowuje się dobrze oddzielone od siebie kulek o rozmiarach mikrometrycznych, natomiast na prawą stronę podłoża nanosi się niewielką ilość kleju epoksydowego poprzez trzy kolejne delikatne dotknięcia, co pozwala uzyskać trzy punkty z klejem. Do pokrycia samego końca wspornika wykorzystuje się tylko ostatni punkt z najmniejszą ilością kleju (oznaczony okręgiem). Należy zbliżyć wspornik do kleju od lewej strony, a następnie, po zanurzeniu go w kleju, przesunąć wspornik do tyłu, aby ograniczyć ilość kleju do samego końca wspornika. Następnie pod wspornikiem należy umieścić docelową kuleczkę i odpowiednio je wyrównać przed wykonaniem silnego kontaktu (zazwyczaj 2–5 nN) w celu adhezji kuleczki. Po pomyślnym funkcjonalizowaniu wspornika kuleczką można zamontować nowy wspornik, aby rozpocząć kolejny cykl funkcjonalizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Przygotowanie wspornika AFM
    1. Zamocuj oczyszczony wspornik bez końcówki do głowicy skanującej AFM.
    2. Skalibruj ten wspornik w powietrzu na czystej powierzchni, aby wyznaczyć stałą sprężystości.
  2. Mocowanie pojedynczych kulek do wspornika
    1. Ustaw końcówkę wspornika nad lewą krawędzią ostatniego punktu z klejem epoksydowym, zgodnie z Rysunkiem 3.
    2. Powoli zbliż wspornik do kleju, obniżając silniki krokowe małymi krokami.
    3. Szybko odsuń wspornik od kleju w kierunku bocznym, przesuwając ręcznie głowicę skanującą AFM do tyłu (w lewo), gdy końcówka zostanie zanurzona w kleju.
      UWAGA: Upewnij się, że tylko niewielka ilość kleju przylega do samego końca końcówki. Jeśli na końcówce znajduje się zbyt dużo kleju, można zmniejszyć jego ilość poprzez dotknięcie, a następnie przesunięcie końcówki po pustej powierzchni.
    4. Przesuń końcówkę wspornika nad dobrze odizolowaną pojedynczą kulką.
    5. Powoli zbliż wspornik do pojedynczej kulki i nawiąż z nią trwały kontakt (wskaźnikiem jest przesunięcie pozycji wiązki lasera w fotodetektorze odpowiadające typowemu zakresowi siły 2-5 nN) przez około 10 s, podczas czego precyzyjna regulacja boczna pozycji końcówki pomoże lepiej zlokalizować kulkę na samym końcu końcówki. Na koniec kontaktu wycofaj końcówkę.
      UWAGA: Zniknięcie samej kulki z oryginalnej płaszczyzny ogniskowania świadczy o pomyślnym przyczepieniu.
    6. Ostrożnie zdemontuj zmodyfikowany wspornik z kulką i przechowuj go w pudełku na wsporniki przez noc w celu pełnego utwardzenia kleju.
  3. Obrazowanie fluorescencyjne odpowiedzi komórkowej makrofagów na pojedynczą kulkę dostarczoną za pomocą AFM.
    UWAGA: Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono na wykonanym domowym sposobem mikroskopie fluorescencyjnym z całkownym wewnętrznym odbiciem typu obiektywowego, opartym na komercyjnym statywie mikroskopowym. System obrazowania ten jest wyposażony w 4 źródła laserowe (405 nm, 48 nm, 561 nm, 647 nm), dzielnik do detekcji dwukolorowej oraz urządzenie ładunkowo-sprzężone z mnożeniem elektronów (EMCCD) do obrazowania szerokopolowego.
    1. Hoduj komórki RAW264.7 na szklanej lamelce w temperaturze 37 °C w komorze z nawilżeniem i 5% CO2.
    2. Wykonaj transfekcję Moesin-EGFP i PLCδ-PH-mCherry do komórek RAW264.7 przy użyciu zestawu do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta, aby odpowiednio wizualizować fluorescencyjnie cząsteczki Moesiny oraz fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP2).
      UWAGA: Moesina posiada motyw ITAM, który może aktywować białko Syk, kluczowy element fagocytozy. Znane jest, że PIP2 rekrutuje Moesinę do błony komórkowej.
    3. Umieść szklaną lamelkę z komórkami w module komory próbkowania i zamocuj moduł na stole próbek AFM.
    4. Zamocuj zmodyfikowany wspornik z kulką do głowicy skanującej AFM.
    5. Wykonaj krzywą siły w pustym obszarze i skalibruj siłę, wykorzystując czułość z tej krzywej oraz stałą sprężystości zmierzoną w kroku 2.2.2.
    6. Znajdź dobrze odizolowaną komórkę o odpowiedniej intensywności fluorescencji w kanałach zielonym (Moesin-EGFP) i czerwonym (PLCδ-PH-mCherry) przy wzbudzeniu 48/561 nm.
    7. Dostarcz niepowlekaną kulkę polistyrenową o średnicy 6 μm do powierzchni komórki za pomocą AFM z zastosowaniem stałej siły 1 nN i czasu kontaktu 50 s.
    8. Nagraj serię obrazów fluorescencyjnych komórki w kontakcie z kulką do analizy (zazwyczaj 10 klatek/s).
      UWAGA: Aby ograniczyć fotoblaknięcie fluoroforów, do poszukiwania interesujących komórek należy używać stosunkowo niskiej mocy wzbudzenia. Dodatkowo, w przypadku powolnej dynamiki odpowiedzi komórkowych, można zastosować schemat wzbudzenia przerywanego, aby wydłużyć ślady czasowe fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4A przedstawia typowe krzywe siła-odległość wynikające z interakcji wiązania między pojedynczym limfocytem T a pojedynczą komórką dendrytyczną (DC) w jednym cyklu zbliżania i wycofywania. Jasnoczerwona krzywa to krzywa rozciągania, a ciemnoczerwona to krzywa wycofywania. Ponieważ krzywa rozciągania jest zazwyczaj wykorzystywana do analizy wgłębienia lub sztywności, w tym przypadku w analizie adhezji komórkowej uwzględniono jedynie krzywą wycofywania. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia sił pojedynczych komórek oparta na AFM ewoluowała, aby stać się potężnym narzędziem do badania właściwości biofizycznych żywych komórek. W przypadku tych zastosowań wspornik musi być odpowiednio funkcjonalizowany, aby móc badać określone interakcje lub właściwości na interesujących komórkach. W tym miejscu opisano odpowiednio metody sprzęgania pojedynczej komórki T i pojedynczego mikronu kulki z wspornikiem bez końcówki. Aby przymocować pojedynczą komórkę T do wspornika, jako klej komórkowy wybrano biokompa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) oraz Innovative Research Group Program (81621002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
10 μ l końcówka do pipetThermo Fisher104-Q
Rurka 15 mlCorning430791
Naczynie hodowlane o średnicy 6 cmNALGENE nunc150462
6-dołkowa płytka hodowlanaJETTCP011006
AFM CantileverNanoWorldArrow-TL1-50bez końcówki
β-MerkaptoetanolSigma7604
Biokompatybilny klejBD Cell-Tak354240
CD4+ Izolacja limfocytów T KoktajlSTEMCELL19852C.1
Linia komórkowa DC2.4Prezent od K. Rocka (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Cząstki magnetyczne pokryte dekstranemSTEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
EpoksydERGO7100
Etanoltwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR blokerSTEMCELL18731
Szklane szkiełko nakrywkowelokalny sprzedawca (Hai Men Lian Sheng)HX-E37Średnica 24 mm, grubość 0,17 mm
SzkiełkapodstawoweJinTong dział zarządzania laboratorium i sprzętem, Haimen Niedotyczy dostosowane
H2O2 (30%)Sino pharm10011218
H2SO4Sino pharm80120892
HEPESSigma51558
MagnesSTEMCELL18000
Sitko siatkowenylonowe BD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/Asklonowany w laboratorium
Mysz CD25 Zestaw do pozytywnej izolacji komórek TregSTEMCELL18782Składnik: Bloker FcR, koktajl pozytywnej selekcji regulatorowych komórek T, koktajl wyboru PE, Dekstran RapidSpheres,
mysz CD4+ Zestaw do izolacji komórek TSTEMCELL19852Składnik: Koktajl do izolacji komórek T CD4 +, Streptawidyna RapidSpheres, Serum szczurze
NaOHLanyi produkty chemiczne co., LTD? Pekin1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
Koktajl selekcyjny PESTEMCELL18151
Hyklon penicyliny-streptomycynySV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
Mikrosfery polistyrenowe 6,0μ mPolysciences07312-5
polistyrenowa rura z okrągłym dnemBD Falcon352054
Serum dla szczurówSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
Rekombinowana ludzka interleukina-2PeprotechPeprotech, 200-02-1000
Bufor do lizy czerwonych krwinekBeyotimeC3702
Regulatorowy koktajl pozytywnej selekcji limfocytów TSTEMCELL18782C
RPMI 1640ŻycieC11875500BT
Komora na próbkidomowej roboty
Cząstki magnetyczne pokryte streptawidynąSTEMCELL50001
Zestaw do transfekcjiClontech631318
Trypsin 0,25% EDTALife25200114
PęsetaJDN/A
NazwaFirmaNumer katalogowy< strong>Komentarze
Sprzęt
20x obiektyw NA 0.8Zeiss420650-9901Planapochromatyczny
mikroskop sił atomowychKomórka JPKHesion200
WirówkaBeckman redlicaAllegra X-12R
Obrazowaniefluorescencyjnedomowy obiektywowy mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem oparty na statywie
Nawilżony inkubator CO2Thermo FisherHERACELL 150i
Mikroskop światła odwróconegoZeissObserver A1
wspornik mikroskopowym Zeiss Instrukcja obsługi

Bibliografia

  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
  3. Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
  4. Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
  5. Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
  6. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
  7. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
  8. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
  9. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  10. Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
  11. Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
  12. Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
  13. Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
  14. Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
  15. Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
  16. Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
  17. Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
  18. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  19. Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
  20. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  21. Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
  22. Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
  23. Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
  24. Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
  25. Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
  26. Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
  27. Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
  28. Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
  29. Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  30. Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia si atomowychfunkcjonalizacja wspornika AFMadhezja limfocyt w Tprzy czanie kulek polistyrenowychaplikacja kleju biokompatybilnegometoda kleju epoksydowegooddzia ywanie z kom rkami dendrytycznymitworzenie synapsy immunologicznejkrzywe si a odleg o
Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.