Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Każdy mRNA poxwirusa transkrybowany po replikacji DNA wirusa ma ewolucyjnie zachowanego, nieszablonowego lidera 5'-poli(A) w 5'-UTR. Aby przeanalizować rolę lidera 5'-poli(A) w translacji mRNA podczas infekcji pokswirusem, opracowaliśmy test reporterowy lucyferazy oparty na transkrypcji RNA in vitro. Ten test reporterowy składa się z czterech podstawowych etapów: (1) PCR w celu amplifikacji matrycy DNA do transkrypcji in vitro; (2) transkrypcja in vitro w celu wytworzenia mRNA przy użyciu polimerazy RNA T7; (3) Transfekcja w celu wprowadzenia do komórek transkrybowanego mRNA in vitro; (4) Wykrywanie aktywności lucyferazy jako wskaźnika translacji. Opisany tutaj test reporterowy lucyferazy oparty na RNA omija problemy z replikacją plazmidu w komórkach zakażonych pokswirusem i tajemniczą transkrypcją z plazmidu. Protokół ten może być wykorzystany do określenia regulacji translacji przez elementy cis w mRNA, w tym 5'-UTR i 3'-UTR w systemach innych niż komórki zakażone wirusem ospy. Co więcej, za pomocą tej metody można badać różne tryby inicjacji translacji, takie jak zależna od cap, niezależna od cap, reinicjacja i inicjacja wewnętrzna.
Wprowadzenie
Zgodnie z centralnym dogmatem, informacja genetyczna przepływa od DNA do RNA, a następnie do białka1,2. Ten przepływ informacji genetycznej jest wysoce regulowany na wielu poziomach, w tym translacji mRNA3,4. Opracowanie testów reporterowych do pomiaru regulacji ekspresji genów ułatwi zrozumienie mechanizmów regulacyjnych związanych z tym procesem. Tutaj opisujemy protokół badania translacji mRNA przy użyciu testu reporterowego lucyferazy opartej na transkrypcji RNA in vitro w komórkach zakażonych wirusem ospy.
Poxwirusy zaw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie matrycy DNA metodą PCR do transkrypcji in vitro
- Aby przygotować matrycę DNA metodą PCR, zaprojektuj startery. Podczas projektowania podkładów należy wziąć pod uwagę kluczowe cechy, takie jak długość podkładu, temperatura wyżarzania (Tm), zawartość GC, koniec 3' z G lub C itp.
nuta: Szczegółowo omówione w tej literaturze25,26,27. - Zaprojektuj startery do generowania amplikonu PCR zawierającego następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': promotor T7, lider poli(A), lucyferazy świetli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Cztery etapy testu reporterowego lucyferazy opartego na RNA transkrybowanym in vitro: PCR w celu wygenerowania matrycy DNA do transkrypcji in vitro, transkrypcja in vitro w celu otrzymania mRNA, transfekcja mRNA oraz pomiar aktywności lucyferazy, zostały przedstawione na schemacie (Rycina 1). Projektowanie starterów dla obu matryc DNA (Fluc i Rluc) oraz ogólny schemat PCR z rozszerzeniem nawisów (overhang extension PCR) zilustrowano na schemacie (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszystkie cztery podstawowe etapy mają kluczowe znaczenie dla powodzenia testu reporterowego lucyferazy opartej na transkrypcji RNA in vitro. Szczególną uwagę należy zwrócić na konstrukcję startera, zwłaszcza dla sekwencji promotora T7. Polimeraza RNA T7 rozpoczyna transkrypcję od podkreślonego pierwszego G (GGG-5'-UTR-AUG-) w promotorze T7 dodanym przed sekwencją 5'-UTR. Chociaż miejsce rozpoczęcia transkrypcji (TSS) zaczyna się od pierwszego G na końcu 5', zmniejszenie liczby G mniej niż trzech w regionie promot.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy pragną zadeklarować brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) dla ZY i częściowo przez Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) w formie Graduate Student Summer Stypendend dla PD.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | Polimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana w PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog lub ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area biała mikropłytka polistyrenowa z płaskim dnem Corning | 3693 | Nieprzezroczysta 96-dołkowa biała płytka z solidnym dnem | |
| System testów reporterowych z podwójną lucyferazy | Promega | E1960 | Zestaw do testowania podwójnej lucyferazy (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit Zestaw | PCR OMEGA BIO-TEK | D6492 | Luminometr mikropłytkowy |
| GloMax Navigator | Promega | GM2010 | Określany jako luminometr wielomodowy |
| HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności | England Biolabs | E2050S | In Zestaw do transkrypcji in vitro |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Kationowy odczynnik do transfekcji lipidów |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Służy do pomiaru stężenia DNA i RNA |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Zredukowane podłoże surowicy |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Zestaw do oczyszczania RNA |
| System zamykania krowianki System zamykania | New England Biolabs | M2080 |
Bibliografia
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
