Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym artykule prezentujemy protokół, który jest zoptymalizowany pod kątem zachowania komórek linii neutrofili w świeżym BM do analizy całego BM CyTOF. Wykorzystaliśmy panel CyTOF z 39 przeciwciałami do pomiaru szpiku do oceny układu krwiotwórczego ze szczególnym uwzględnieniem komórek linii neutrofili przy użyciu tego protokołu. Wynik CyTOF przeanalizowano za pomocą algorytmu redukcji wymiarów o otwartych zasobach, viSNE, a dane przedstawiono w celu zademonstrowania wyniku tego protokołu. Odkryliśmy nowe populacje komórek z linii neutrofili w oparciu o ten protokół. Ten protokół świeżego preparatu całego BM może być wykorzystany do: 1) analizy CyTOF w celu odkrycia niezidentyfikowanych populacji komórek z całego BM, 2) badania całych defektów BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka, 3), wspomagania optymalizacji protokołów cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją, które wykorzystują świeży cały BM.
Wprowadzenie
W ciągu ostatnich kilku dekad, metody cytometryczne były potężnym narzędziem do badania układu krwiotwórczego w BM. Metody te obejmują cytometrię przepływową aktywowaną fluorescencją oraz nową metodę CyTOF wykorzystującą przeciwciała znakowane metalami ciężkimi. Doprowadziły one do odkrycia wielu typów komórek w heterogenicznym próbce biologicznej poprzez identyfikację ich unikalnych profili ekspresji markerów powierzchniowych. Zwiększone nakładanie się widma, które jest związane z większą liczbą kanałów, prowadzi do większej niedokładności danych w zastosowaniach cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją. Dlatego niechciane komórki są rutynowo usuwane w celu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty były zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla, a zgodę na stosowanie gryzoni uzyskano od Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla zgodnie z kryteriami określonymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych z National Institutes of Health.
1. Żniwo szpiku kostnego myszy (BM)
- Kup myszy C57BL/6J od komercyjnego dostawcy. Karm standardową dietę gryzoni i trzymaj w klatkach z mikroizolatorami w obiekcie wolnym od patogenów.
- Użyj samców myszy w wieku 6-10 tygodni do celów eksperymentalnych. Eutanazja przez wd....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia przykładowy wynik eksperymentów CyTOF. Na tym wykresie tSNE komórki z wielu tkanek mysich zostały pogrupowane w podzbiory na podstawie podobieństwa profili ekspresji markerów powierzchniowych, zmierzonych za pomocą 33-parametrowego panelu CyTOF. Komórki o bardziej zbliżonych właściwościach zostały automatycznie zgrupowane razem, takie jak neutrofile, makrofagi lub komórki DC, w oparciu o ekspresję 33 markerów w każdej komórce.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W minionych dziesięcioleciach cytometria przepływowa oparta na fluorescencji była stosowana jako główna metoda badania linii komórkowych i heterogeniczności 1,2,3. Chociaż cytometria przepływowa dostarczyła danych wielowymiarowych, metoda ta jest ograniczona przez wybór parametrów i nakładanie się spektralne. Aby przezwyciężyć słabość cytometrii przepływowej, wykorzystaliśmy CyTOF, który wykorzystuje izotopy metali ciężkich zami.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować rdzeniowi LJI Flow Cytometry za pomoc w procedurze cytometrii masowej. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01HL134236, P01HL136275 i R01CA202987 (wszystkie dla C.C.H) oraz ADA7-12-MN-31 (04) (dla C.C.H. i Y.P.Z).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CyTOF Antibodies (mysz) | |||
| Anti-Mouse CD45 (klon 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human / Mouse CD45R/B220 (klon RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat # 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-Mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-Mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-Mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-Mouse CD16.2 (Fcγ RIV) (Klon 9E9)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (klon 4RA10 (RUO))-Oczyszczony | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-Mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-Mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-Mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-Mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-Mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anty-mysz CD41 (klon MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-Mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-Mouse CD71 (Clone RI7217)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-Mouse CD90 (Clone G7)-Oczyszczony | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm Cat | # 3159009B | |
| Anti-Mouse Fcε RI&alfa; (Klon MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anty-mysz GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Oczyszczony | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (klon B56 (RUO))-Oczyszczony | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Oczyszczony | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anty-mysz Ly-6G (klon 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (klon PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (klon E50-2440 (RUO))-Oczyszczony | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anty-Mysz TCRβ (Klon H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Klon H57-597)-143Nd | |
| Anty-mysie TER-119 / Komórki erytroidalne (Klon TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane | |||
| Stabilizator przeciwciał | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x bufor | do lizy RBCThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnego | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Płodowa surowica bydlęca | Omega Scientific Cat | # FB-02 | |
| HyClone Fosforan Buforowany roztwór soli GE | Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| Zestawy do znakowania przeciwciał MAXPAR | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Azydek | soduSigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Model eksperymentalny: Organizm/Szczepy | |||
| Mysz: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Numer magazynowy: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalizator na bazie koralików | Finck i wsp., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen i wsp., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten i Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Bibliografia
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
