Method Article

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia sił pojedynczych komórek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM-SCFS) jest potężnym narzędziem do badania właściwości biofizycznych żywych komórek. Technika ta pozwala na badanie siły i dynamiki interakcji na żywej błonie komórkowej, w tym między komórkami, receptorem i ligandami, a także wielu innych wariantów. Działa również jako mechanizm dostarczania fizycznego lub biochemicznego bodźca do pojedynczych komórek w sposób kontrolowany czasowo, umożliwiając w ten sposób monitorowanie określonej aktywacji komórek i późniejszych zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek. Kluczowym krokiem w tych pomiarach AFM-SCFS jest funkcjonalizacja wspornika AFM, czyli innymi słowy, przymocowanie interesującego obiektu do wspornika. W tym miejscu przedstawiamy metody modyfikacji wsporników AFM za pomocą pojedynczej limfocytu T i pojedynczego kulki polistyrenowej odpowiednio do badań immunologicznych. Pierwsza z nich obejmuje biokompatybilny klej, który łączy pojedyncze limfocyty T z końcówką płaskiego wspornika w roztworze, podczas gdy druga opiera się na kleju epoksydowym do przyczepności pojedynczej kulki w środowisku powietrznym. Dostępne są również dwie aplikacje immunologiczne związane z każdą modyfikacją wspornika. Opisane tutaj metody można łatwo dostosować do różnych typów komórek i cząstek stałych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia sił atomowych (AFM), wszechstronne narzędzie, znalazło wiele zastosowań w badaniach biologii komórki1,2,3,4,5. Oprócz możliwości obrazowania w wysokiej rozdzielczości, natywna funkcja sondowania siły umożliwia badanie właściwości biofizycznych żywych komórek bezpośrednio in situ na poziomie pojedynczej komórki6,7. Należą do nich sztywność struktur subkomórkowych, a nawet całych komórek8,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentu na myszach jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu Tsinghua dotyczącymi opieki nad zwierzętami

1. Funkcjonalizacja kantylowa z pojedynczymi limfocytami T

  1. Preparatyka komórek śledziony myszy
    1. Ofiarować mysz (w wieku 8-16 tygodni (dowolnej płci); np. szczep C57BL/6) za pomocą dwutlenku węgla, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
    2. Oczyść mysz 75% etanolem i wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej, a następnie splenektomię.
    3. Homogenizować śledzionę w 4 ml PBS zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) za pomocą szkiełek podstawowych i usuwać agregaty i zanieczyszczenia, przep....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4A pokazuje typowe krzywe siła-odległość od interakcji wiążącej między pojedynczą komórką T a pojedynczym DC w jednym cyklu zbliżania-wycofywania. Jasnoczerwona krzywa to krzywa przedłużenia, a ciemnoczerwona to krzywa wycofania. Ponieważ krzywa wydłużenia jest zwykle używana do analizy wgłębień lub sztywności, w tym przypadku tylko krzywa wycofania dotyczy adhezji komórek. Minimalna wartość (zielone kółko) na krzywej jest miarą maksymalnej siły przyc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia sił pojedynczych komórek oparta na AFM ewoluowała, aby stać się potężnym narzędziem do badania właściwości biofizycznych żywych komórek. W przypadku tych zastosowań wspornik musi być odpowiednio funkcjonalizowany, aby móc badać określone interakcje lub właściwości na interesujących komórkach. W tym miejscu opisano odpowiednio metody sprzęgania pojedynczej komórki T i pojedynczego mikronu kulki z wspornikiem bez końcówki. Aby przymocować pojedynczą komórkę T do wspornika, jako klej komórkowy wybrano biokompa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), State Key Program (31630023) oraz Innovative Research Group Program (81621002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiał
10 μ l końcówka do pipetThermo Fisher104-Q
Rurka 15 mlCorning430791
Naczynie hodowlane o średnicy 6 cmNALGENE nunc150462
6-dołkowa płytka hodowlanaJETTCP011006
AFM CantileverNanoWorldArrow-TL1-50bez końcówki
β-MerkaptoetanolSigma7604
Biokompatybilny klejBD Cell-Tak354240
CD4+ Izolacja limfocytów T KoktajlSTEMCELL19852C.1
Linia komórkowa DC2.4Prezent od K. Rocka (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Cząstki magnetyczne pokryte dekstranemSTEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
EpoksydERGO7100
Etanoltwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR blokerSTEMCELL18731
Szklane szkiełko nakrywkowelokalny sprzedawca (Hai Men Lian Sheng)HX-E37Średnica 24 mm, grubość 0,17 mm
SzkiełkapodstawoweJinTong dział zarządzania laboratorium i sprzętem, Haimen Niedotyczy dostosowane
H2O2 (30%)Sino pharm10011218
H2SO4Sino pharm80120892
HEPESSigma51558
MagnesSTEMCELL18000
Sitko siatkowenylonowe BD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/Asklonowany w laboratorium
Mysz CD25 Zestaw do pozytywnej izolacji komórek TregSTEMCELL18782Składnik: Bloker FcR, koktajl pozytywnej selekcji regulatorowych komórek T, koktajl wyboru PE, Dekstran RapidSpheres,
mysz CD4+ Zestaw do izolacji komórek TSTEMCELL19852Składnik: Koktajl do izolacji komórek T CD4 +, Streptawidyna RapidSpheres, Serum szczurze
NaOHLanyi produkty chemiczne co., LTD? Pekin1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
Koktajl selekcyjny PESTEMCELL18151
Hyklon penicyliny-streptomycynySV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
Mikrosfery polistyrenowe 6,0μ mPolysciences07312-5
polistyrenowa rura z okrągłym dnemBD Falcon352054
Serum dla szczurówSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
Rekombinowana ludzka interleukina-2PeprotechPeprotech, 200-02-1000
Bufor do lizy czerwonych krwinekBeyotimeC3702
Regulatorowy koktajl pozytywnej selekcji limfocytów TSTEMCELL18782C
RPMI 1640ŻycieC11875500BT
Komora na próbkidomowej roboty
Cząstki magnetyczne pokryte streptawidynąSTEMCELL50001
Zestaw do transfekcjiClontech631318
Trypsin 0,25% EDTALife25200114
PęsetaJDN/A
NazwaFirmaNumer katalogowy< strong>Komentarze
Sprzęt
20x obiektyw NA 0.8Zeiss420650-9901Planapochromatyczny
mikroskop sił atomowychKomórka JPKHesion200
WirówkaBeckman redlicaAllegra X-12R
Obrazowaniefluorescencyjnedomowy obiektywowy mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem oparty na statywie
Nawilżony inkubator CO2Thermo FisherHERACELL 150i
Mikroskop światła odwróconegoZeissObserver A1
wspornik mikroskopowym Zeiss Instrukcja obsługi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopySingle Cell Force SpectroscopyAFM Cantilever FunctionalizationT Cell AdhesionPolystyrene Bead AttachmentBiocompatible Glue ApplicationEpoxy Glue MethodDendritic Cell InteractionImmune Synapse FormationForce Distance Curves

Related Articles