Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59610

⸱

14 września 2019

 ,  , 
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokoły przygotowania oocyst i oczyszczania sporozoitów do badania infekcji organoidów ludzkich jelit i dróg oddechowych przez Cryptosporidium parvum. Przedstawiono procedury mikroiniekcji pasożytów do światła organoidów jelitowych oraz barwienia immunologicznego organoidów. Na koniec opisujemy izolację wygenerowanych oocyst od organoidów.

Streszczenie

Cryptosporidium parvum jest jedną z głównych przyczyn biegunki u ludzi. Aby zrozumieć patologię pasożyta i opracować skuteczne leki, potrzebny jest system hodowli in vitro, który podsumowuje warunki panujące w żywicielu. Organoidy, które bardzo przypominają tkanki, z których pochodzą, są idealne do badania interakcji gospodarz-pasożyt. Organoidy to trójwymiarowe (3D) struktury tkankowe, które pochodzą z dorosłych komórek macierzystych i rosną w hodowli przez dłuższy czas bez poddawania się aberracji genetycznej lub transformacji. Mają dobrze zdefiniowaną polaryzację zarówno z powierzchniami wierzchołkowymi, jak i podstawnymi. Organoidy mają różne zastosowania w testowaniu leków, bankowaniu biologicznym oraz modelowaniu chorób i badaniach interakcji gospodarz-mikroorganizm. Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół, jak przygotować oocysty i sporozoity Cryptosporidium do infekowania organoidów jelitowych i oddechowych człowieka. Następnie pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać mikroiniekcje do wstrzykiwania drobnoustrojów do światła organoidu. Istnieją trzy główne metody, za pomocą których organoidy mogą być wykorzystywane do badań interakcji gospodarz-mikroorganizm - mikroiniekcja, mechaniczne ścinanie i powlekanie oraz tworzenie monowarstw. Mikroiniekcja umożliwia utrzymanie struktury 3D i pozwala na precyzyjną kontrolę objętości pasożytów oraz bezpośredni kontakt boczny wierzchołkowy dla drobnoustrojów. Dostarczamy szczegółów dotyczących optymalnego wzrostu organoidów do obrazowania lub produkcji oocyst. Na koniec pokazujemy również, w jaki sposób nowo wygenerowane oocysty można wyizolować z organoidu w celu dalszego przetwarzania i analizy.

Wprowadzenie

Rozwój leków lub szczepionek do leczenia i zapobiegania zakażeniu Cryptosporidium został utrudniony przez brak systemów in vitro, które dokładnie naśladują sytuację in vivo u ludzi1,2. Wiele z obecnie dostępnych systemów pozwala tylko na krótkotrwałą infekcję (<5 dni) lub nie obsługuje pełnego cyklu życia pasożyta3,4. Inne systemy, które umożliwiają pełny rozwój pasożyta, opierają się na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub liniach komórek nowotworowych, które nie oddają wiernie sytuacji fizjologicznej u ludzi5,6,7. Organoidy lub "mininarządy" to struktury 3D pochodzące z tkanki, które są hodowane w macierzy zewnątrzkomórkowej uzupełnionej różnymi specyficznymi dla tkanki czynnikami wzrostu. Organoidy zostały opracowane z różnych narządów i tkanek. Są one stabilne genetycznie i podsumowują większość funkcji narządów, z których pochodzą, i mogą być utrzymywane w kulturze przez dłuższy czas. Opracowaliśmy metodę infekowania organoidów jelitowych i płuc człowieka Cryptosporidium, która zapewnia dokładny model in vitro do badania interakcji gospodarz-pasożyt istotnych dla kryptosporydiozy jelitowej i oddechowej8,9,10,11,12,13. W przeciwieństwie do innych opublikowanych modeli hodowli, system organoidów jest reprezentatywny dla rzeczywistych interakcji pasożyta żywiciela, pozwala na zakończenie cyklu życiowego, dzięki czemu można badać wszystkie etapy cyklu życiowego pasożyta, i utrzymuje rozmnażanie pasożyta przez okres do 28 dni10.

Cryptosporidium parvum to pasożyt apicomplexanu, który infekuje nabłonek dróg oddechowych i jelitowych, powodując przedłużającą się biegunkę. Odpornym etapem środowiskowym jest oocysta, znajdująca się w skażonej żywności i wodzie14. Po spożyciu lub wdychaniu oocysta wydziela się i uwalnia cztery sporozoity, które przyczepiają się do komórek nabłonka. Sporozoity ślizgają się po komórkach gospodarza i angażują receptory komórek gospodarza, ale pasożyt nie atakuje w pełni komórki i wydaje się, że skłania komórkę gospodarza do jej pochłonięcia15. Pasożyt, który jest internalizowany w wewnątrzkomórkowym, ale pozacytoplazmatycznym kompartmencie, pozostaje na wierzchołkowej powierzchni komórki, replikując się w parazytoforycznej wakuoli. Przechodzi dwie rundy rozmnażania bezpłciowego - proces zwany merogonią. Podczas merogonii rozwijają się meronty typu I, które zawierają osiem merozoitów, które są uwalniane w celu inwazji na nowe komórki. Te merozoity atakują nowe komórki, aby przekształcić się w meronty typu II zawierające cztery merozoity. Te merozoity po uwolnieniu infekują komórki i przekształcają się w makrogamonty i mikrogamonty. Uwalniane są mikrogamety, które zapładniają makrogamety, wytwarzając zygoty, które dojrzewają do oocyst. Dojrzałe oocysty są następnie uwalniane do światła. Oocysty są albo cienkościenne, które natychmiast ekscytują, aby ponownie zainfekować nabłonek, albo grubościenne, które są uwalniane do środowiska, aby zainfekować następnego hosta14. Wszystkie etapy cyklu życiowego Cryptosporidium zostały zidentyfikowane w systemie hodowli organoidów opracowanym wcześniej przez naszą grupę10.

Ponieważ ludzkie organoidy wiernie odwzorowują ludzkie tkanki9,11,13, i wspierają wszystkie etapy replikacji Cryptosporidium10, są idealnym systemem hodowli tkankowej do badania biologii Cryptosporidium i interakcji gospodarz-pasożyt. W tym miejscu opisujemy procedury infekowania organoidów zarówno oocystami Cryptosporidium, jak i wycyzowanymi sporozoitami oraz izolowania nowych oocyst wytwarzanych w tym systemie hodowli tkankowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie czynności związane z tkankami i resekcja zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board (IRB) za zgodą pacjenta.

1. Przygotowanie oocyst C. parvum do wstrzykiwań

UWAGA: oocysty Cryptosporidium zostały zakupione z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów). Te oocysty są wytwarzane u cieląt i są przechowywane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z antybiotykami. Można je przechowywać przez około 3 miesiące w temperaturze 4 °C i nigdy nie należy ich zamrażać. Zwykle używamy oocyst w ciągu jednego miesiąca. Organoidy mogą być zakażone albo nienaruszonymi oocystami, albo sporozoity mogą być izolowane z wycysowanych oocyst i używane do infekowania organoidów, jeśli ważne jest, aby oocysty nie zostały przeniesione z oryginalnego inokulum.

  1. Przygotuj oocysty Cryptosporidium do infekowania komórek (Ryc. 1A).
    1. Utrzymuj oocysty na lodzie podczas wszystkich manipulacji, dopóki nie zostaną dodane do organoidów.
    2. Oblicz liczbę oocyst potrzebnych do uzyskania pełnej sześciodołkowej płytki organoidów (zwykle około 5 x 105–2,5 x 105 na płytkę). Policz liczbę oocyst w hemocytometrze, aby zweryfikować ilość i przenieść do probówki wirówkowej.
      nuta: Aby pomóc w wizualizacji, oocysty można zmieszać w stosunku 1:1 z przeciwciałem fluorescencyjnym specyficznym dla oocysty (patrz Tabela Materiałów) przed załadowaniem do hemocytometru. Oocysty znakowane fluoroforem można następnie łatwo zobrazować i zliczyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Sugerujemy wstrzyknięcie około 100–1000 oocyst/organoidów. Ogólnie rzecz biorąc, na sześciodołkowej płytce można wyhodować 1,000–2,000 organoidów.
    3. Doprowadzić objętość zawiesiny oocyst do 900 μl za pomocą PBS. Dodać 100 μl wybielacza z podchlorynem sodu (np. Clorox) (w temperaturze 4 °C). Inkubować przez 10 minut na lodzie.
    4. Wirować przez 3 minuty w mikrowirówce przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C. Ustawić probówki w wirówce tak, aby otwór nasadki był skierowany do wewnątrz. Granulka może być trudna do zauważenia, więc wiedza o tym, gdzie pasożyty zagnieździły się w tubie, jest niezbędna.
    5. Usunąć supernatant za pomocą pipety, uważając, aby uniknąć osadu. Dodaj 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco i wymieszaj.
    6. Wirować przez 3 minuty w mikrowirówce przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C.
    7. Powtórz pranie DMEM jeszcze dwa razy.
    8. Przygotować pożywkę ekspandacyjną (OME) lub pożywkę organoidową różnicującą (OMD), do której dodano taurocholan, do końcowego stężenia 0,5% (w/v) (patrz tabela materiałów). Taurocholat należy zawsze przygotowywać i dodawać świeży.
      nuta: Z powodzeniem zastosowaliśmy 0,5% taurocholan w naszych testach infekcji, w których inokulum składa się z nienaruszonych oocyst i zaobserwowaliśmy poprawę wskaźników infekcji bez szkodliwego wpływu na komórki gospodarza. Jednak taurocholan może mieć nieoczekiwany wpływ na komórki, a niższe stężenia są z powodzeniem stosowane w testach infekcji16.
    9. Zawiesić oocysty w 100 μl pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej 0,5% (w/v) taurocholanu sodu. Ponownie policz oocysty zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
    10. Dodaj barwnik Fast Green do zawiesiny, aby uwidocznić wstrzyknięcie.
    11. Napełnij końcówki mikroładowarki (patrz Tabela materiałów) zawiesiną oocysty i użyj jej do wypełnienia ciągniętych naczyń włosowatych.
      ostrożność: Cała procedura powinna być wykonana w kapturze do hodowli tkankowej z protokołami bezpieczeństwa poziomu 2. Zaleca się stosowanie masek, ponieważ oocysty Cryptosporidium mogą być również zakaźne w powietrzu.

2. Oczyszczanie in vitro sporozoitów z oocyst C. parvum

  1. Oczyść sporozoity z oocyst C. parvum oocyst po wybieleniu i wypłukaniu wybielacza, jak opisano powyżej.
    1. Przenieś oocysty do probówki o pojemności 15 ml. Zawiesić oocysty w pożywce ekscystacyjnej o temperaturze pokojowej (0,75% w/v taurocholanu sodu w DMEM), aby uzyskać 1 x 107 oocyst / ml. Dodatek taurocholanu poprawia szybkość ekscystacji oocyst, poprawiając wydajność sporozoitów.
    2. Inkubować zawiesinę oocyst w temperaturze 37 °C przez 1–1,5 godziny.
    3. Sprawdzić próbkę pod mikroskopem pod kątem stopnia ekscytacji; 60-80% ekscystacji jest rozsądne dla dobrego odzysku sporozoitów. Jeśli poziom ekscystacji jest niski, inkubować dłużej (kolejne 30 min do 1 h).
    4. Określ procentową ekscystację w stosunku do liczby początkowych oocyst. Ekscystacja jest obliczana jako:
      % ekscystacji = [1 – (liczba nienaruszonych oocyst/liczba oocyst na początku)] x 100
    5. Umyj komórki w celu usunięcia odczynników ekscystacyjnych, dodając 14 ml PBS lub pożywki, mieszając i odzyskując komórki (nienaruszone oocysty, otoczki oocyst i sporozoity) przez odwirowanie przy 3,400 x g przez 20 minut w celu odzyskania sporozoitów. Odsysaj ostrożnie, aby uniknąć utraty komórek.
    6. Ponownie zawiesić osad sporozoitu w 1-2 ml DMEM, aby uzyskać 3 x 107 oocyst / ml (w zależności od liczby początkowych oocyst).
    7. Aby usunąć pozostałe oocysty i muszle, przefiltruj zawiesinę przez filtr 3 μm (Rysunek 1B). Użyć aparatu z uchwytem filtra 47 mm wyposażonego w filtr poliwęglanowy (porów o wielkości 3 μm) przymocowany do cylindra strzykawki o pojemności 10 ml. Umieść aparat z uchwytem filtra na probówce o pojemności 15 ml. Umieść zespół w pojemniku na lód lub w chłodni.
    8. Dodać 7,5 ml zawiesiny sporozoitu do zespołu filtra i pozostawić do przefiltrowania grawitacyjnie. Przemyć kolejnym 7,5 ml DMEM.
      nuta: Aby zapewnić powodzenie izolacji sporozoitów, kluczowe znaczenie mają świeże oocysty i dobra ekscystacja. Jeśli jest zbyt wiele nieusuniętych oocyst, zawiesina nie przepłynie grawitacyjnie. Wywieranie nacisku na strzykawkę może przepchnąć nieusunięte oocysty. Mikroiniekcja sporozoitów jest trudniejsza niż oocysty, ponieważ sporozoity mogą zbrylać się i blokować naczynia włosowate. Aby tego uniknąć, zalecamy wykonanie szerszej końcówki kapilarnej podczas wstrzykiwania organoidów ze sporozoitami. Aby osiągnąć wystarczający poziom infekcji, do każdego organoidu należy wstrzyknąć 2-4 razy więcej sporozoitów w porównaniu z organoidami zakażonymi oocystami.
    9. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę sporozoitu o stężeniu 3 400 x g za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego przez 20 minut, aby osadzać sporozoity.
    10. Zawiesić w 50–100 μl pożywki do hodowli organoidów OME lub OMD (patrz tabela materiałów) uzupełnionej 0,05% (w/v) barwnikiem Fast Green i buforem redukującym zawierającym L-glutation, betainę, L-cysteinę, kwas linolowy i taurynę 5 (patrz Tabela Materiałów).
      nuta: Zbyt długa inkubacja oocyst może powodować lizę sporozoitów i słabą regenerację, dlatego należy tego unikać.

3. Hodowla in vitro organoidów z ludzkich jelit i płuc do mikroiniekcji

  1. Hodowla organoidów jelitowych w warunkach podłoży ekspandujących i różnicujących.
    UWAGA:     Szczegóły dotyczące rozmnażania organoidów jelitowych i płucnych zostały wcześniej opisane w innych artykułach8,13 (zobacz Tabelę materiałów dla przepisów na media). W tym miejscu pokrótce opisujemy metodę hodowli organoidów ze szczególnym odniesieniem do optymalizacji pod kątem wstrzykiwania i wzrostu Cryptosporidium. Odkryliśmy, że do obrazowania pasożytów w organoidach, organoidy hodowane w pożywce ekspansywnej są lepsze niż te w pożywkach różnicujących, ponieważ gromadzi się mniej zanieczyszczeń niż w organoidach hodowanych w pożywce różnicowej. Jeśli jednak celem jest wyizolowanie oocyst, organoidy hodowane w pożywkach różnicujących wytwarzają znacznie większą liczbę oocyst.
    1. Utrzymuj organoidy w kulturach 3D w macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C. Dodaj OME (pożywkę ekspandacyjną) na wierzch i odświeżaj codziennie.
      nuta: W przypadku organoidów płucnych nie mamy oddzielnych pożywek do ekspandowania i różnicowania.
    2. Aby podzielić i ułożyć na płytki organoidy do mikroiniekcji, należy usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej zawierającej organoidy ludzkie i dodać F12+++ (patrz tabela materiałów) do dołka i rozbić matrycę, kilkakrotnie pipetując końcówką do pipety o pojemności 1 ml. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml (2 ml F12+++ na probówkę wystarcza do dalszych zabiegów).
    3. Dodaj 10-12 ml F12+++ do kolejnej probówki o pojemności 15 ml i umieść w pożywce pipetę z polerowanego szkła, pipetuj w górę i w dół 3 razy, aby rozbić organoidy jelit i płuc człowieka.
      nuta: Użyj długiej szklanej pipety (20–30 cm) i krótko ją wypoleruj. Nie należy wykonywać bardzo małego otworu (o średnicy 1 mm), ponieważ organoidy mogą zostać uszkodzone. Wygładź końcówkę pipety, krótko ją polerując ogniowo. Rozbij organoidy na mniejsze kawałki o wielkości ~50 μm. Organoidy płuc mają grubszą błonę zewnętrzną i dlatego wymagają silniejszego ścinania szklaną pipetą w porównaniu z organoidami jelitowymi. Ponadto mają wolniejsze tempo wzrostu niż organoidy jelitowe (do 14 dni między każdym pasażem).
    4. Dodać F12+++ do 5–7 ml i odwirować przy 350 x g przez 5 min.
      nuta: Prędkość wirowania na tym etapie jest wyższa niż normalnie, aby uzyskać dobry osad komórkowy, który jest dobrze oddzielony od macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela materiałów). Zaobserwowaliśmy, że w porównaniu z mysimi organoidami jelita cienkiego, ludzkie organoidy jelita cienkiego są trudniejsze do zakłócenia.
    5. Usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszania komórek, a następnie ponownie zawiesić osad z matrycą utrzymywaną w temperaturze 4 °C; wymagane jest 200–300 μl matrycy na dołek płytki sześciodołkowej. Organoidy należy podzielić jeden na trzy, aby utrzymać dość dużą gęstość komórek.
    6. Umieść organoidy w kropelkach matrycy o objętości około 5–10 μl każda w studzience sześciodołkowej płytki. Inkubować przez 20–30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać na wierzch pożywkę ekspandacyjną (OME).
    7. Zmieniaj podłoże co 2–3 dni.
      nuta: Po około 5–7 dniach organoidy rosnące w EM osiągają wielkość 100–200 μm i są gotowe do wstrzyknięcia.
    8. Aby rozróżnić organoidy, po 5-6 dniach w EM, zmień pożywkę na pożywkę różnicującą (DM) i trzymaj przez dodatkowe 5-6 dni przed wstrzyknięciem pasożytów.
      nuta: W celu ekspansji organoidów zaleca się gęste powlekanie organoidów. Do mikroiniekcji zaleca się stosowanie płytki sześciodołkowej z organoidami posianymi o mniejszej gęstości. Na przykład, organoidy płytkowe z trzech dołków z sześciodołkowej płytki do pełnej sześciodołkowej płytki do mikroiniekcji. Matrycę należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania i rozmrozić w temperaturze 4 °C lub na lodzie przed użyciem. Ekspansja organoidów płuc odbywa się w podobny sposób, ale przy użyciu składników pożywki specyficznych dla organoidów płuc (Tabela 1)8 .

4. Mikroiniekcja oocyst/sporozoitów do światła organoidu

  1. Mikrowstrzyknij pasożyty w wierzchołkową stronę organoidu 3D (Rysunek 2).
    1. Przygotować szklane kapilary o średnicy 1 mm za pomocą ściągacza do mikropipet.
      nuta: Ustawienia używane w ściągaczu do mikropipet (patrz tabela materiałów) to: Ciepło = 663, Ciągnięcie = 100, Prędkość = 200, Czas = 40 ms. Ustawienia będą musiały zostać dostosowane zgodnie z instrukcjami użytkownika dla konkretnego urządzenia.
    2. Przetnij końcówkę kapilary kleszczami. Rozmiar/średnica końca kapilarnego wynosi około 9–12 μm; Umożliwia to łatwy przepływ oocyst (o wielkości 4–5 μm).
    3. Wypełnij kapilary zawiesiną oocysty lub sporozoitu za pomocą końcówek mikroładowacza.
    4. Załadować kapilarnę wypełnioną oocystą do mikrowstrzykiwacza.
    5. Mikrowstrzyknąć zawiesinę 100–200 nL do każdego organoidu pod odwróconym mikroskopem przy 5-krotnym powiększeniu, utrzymując stałe ciśnienie. Po mikroiniekcji należy codziennie odświeżać podłoże za pomocą OME lub OMD i utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C.
      nuta: Do mikroiniekcji nie używamy mikromanipulatora. Zaleca się stosowanie tej samej kapilary w całym eksperymencie, aby zapewnić równe wstrzyknięcie w każdej próbce.

5. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów

  1. Zebrać organoidy (1–2 x 24 dołki) za pomocą pipety P1000 do probówki o pojemności 15 ml zawierającej zimny F12+++.
  2. Organoidy osadzać w ilości 300 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant bez naruszania osadu i delikatnie odpipetować osad luzem do pozostałej objętości.
  3. Dodaj 5 ml 2% paraformaldehydu do PBS. Aby organoidy nie przywierały do ściany, nie odwracaj rurki. Pozostawić organoidy do osiądnięcia na dnie probówki i utrwalić w temperaturze 4 °C przez noc lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć utrwalacz i dodać 10 ml buforu permeabilacyjnego (0,2% Trytonu w PBS).
  5. Obracać probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut (zapewnia to, że wszystkie organoidy pozostaną w zawiesinie).
  6. Osadzać organoidy w masie 300 x g przez 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant.
  7. Delikatnie zawiesić organoidy w 500 μl roztworu blokującego (patrz tabela materiałów) i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  8. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na shakerze. Pozwól, aby organoidy osiadały na dnie probówki pod wpływem grawitacji. Zastąp roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) i inkubuj przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Umyć 3x PBS zawierającym 0,1% Tween. Pozwól organoidom osiąść za każdym razem i usuń supernatant.
  10. Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciał (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  11. Umyć 3x PBS zawierającym 0,1% Tween. Pozostaw 50 μl PBS po trzecim praniu.
  12. Umieścić na szkiełku poprzez pipetowanie organoidów zawieszonych w 50 μl PBS na szkiełku. Usuń nadmiar PBS, dodaj kroplę środka montażowego (patrz tabela materiałów) i dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzch. Uszczelnij boki lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia.

6. Izolacja oocyst z organoidów

  1. Wyizolować nowo powstałe oocysty ze światła organoidu.
    UWAGA:     oocysty są izolowane z organoidów przez separację immunomagnetyczną przy użyciu zestawu do izolacji oocyst (patrz tabela materiałów) z modyfikacjami opisanymi poniżej. Wyizolowane oocysty można następnie analizować za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej.
    1. Zacznij od zróżnicowanych organoidów, które utrzymywały się w OMD przez 5-7 dni i które są niezakażone, zakażone przez 1 dzień i zakażone przez 5 dni. Użyj pierwszych dwóch jako kontroli negatywnych.
      nuta: Odkryliśmy, że zróżnicowane organoidy wytwarzają więcej oocyst niż organoidy płucne lub ekspandujące jelita10.
    2. Zebrać organoidy do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Odwirować organoidy przez 20 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 10 °C.
      nuta: Ta wysoka prędkość jest potrzebna, aby upewnić się, że żadne oocysty nie zostaną utracone z jakichkolwiek organoidów, które mogą zostać uszkodzone.
    3. Usuń podłoże organoidowe i zastąp je 5 ml wody.
    4. Rozbić organoidy poprzez wielokrotne energiczne pipetowanie za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura.
    5. Jeśli widoczne są grudki, przenieś zawiesinę organoidu do homogenizatora szklanego i homogenizuj, aż organoidy zostaną dobrze rozbite. Homogenizator odbity nie wpłynie na oocysty.
    6. Gdy nie ma widocznych grudek, dodaj 5 ml buforu A z zestawu do izolacji oocyst. Wymieszaj, a następnie dodaj 120 μL kulek magnetycznych pokrytych antyoocystami IgM.
    7. Inkubować zawiesinę komórkową i kulki magnetyczne przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem na platformie kołyskowej.
    8. Pod koniec inkubacji umieścić probówki zawierające komórki i kulki na stojaku do separacji magnetycznej przeznaczonym do probówek o pojemności 15 ml.
    9. Obracaj probówki w stojaku do separacji magnetycznej ręcznie przez 3 minuty. Koraliki będą przylegać do boku rurki obok magnesu.
    10. Ostrożnie, za pomocą pipety o pojemności 10 ml, usuń supernatant z kulek. Zawiesić kulki w 450 μl buforu B i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      nuta: Przechowywać supernatant do momentu potwierdzenia izolacji oocyst.
    11. Aby zebrać wszelkie pozostałe kulki i oocysty, przemyj probówkę o pojemności 15 ml 450 μl buforu B i dodaj ten płyn do kulek magnetycznych w probówce do mikrowirówki.
    12. Powtórz krok 6.1.11 jeszcze raz. Wszystkie kulki i uchwycone oocysty należy teraz przenieść do probówki mikrowirówkowej.
    13. Umieść probówkę do mikrowirówek na magnetycznym stojaku separacyjnym przeznaczonym do przechowywania probówek do mikrowirówek.
    14. Obracaj ręcznie rurkę w stojaku do separacji magnetycznej przez 3 minuty.
    15. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety do nowej probówki.
      nuta: Przechowywać supernatant do momentu potwierdzenia izolacji oocyst.
    16. Wyjmij probówkę mikrowirówki zawierającą kulki magnetyczne i oocysty ze stojaka do separacji magnetycznej.
    17. Dodaj 100 μl 0,1 N HCl do kulek magnetycznych, aby wymyć oocysty z kulek. Wir przez 30 s.
      nuta: Vortexer powinien być ustawiony na nieco mniejszą prędkość niż maksymalna.
    18. Inkubować kulki w 0,1 N HCl przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    19. Znowu wir. Następnie umieść rurkę z powrotem na stojaku do separacji magnetycznej. Poczekaj, aż kulki przylgną do boku probówki, a następnie przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
    20. Powtórzyć kroki od 6.1.17 do 6.1.19 i połączyć drugą eluację z pierwszą elucją.
    21. Zneutralizować eluat za pomocą 20 μl 1 N NaOH lub innego buforu neutralizującego, takiego jak 1 M Tris, pH 8.
    22. Aby policzyć oocysty, należy pobrać 10 μl eluatu, połączyć go z 10 μl przeciwciała swoistego dla oocysty (patrz tabela materiałów) i policzyć fluorescencyjne oocysty na hemocytometrze.
      nuta: Wyizolowane oocysty mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub natychmiast wykorzystane do obrazowania immunofluorescencyjnego lub mikroskopii elektronowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na wydajne oczyszczanie oocyst i sporozoitów (Rysunek 1A), przygotowując je do mikroiniekcji. Protokół ekscystacji prowadzi do uwolnienia sporozoitów z około 70–80% oocyst, dlatego niezbędne jest odfiltrowanie pozostałych oocyst i otoczek przez filtr 3 µm. Filtracja pozwala na niemal 10% oczyszczenie sporozoitów (Rysunek 1B). Ponadto dodanie zielonego barwnika pomaga zapewnić iniekcję wszystkich organoidów i umożliwia ich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hodowla pasożytów Cryptosporidium w organoidach jelitowych i oddechowych stanowi dokładny model do badania interakcji gospodarz-pasożyt10 , ale ma również wiele innych zastosowań. Na przykład obecne metody selekcji i rozmnażania genetycznie zmodyfikowanych pasożytów Cryptosporidium wymagają przejścia u myszy19 , co nie pozwala na izolację pasożytów, które mają modyfikacje niezbędne do infekcji in vivo. Hodowla organoidów Cryptosporidium stanowi al...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Deborah A. Schaefer ze Szkoły Nauk Biomedycznych i Porównawczych, Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych, University of Arizona, Tucson, AZ, USA za pomoc w produkcji i analizie oocyst. Dziękujemy również Franceschi Microscopy and Imaging Center oraz D.L. Mullendore z Washington State University za przygotowanie TEM i obrazowanie izolowanych oocyst organoidów.

D.D. jest odbiorcą grantu VENI od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. jest laureatem grantu VENI od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ALW, 863.14.002) i był wspierany przez stypendia Marie Curie od Komisji Europejskiej (Propozycja 330571 7 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach ERBN Advanced Grant Agreement nr 67013 oraz od NIH NIAIH w ramach R21 AT009174 do RMO. Praca ta jest częścią Instytutu Oncode, który jest częściowo finansowany przez Holenderskie Towarzystwo Onkologiczne i został sfinansowany z grantu Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekstrakt z błony podstawnej (macierz zewnątrzkomórkowa)amsbio3533-010-02 
Przeciwciało Crypt-a-Glo (przeciwciało specyficzne dla oocysty)Waterborne, IncA400FLR-1XStężenie końcowe = Użyj 2-3 kropli/slajd
Koraliki magnetyczne pokryte Crypto-Grab IgMWaterborne, IncIMS400-20 
Stojak Dynamag 15Thermofisher Scientific12301D 
Stojak Dynamag 2Thermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore  Filtry membranowe z poliwęglanu izoporowego - 3 i mikro; mEMD-MilliporeTSTP02500 
Szybki zielony barwnikSIGMAF7252-5G    
Mikrowtryskiwacz Femtojet 4iEppendorf5252000013 
Kapilary szklane o średnicy 1 mmWPITW100F-4 
Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)Corning356237 
Probówka do mikrofuge 1,5 mlEppendorfT9661-1000EA 
Końcówki do mikroładowarekEppendorf612-7933 
Ściągacz do mikropipet P-97Przyrząd do przesłonyP-97 
Normalna surowica osłaBio-RadC06SB&nbsp;
PenstrepGibco15140-122 
Hikloryt sodu (stosować 5%)Clorox50371478 
Zjeżdżalnie Super StickWaterborne, IncS100-3 
Swinnex-25 47 mm Uchwyt filtra z poliwęglanuEMD-MilliporeSX0002500 
Kwas taurocholowy sól sodowa hydratSIGMAT4009-5G 
Tween-20Merck8221840500 
Środek montażowy VectashieldVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Przemysł naukowy, IncSI0236 
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)    Ilość końcowa
DMEMInvitrogen12634-010500 ml
PenstrepGibco15140-1225 ml bulionu w 500 ml DMEM
GlutamaxGibco350500385 ml bulionu w 500 ml DMEM
HepesGibco156300565 ml bulionu w 500 ml DMEM
ORGANOID JELITOWY MEDIA-OME (Pożywka ekspandująca)    Stężenie końcowe
A83-01Tocris2939-50mg0,5 &mikro; M
Adv+++  uzupełnić do 100 ml
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
GastrinTocris3006-1mg10 nM
NACSigmaA9125-25G1,25 mM
karta sieciowaSigmaN0636-100G10 mM
Noggin CMW domu* 10%
Inhibitor P38 (SB202190)SigmaS7076-25 mg10 &mikro; M
PGE2Tocris2296/1010 nM
PrimocinInvivoGenant-pm-11 mL/500 mL
Media RSpoI CMW domu* 20%
Wnt3a CMW domu* 50%
Na miejscu* - linie komórkowe zostaną dostarczone na życzenie   
INTESTINGENAL ORGANOID MEDIA-OMD (Pożywka różnicująca)  Aby rozróżnić organoidy, ekspandujące organoidy jelita cienkiego hodowano w pożywce bogatej w Wnt przez sześć do siedmiu dni po rozszczepieniu, a następnie hodowano w pożywce różnicującej (wycofanie Wnt, nikotynamidu SB202190, w pożywce różnicującej (wycofanie Wnt, nikotynamidu SB202190, prostaglandyny E2 z pożywki bogatej w Wnt lub OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Pożywka różnicująca)    Stężenie końcowe
Adv+++  uzupełnić do 100 ml
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 nM
B27Invitrogen175040440,0763888889
FGF-10Peprotech100-26100 ng/ml
FGF-7Peprotech100-1925 ng/mL
N-acetylocysteinaSigmaA9125-25G1,25 mM
NikotynamidSigmaN0636-100G5 mM
Noggin UPEU-Protein Express Skontaktujsię bezpośrednio z firmą10%
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 mg1 &mikro; M
PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 mg2,5 i mikro; m
Rspo UPEU-Protein Express Skontaktujsię bezpośrednio z firmą10%
bufor redukujący (do ponownego zawieszania oocyst i sporozoitów do wstrzykiwań)    Stężenie końcowe
L-Glutation zredukowanySigmaG4251-10MG0,5 μ g/μ L of OME/OMD/LOM
BetainaSigma619620,5 &MU; g/μ L of OME/OMD/LOM
L-CysteineSigma168149-2.5G0.5 μ g/μ L kwasu linolowego OME/OMD/LOM
SigmaL1376-10MG6,8 μ g / ml OME / OMD / LOM
TaurynaSigmaT0625-10MG0,5 μ g/μ L buforu blokującego OME/OMD/LOM
(do barwienia immunofluorescencyjnego)    Stężenie końcowe
Surowica dla osła/kozyBio-RadC06SB2%
PBSThermo-Fisher70011044Uzupełnij do 100 ml
Tween 20MerckP13790,1
%Lista stosowanych przeciwciał      
Alexa 568 kozia anty-królikInvitrogenA-11011Rozcieńczenie-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Przeciwciało znakowane fluoresceiną Crypto-GloWaterborne, IncA400FLKRozcieńczenie- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Kulki magnetyczne pokryte reaktywnym przeciwciałem monoklonalnymWaterborne, IncIMS400-20Rozcieńczenie-1:500
DAPIThermo Fisher ScientificD1306Rozcieńczenie-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674InvitrogenA22287Rozcieńczenie-1:1,000; RRID: AB_2620155
Królicze przeciwciało anty-gp15 wytwarzane przez R. M. O' Connor (współautor).Na życzenieNa żądanieRozcieńczenie-1:500
Sporo-GloWaterborne, IncA600FLR-1XRozcieńczenie- 1:200

Bibliografia

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika mikroi iekcjioczyszczanie sporozoit wprotok ekscystacjitr jwymiarowy 3D system organoid winterakcja gospodarz mikrobtest immunofluorescencjimetoda filtracjiiniekcja apikalna
Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.