Method Article

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) wykorzystuje światło wzbudzające w bliskiej podczerwieni; dlatego ma wiele właściwości obrazowania mikroskopowego wielofotonowego. Metodę obrazowania SRS można uzyskać przy użyciu komercyjnych laserowych mikroskopów skaningowych, wyposażając się w detektor przednie bez deskryptacji z odpowiednimi filtrami pasmowoprzepustowymi i schematem wykrywania wzmacniacza blokującego (LIA). Schematyczny układ typowego mikroskopu SRS obejmuje: dwie impulsowe wiązki laserowe (tj. pompę i sondę skierowane w mikroskopie skaningowym), które muszą nakładać się na siebie zarówno w przestrzeni, jak i czasie na płaszczyźnie obrazu, a następnie zogniskowane przez obiektyw mikroskopu w próbce przez dwa lustra skanujące (SM), które rasterują ognisko w płaszczyźnie x-y. Po interakcji z próbką, transmitowane impulsy wyjściowe są zbierane przez górny obiektyw i mierzone przez system detekcji do przodu umieszczony w odwróconym mikroskopie. Impulsy pompy są usuwane przez stos filtrów optycznych, natomiast impulsy sondy, które są wynikiem procesu SRS zachodzącego w objętości ogniskowej próbki, są mierzone za pomocą fotodiody (PD). Odczyt wyładowań niezupełnych jest demodulowany przez LIA w celu wyodrębnienia głębokości modulacji. Obraz dwuwymiarowy (2D) uzyskuje się poprzez synchronizację jednostki detekcji do przodu z jednostką skanującą mikroskopu. W artykule opisano i z powodzeniem zademonstrowano zastosowanie mikroskopu SRS, a także raportowanie bezznacznikowych obrazów kulek polistyrenowych o średnicy 3 μm. Warto zauważyć, że mikroskopy SRS nie są dostępne na rynku, więc aby skorzystać z tych cech, jedyną opcją jest domowa konstrukcja. Ponieważ mikroskopia SRS staje się coraz bardziej popularna w wielu dziedzinach, uważa się, że ten dokładny opis wdrożenia mikroskopu SRS może być bardzo przydatny dla społeczności naukowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zastosowaniach nauk przyrodniczych, mikroskopia SRS stała się potężnym narzędziem do obrazowania bez znaczników. Podstawową ideą mikroskopii SRS jest połączenie siły kontrastu wibracyjnego i jego zdolności do pozyskiwania obrazów w ciągu kilku sekund.

SRS to proces, w którym różnica częstotliwości między dwoma częstotliwościami wiązki laserowej (sygnał pompy i sygnał Stokesa o różnych częstotliwościach) odpowiada drganiom molekularnym badanej próbki, powodując stymulowane rozpraszanie Ramana i znaczny wzrost sygnału Stokesa. W przeciwieństwie do liniowej spektroskopii Ramana, SRS wykazuje nieliniową zależność od przychodzących pól świetlnych i wytwarza promieniowanie koherentne. SRS ma dwie podstawowe zalety: 1) szybkość, która sprawia, że obrazy są mniej wrażliwe na artefakty wynikające z ruchu lub degradacji próbki, oraz 2) doskonały stosunek sygnału do szumu (SNR). Ponadto SRS wykazuje widmo identyczne ze spontanicznym Ramanem, a sygnał SRS jest liniowo proporcjonalny do stężenia wzbudzonego wiązania chemicznego sup class=1,2,3,4,5.

W naszym mikroskopie, femtosekundowy (fs) eksperymentalny układ SRS jest zintegrowany z odwróconym mikroskopem optycznym wyposażonym w szybki moduł skanowania luster (Rysunek 1)6,7,8. Do realizacji tego mikroskopu wykorzystywane są dwa impulsowe źródła laserowe. Pierwszym z nich jest fs-Ti:Sa o czasie trwania impulsu około 140 fs, częstotliwości powtarzania 80 MHz i długościach fal emisyjnych w zakresie 680-1080 nm. Drugi, używany jako wiązka sondy i pompowany przez Ti:Sa, to femtosekundowy zsynchronizowany optyczny oscylator parametryczny (SOPO), o czasie trwania impulsu około 200 fs, częstotliwości powtarzania 80 MHz i długościach fal emisji w zakresie 1000-1600 nm. Należy zauważyć, że minimalna różnica energii fotonów pomiędzy wiązką Ti:Sa a SOPO wynosi 2500 cm-1. W związku z tym, korzystając z tej kombinacji systemów laserowych, można badać tylko obszar C-H o wysokiej częstotliwości (2800-3200 cm-1) widm Ramana6,7,8.

Aby skonfigurować mikroskop SRS, należy rozważyć trzy kluczowe kwestie, które są opisane w kolejnych akapitach. Pierwszym z nich jest implementacja metody transferu modulacji wysokiej częstotliwości (zobacz opis Rysunek 2 i krok 2.1 protokołu). W badaniu eksperymentalnym SRS kluczowym parametrem jest czułość systemu. Sygnał SRS jest wykrywany jako niewielka zmiana intensywności wiązek wzbudzenia; Dlatego może zostać uszkodzony przez hałas o natężeniu lasera i odgłos strzału. Ten problem można rozwiązać, integrując ten system z metodą przesyłania modulacji wysokiej częstotliwości (zobacz Rysunek 2 i krok 2.1 protokołu, aby uzyskać szczegółowe informacje). W tej metodzie do modulacji pompy stosuje się modulator elektrooptyczny (EOM). Modulacja przekazywana do wiązki sondy może być następnie wykryta przez wyładowanie niezupełnego po zablokowaniu wiązki pompy stosem filtrów optycznych [tryb detekcji stymulowanego wzmocnienia Ramana (SRG)]. Wyjście PD jest połączone filtrem dolnoprzepustowym ze wzmacniaczem blokującym (LIA), który demoduluje mierzony sygnał. Zwiększając częstotliwość modulacji wiązki do częstotliwości powyżej 1 MHz, można uzyskać wewnętrzną granicę wyładowań niezupełnych.

Drugą kwestią do rozważenia jest instalacja mechanicznego montażu, który pozwala na przeprowadzenie detekcji do przodu i jednocześnie zachowanie obserwacji mikroskopowej w jasnym polu. Ponadto musi redukować szumy spowodowane drganiami mechanicznymi podczas generowania obrazów i umożliwiać precyzyjną zmianę położenia systemu detekcji (patrz Rysunek 3 i krok 2.2 protokołu).

Trzeci to synchronizacja sygnału uzyskanego przez schemat detekcji czułej na fazę, z wiązką skierowaną na próbkę monitorowaną przez głowicę skanującą mikroskopu. Aby uzyskać obrazy, SM wymagają trzech sygnałów TTL, które są udostępniane przez kontroler mikroskopu podłączony do jednostki głównej skanowania: zegar pikseli, synchronizacja linii i synchronizacja klatek. Synchronizacja jest osiągana poprzez sterowanie za pomocą karty PCI, trzema sygnałami TTL oraz akwizycję sygnału napięciowego na kanale wyjściowym LIA6,7,8. Wcześniej opracowano i opisano domowe oprogramowanie6,7,8, podczas gdy sprzęt systemu synchronizacji jest opisany w Rysunek 4.

Podstawową procedurą podczas wykonywania obrazowania SRS jest ustawienie mikroskopu. Realizuje się to w czterech krokach, które zostały opisane w kolejnych akapitach. Pierwszym z nich jest przestrzenne zachodzenie na siebie dwóch wiązek (zob. krok 3.1 protokołu). W tym eksperymentalnym układzie obie wiązki zostały przestrzennie współliniowo połączone przez dichroiczne zwierciadło. Wstępnym krokiem jest wyrównanie OPO i Ti:Sa tak, aby każdy z nich dotarł do mikroskopu. Następnie, biorąc pod uwagę OPO jako wiązkę odniesienia i wykorzystując detektor czuły na położenie, Ti:Sa nakłada się przestrzennie na OPO.

Drugim kluczowym aspektem jest czasowe nakładanie się dwóch wiązek (zobacz krok 3.2 protokołu). Nawet jeśli wiązki pompy i OPO są idealnie zsynchronizowane9, ponieważ podążają nieco innymi ścieżkami wiązki wewnątrz obudowy OPO, na wyjściu OPO mają opóźnienie czasowe około 5 ns i różnicę przestrzenną 5 cm. W związku z tym Ti:Sa i OPO wymagają optycznego ponownego dopasowania czasu, aby zapewnić czasowe nakładanie się próbki. Zazwyczaj osiąga się to za pomocą precyzyjnie przestrajalnej optycznej linii opóźniającej, która w tym przypadku jest wprowadzana między Ti:Sa a mikroskop (patrz Rysunek 1). Aby uzyskać czasowe nakładanie się dwóch belek, stosuje się dwie techniki. Pierwsza z nich jest realizowana za pomocą szybkiego PD i oscyloskopu, podczas gdy druga opiera się na auto- i krzyżowych korelacjach optycznych. Za pomocą pierwszej techniki uzyskuje się przybliżone nakładanie się dwóch wiązek (niepewność 10 ps), natomiast dokładne czasowe nakładanie się dwóch wiązek uzyskuje się za pomocą korelatora krzyżowego (rozdzielczość 1 fs).

Trzecim kluczowym aspektem jest wyrównanie dwóch wiązek wewnątrz mikroskopu (zobacz krok 3.3 protokołu). Wstępna obserwacja próbki w świetle białym pozwala na indywidualizację pożądanego pola widzenia (FOV). Następnie wiązki laserowe, wchodzące do mikroskopu przez boczny port mikroskopu, są ustawiane tak, aby dotrzeć do PD zamontowanego w górnej części (Rysunek 3). Jednak aby uzyskać poprawną akwizycję obrazu, wymagane jest ustawienie szeregu parametrów (na przykład wymiaru piksela i czasu przebywania piksela). Częstotliwość próbkowania musi respektować ograniczenie nałożone przez twierdzenie Nyquista w celu zachowania wszystkich informacji na obrazie, podczas gdy dla prawidłowej zgodności między współrzędnymi przestrzennymi pikseli a wartością SRS mierzoną w każdym pikselu, czas całkowania LIA powinien być równy lub porównywalny z czasem przebywania piksela.

W końcowym etapie ustawiania mikroskopu przeprowadzane są liczne testy optymalizujące wyrównanie przestrzenne i czasowe (zobacz krok 3.4 protokołu). Pewna liczba obrazów transmisyjnych (TI) zarówno dla Ti:SA, jak i OPO jest pozyskiwana w celu optymalizacji nakładania się przestrzennego. W TI używana jest pojedyncza wiązka, a natężenie wiązki przesyłanej z próbki jest mierzone za pomocą wyładowań niezupełnych. W przypadku TI realizowanego przez OPO, sygnał wyjściowy PD jest bezpośrednio podłączony do karty PCI, podczas gdy w przypadku TI realizowanego przez Ti:Sa, sygnał wyjściowy PD jest podłączony do LIA, a wyjście analogowe LIA jest podłączone do karty PCI. Obrazy transmisyjne są bardzo przydatne do optymalizacji pola widzenia, oświetlenia, ogniskowej obiektywów mikroskopu oraz do sprawdzenia, czy dwie wiązki przestrzennie zachodzą na siebie6,7,8.

Optymalizacja czasowego nakładania się pompy i wiązki sondy jest uzyskiwana poprzez skanowanie linii opóźniającej z krokami 0,001 mm odpowiadającymi przesunięciu czasowemu o 3,3 fs i przeprowadzenie pomiaru SRS w jednym punkcie próbki kulki polistyrenowej o średnicy 3 μm. Amplituda sygnału SRS mierzy wartości z LIA w funkcji opóźnienia sonda-pompa i zapewnia maksimum odpowiadające dokładnemu czasowemu nakładaniu się dwóch wiązek6,7,8. Przed zakończeniem należy zauważyć, że wszystkie omówione kroki są obowiązkowe w celu uzyskania obrazu wysokiej jakości.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uruchamianie systemu laserowego

  1. Sprawdzić, czy temperatura agregatów chłodniczych jest utrzymywana na poziomie 20 °C lub niższym.
  2. Sprawdź, czy regulator wilgotności działa prawidłowo, a wilgotność jest utrzymywana na poziomie około 40%.
  3. Włącz laser Ti:Sa, ściśle przestrzegając instrukcji zawartych w instrukcji.
  4. Ustaw długość fali na 810 nm.
  5. Włącz OPO i podłączony minikomputer. Uruchom aplikację sterującą laserem OPO.
  6. Wybierz obejście, jeśli wymagane jest 100% wyjścia lasera Ti:Sa na wyjściu ze skrzynki OPO.
  7. Usuń zaznaczenie obejścia, jeśli przy wyjściu ze skrzynki OPO wymagane jest 20% wyjścia lasera Ti:Sa i wyjścia lasera OPO.
  8. Otwórz migawkę Ti:Sa i zwolnij wiązkę Ti:Sa do wejścia OPO.
  9. Zwolnij dwie wiązki laserowe na wyjściu OPO, klikając sygnał out i pump-out.
  10. Poczekaj, aż oba lasery Ti:Sa i OPO ustabilizują się (około 45–60 minut).
  11. Sprawdź punkt wiązki na wyjściu ze skrzynki OPO zarówno dla Ti:Sa, jak i OPO za pomocą papierowej karty detektora i sprawdź moc za pomocą miernika mocy.
  12. Dostosuj długość fali lasera OPO do 1076 nm.
  13. Zmniejsz moc do ~10 mW dla każdej wiązki laserowej, aby wykonać wyrównanie.

2. Ustawianie mikroskopu

  1. Implementacja metody transferu modulacji wysokiej częstotliwości
    1. Przeprowadzić procedurę optycznego wyrównania modulatora w taki sposób, aby wiązka Ti:Sa wchodziła i wychodziła bez żadnych zniekształceń.
    2. Włącz generator funkcyjny i wygeneruj sygnał TTL (fala prostokątna o amplitudzie = 5 V, przesunięcie = 2,5 V, częstotliwość = 5 MHz).
    3. Podziel sygnał TTL na dwie części za pomocą złącza T; jedna dla EOM, a druga dla wzmacniacza lock-in (LIA) (patrz Rysunek 2).
    4. Sprawdź wszystkie poziomy sygnałów za pomocą oscyloskopu.
    5. Włącz LIA i podłącz kanał wyjściowy generatora do kanału referencyjnego LIA.
    6. Podłącz kanał wyjściowy generatora do wysokiego napięcia amplifier mocy EOM.
    7. Włącz wzmacniacz i ustaw napięcie na prawie maksymalny poziom. Monitoruj moc wiązki na wyjściu z EOM.
  2. Integracja montażu mechanicznego w celu ustalenia PD i przypisania ruchu względnego x i y
    UWAGA: Wraz z mikroskopem wprowadzany jest zewnętrzny montaż, wyposażony w mikrometr, który ma kontrolę ruchu w kierunkach x i y.
    1. Zamontuj dwa stopnie translacji ruchu, aby umożliwić ruchy wzdłuż kierunków x i y (patrz Rysunek 3).
    2. Zamocuj stolik na słupku Ø1.5" o odpowiedniej wysokości.
    3. Zamontuj PD na zewnętrznym uchwycie.
    4. Zmaksymalizuj moc wiązki na WNZ, dostosowując pozycje WNZ (współrzędne x i y) za pomocą mikrometrów dołączonych do uchwytu (patrz Rysunek 3).

3. Ustawienie mikroskopu

  1. Przestrzenne zachodzenie na siebie belek
    UWAGA: Biorąc pod uwagę wiązkę OPO jako odniesienie i korzystając z detektora czułego na położenie, Ti:Sa powinien nakładać się na OPO zgodnie z następującą procedurą:
    1. Ustaw wiązki lasera OPO i Ti:Sa tak, aby obie docierały do mikroskopu.
    2. Umieść czujniki położenia wiązki laserowej w dwóch pozycjach pomiędzy lustrem dichroicznym 1 a lustrem 6, pierwsza pozycja znajduje się w pobliżu lustra dichroicznego 1, a druga znajduje się w pobliżu lustra 6. Dla każdej pozycji użyj czujników, aby wykryć współrzędne x i y wiązki OPO (postępuj zgodnie z Rysunek 1).
    3. Sprawdź, czy współrzędne x i y wiązki laserowej Ti:Sa są takie same OPO w obu pozycjach detektorów czujników. Jeśli w niektórych pozycjach współrzędne Ti:Sa i OPO nie pokrywają się, dostosuj nachylenie sąsiedniego lustra, aby skompensować różnicę (postępuj zgodnie z Rysunek 1).
    4. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby wyrównać pozycje belki Ti:Sa względem OPO dla ścieżki między M6-M7 (postępuj zgodnie z Rysunek 1).
  2. Synchronizacja czasowa wiązek
    1. Zastosowanie szybkiej fotodiody plus oscyloskop:
      1. Zatrzymaj propagację wiązek Ti:Sa i OPO i umieść szybki detektor przed wiązką OPO (pomiędzy M6 i M7).
      2. Podłącz sygnał wyzwalający dostarczany przez skrzynkę laserową Ti:Sa do oscyloskopu w kanale 2.
      3. Połącz przewód detektora z oscyloskopem w kanale 1 i zobrazuj profil czasowy OPO.
      4. Zapisz czas (odcięte) zmierzony przez oscyloskop odpowiadający jego wartości maksymalnej, czyli t1.
      5. Zatrzymaj wiązkę OPO i zwolnij wiązkę Ti:Sa.
      6. Wizualizuj profil czasowy Ti:Sa i zapisz czas (odcięte) odpowiadający jego maksymalnej wartości, czyli t2.
      7. Zminimalizuj różnicę między t1-t2, używając linii opóźniającej, aby nałożyć na siebie dwie wiązki. W naszym przypadku minimalna mierzalna różnica wynosi 10 ps.
      8. Usuń szybki detektor pomiędzy M6 i M7.
    2. Korzystanie z autokorelatora:
      UWAGA: Na schemacie ideowym pokazanym na rysunku 1 zainstalowany jest autokorelator bez ingerencji w ścieżki optyczne wiązek. Ponadto wprowadzane jest dodatkowe zwierciadło i montowane na uchwycie typu flip-flop (określanym jako FFM/AM) pomiędzy M6 i M7 w celu skierowania wiązki do autokorelatora.
      1. Odwróć AM, aby skierować wiązkę do autokorelatora.
      2. Zatrzymaj Ti:Sa i zwolnij OPO.
      3. Ustaw mikrometr regulacyjnej odległości wiązki autokorelatora w pozycji normalnej (8.35 mm).
      4. Włącz kontroler autokorelatora i uruchom aplikację na komputerze osobistym, który go steruje.
      5. Rzutuj wiązkę OPO z FFM/AM na lustro wejściowe do autokorelatora.
      6. Kontroluj punkt odbicia (za pomocą papierowej karty detektora) wiązki w oknie wyrównania autokorelatora.
      7. W przypadku natężenia świateł bezwiązkowych lub mijania należy dostosować położenie i orientację FFM/AM w optymalnym stopniu i spróbować wyregulować lustro wejściowe (zamontowane na autokorelatorze), aby zmaksymalizować sygnał impulsu laserowego. Sygnał autokorelatora uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 5a.
      8. Zatrzymaj OPO i rzutuj wiązkę Ti:Sa z FFM/AM, aby wprowadzić lustro do autokorelatora. Powtórz kroki 3.2.2.6 i 3.2.2.7. Sygnał autokorelatora uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 5b.
      9. Ustaw mikrometr regulacji odległości wiązki w pozycji krzyżowej (7.30 mm).
      10. Zwolnij obie belki.
      11. Zeskanuj linię opóźniającą, aby uzyskać nakładanie się dwóch wiązek OPO i Ti:Sa. Sygnał korelatora krzyżowego uzyskuje się, jak pokazano na rysunku Rysunek 6.
      12. Odwróć lustro FFM/AM tak, aby wiązki mogły dotrzeć do M7 i głowicy skanującej mikroskopu.
  3. Wyrównanie mikroskopu
    1. Wykonaj obserwację mikroskopową w świetle białym:
      UWAGA: Przed obserwacją mikroskopową upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony.
      1. Przygotować próbkę do badań, która składa się z roztworu buforu fosforanowego, w którym rozproszone są kulki polistyrenu o średnicy 3 μm. Roztwór umieszcza się w kanapce składającej się z dwóch szklanych szkiełek.
      2. Włącz mikroskop i zasilanie światłem białym. Postępuj zgodnie z instrukcją obserwacji w białym świetle.
      3. Użyj kondensatora, aby oświetlić próbkę. Użyj celu 60x, aby zebrać światło. Umieścić próbkę na stoliku. Zoptymalizuj ogniskową obiektywu mikroskopu 60x.
      4. Wybierz pole widzenia, które Cię interesuje. Weź obraz CCD próbki (Rysunek 7).
      5. Wyłącz zasilanie białym światłem.
    2. Osiowanie mikroskopu za pomocą femtosekundowych wiązek laserowych: OPO i Ti:Sa
      1. Wyjmij kondensor za pomocą przycisku ucieczki, aby tymczasowo schować soczewkę obiektywu mikroskopu 60x. Przesuń soczewkę obiektywu mikroskopu 60x poza tor optyczny, obracając końcówkę.
      2. Zamontuj detektor w górnej części mikroskopu za pomocą zewnętrznego mocowania mechanicznego. Podłącz wyjście detektora przez filtr dolnoprzepustowy 50Ω do oscyloskopu i monitoruj sygnał OPO.
      3. Włącz procesor sterujący głowicą skanera. Skieruj wiązkę OPO na głowicę skanera mikroskopu.
      4. Sprawdź położenie wiązki wewnątrz mikroskopu, upewnij się, że położenie wiązki znajduje się w środku lub blisko środka.
      5. Sprawdź, czy położenie belki wewnątrz głowicy wyładowań niezupełnych znajduje się pośrodku.
      6. Zmaksymalizuj moc mierzoną przez detektor za pomocą translatora x-y.
      7. Przełącz wiązkę z OPO na Ti:Sa i sprawdź, czy maksymalny sygnał jest uzyskiwany również dla lasera tytanowo-szafirowego. Oznacza to, że obie belki są dobrze wyrównane.
      8. Zakończ wyrównanie wiązki, wprowadzając soczewkę obiektywu mikroskopu 60x i obracając końcówkę do tyłu.
      9. Użyj przycisku zmiany ostrości na mikroskopie, aby odzyskać ostateczną ostrość na obiektywie mikroskopu 60x.
      10. Umieść obiektyw z powiększeniem 40x w miejscu kondensora bez dotykania lub naruszania próbki.
  4. Optymalizacja synchronizacji przestrzennych i czasowych belek
    1. Synchronizacja czasowa
      1. Ustaw moc Ti:Sa i OPO mierzoną przed mikroskopem na 30 mW dla obu wiązek. Ustaw długość fali OPO na inną wartość w stosunku do poprzedniej, aby pompa i sonda nie były w rezonansie z częstotliwością drgań koralików.
      2. Zwolnij obie wiązki (Ti:Sa i OPO), aby weszły do mikroskopu.
      3. Uruchom skomputeryzowany translator linii opóźniającej skanowanie i zapisz zmierzoną intensywność za pomocą LIA dla każdej pozycji linii opóźniającej. Poczekaj, aż skanowanie linii opóźniającej zostanie zakończone. Uzyskany profil czasowy jest wizualizowany w Rysunek 8a.
      4. Ponownie ustaw długość fali OPO na 1076 nm, tak aby pompa i sonda były w rezonansie z częstotliwością drgań koralików. Powtórz krok 3.4.1.3 (uzyskany profil czasowy jest wizualizowany w Rysunek 8b).
      5. Ustaw uzyskaną pozycję wiązki nakładającej się na linii opóźnienia, aby uzyskać obrazy SRS.
    2. Synchronizacja przestrzenna belek
      UWAGA: Obrazy transmisyjne są przydatne do optymalizacji pola widzenia, oświetlenia i położenia ogniskowej obiektywów mikroskopu oraz do sprawdzenia, czy dwie wiązki nakładają się przestrzennie.
      1. Akwizycja obrazu transmisyjnego OPO
        1. Zatrzymaj wiązkę Ti:Sa i zmniejsz moc OPO do 8 mW.
        2. Podłącz odczyt czujki do karty akwizycji danych.
        3. Uruchom program do akwizycji danych wraz z konsolą skanowania mikroskopu.
        4. Zapisz plik i przetwórz dane, aby uzyskać obraz. Surowy obraz wygląda tak, jak pokazano na Rysunek 9a.
      2. Akwizycja obrazu transmisyjnego Ti:Sa
        1. Zatrzymaj wiązkę OPO i zmniejsz moc Ti:Sa do 2,5–4,5 mW.
        2. Połącz czujkę z odczytami LIA i LIA z kartą akwizycji danych.
        3. Powtórz kroki 3.4.2.1.3 i 3.4.2.1.4. Surowy obraz wygląda tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 9b.

4. Akwizycja obrazu SRS

UWAGA: Dedykowany algorytm został zrealizowany w celu przechowywania danych. Obsługuje następujące formaty obrazów: 512 x 512 px i 256 px x 256 px, z czasami akwizycji 16 s, 8 s, 4 s i 2 s.

  1. Wprowadź stos filtrów pomiędzy obiektyw 40x a PD, aby usunąć impulsy pompy (Ti:Sa) i uzyskać tylko sygnał Stokesa (OPO).
  2. Ustaw sygnał pompy na 810 nm z mocą skupioną 8 mW, a sygnał sondy na 1076 nm z mocą skupioną 8 mW, aby zbadać typowe wiązanie C-H polistyrenu (przesunięcie Ramana 3054 cm−1).
  3. Podłącz czujkę z odczytem LIA i LIA do karty akwizycji danych.
  4. Ustaw format pikseli akwizycji obrazu zgodnie z wymaganiami i ustaw czas pozyskiwania.
  5. Uruchom program sterujący sterownikiem mikroskopu.
  6. Uruchom dedykowany program algorytmu, który działa jako synchronizacja między sterownikiem mikroskopu, systemem detekcji i DAQ (patrz Rysunek 4).
  7. Zapisz plik macierzy po zakończeniu akwizycji.
  8. Zaimportuj plik danych RAW i zapisz obraz w wymaganym formacie (zwykle zapisywanym w formacie .tif) za pomocą oprogramowania ImageJ. Obraz jest pokazany w Rysunek 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład pomiaru SRS (tj. pomiaru SRS w pojedynczym punkcie próbki) jest opisany na rysunku 7. Gdy belki nie nakładają się na siebie w czasie lub przestrzeni, uzyskany wynik przedstawiono na rysunku 8a. W rezonansie off-rezonansowym amplituda sygnału mierzona przez LIA wynosi zero, podczas gdy faza sygnału mierzona przez LIA przeskakuje między wartościami ujemnymi i dodatnimi. Natomiast gdy wiązki nakładają się na siebie w przestrzeni, przesuwając linię o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia SRS przeniosła obrazowanie bezznacznikowe na nowy poziom, zwłaszcza w badaniach złożonych struktur biologicznych, takich jak lipidy, które mają fundamentalne znaczenie dla komórek i architektury komórkowej. Lipidy biorą udział w wielu szlakach fizjologicznych, takich jak produkcja błon biologicznych, i służą jako prekursory biosyntezy i przetworniki sygnałów10. Lipidy są pakowane w wyspecjalizowane organelle wewnątrzkomórkowe, zwane również kropelkami lipidów (LD). Ich średnice wahają ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy V. Tufano z IMM CNR za jego cenną pomoc techniczną oraz Giacomo Cozziego, specjalistę ds. produktów z Nikon Instruments, za użyteczne dyskusje i ciągłe wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez włoskie krajowe programy operacyjne PONa3 00025 (BIOforIU) oraz przez zakrojony na szeroką skalę ogólnoeuropejski projekt infrastruktury badawczej Euro-Bioobrazing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Narzędzie do analizydźwięku NikonNikon C2ToolNarzędzie obsługiwane przez technologię Acquisation
Oprogramowanie sterujące łączem impulsowymAPE-APEOprogramowanie do sterowania łączem impulsowymSterowanie
autokorelatoremAPEAPE PulseCheck USB 50Autokorelator
DetektorThorlabsThorlabs DET10A
Karta detektoraThorlabsDetektor podczerwieniThorlabs VRC
Lustro dichroiczneSemrockSemrock FF875-Di01-25X36Lustro dichroiczne
Lustro dichroiczneSemrockFF875-Di01-25x36Lustro dichroiczne
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).Komórka Pockelsa
Szybki detektorThorlabsThorlabs DET025AL/MFotodioda
Szybki skaner lustrzanyNikonC2Głowica skanująca Microscpe
Laser femtosekundowy Ti:SASpójnyKoherentny Kameleon Ultra IIChameleon Ultra II
Generator funkcyjnyTTiTG5011 AIM – Generator funkcyjny
Odwrócony mikroskop optycznyNikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E,
Nikon Lock-in AmplifierStandford Research SystemSR844-200 MHz dwufazowywzmacniacz blokujący A firmy Stanford Research Systems
Filtr wycinający,SemrockNF03-808E-25Filtr wycinający
Optyczny przewód opóźniającyNewportNewport Newport M-ILS200CCPrzestrajalna optyczna linia opóźniająca
Optyczny oscylator parametrycznyKoherentnykoherentny Kompaktowy OPOKoherentny Kompaktowy
oscyloskopWaveRunner640Zi 4GHz OSC/LeCroyOscyloskop
cyfrowy Karta PCI PrzyrządkrajowyNI PCIe 6363Karta do gromadzenia danych
Czujniki położenia DetektoryNewportNewport Conex PSD9Czujnik czujnika położenia
Głowica miernika mocyCoherentPowerMax PM10,Laserowy detektor mocy
Etapy translacjiThorlabsThorlabs PT1/MMechaniczny stolik translacyjny ze standardowym mikrometrem
fotodiody TTi OPO

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
  3. Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407(2014).
  4. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870(2015).
  5. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  6. D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853(2016).
  7. D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
  8. Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317(2018).
  9. Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
  10. Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
  11. Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
  12. Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
  13. Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
  14. Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
  15. Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
  16. Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
  17. Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  18. Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
  19. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  20. Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117(2017).
  21. Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

Related Articles