Artykuł metodologiczny

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59628

⸱

21 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science and Research Institute for Bioscience & Biotechnology, Hallym University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które są znane z modulacji licznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w wielu chorobach, w tym nowotworach. Te małe regulatorowe RNA oddziałują głównie z nieulegającymi translacji regionami 3' (3' UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), co ostatecznie prowadzi do zahamowania procesów dekodowania mRNA i zwiększenia docelowych degradacji mRNA. W oparciu o poziomy ekspresji i funkcje wewnątrzkomórkowe, miRNA mogą służyć jako czynniki regulacyjne onkogennych i supresyjnych nowotworów mRNA. Identyfikacja bona fide docelowych genów miRNA wśród setek, a nawet tysięcy obliczeniowo przewidywanych celów jest kluczowym krokiem w kierunku rozpoznania ról i podstawowych mechanizmów molekularnych miRNA będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępne są różne programy do przewidywania celu miRNA w celu wyszukiwania możliwych interakcji miRNA-mRNA. Jednak najtrudniejszym pytaniem jest to, jak zweryfikować bezpośrednie geny docelowe interesującego nas miRNA. Protokół ten opisuje powtarzalną strategię kluczowych metod identyfikacji celów miRNA związanych z funkcją miRNA. Protokół ten przedstawia praktyczny przewodnik po procedurach krok po kroku w celu odkrycia poziomów miRNA, funkcji i powiązanych docelowych mRNA przy użyciu opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowaniu krzywej dawka-odpowiedź i teście lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, co jest niezbędne do prawidłowego zrozumienia ról poszczególnych miRNA.

Wprowadzenie

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które głównie modulują proces translacji i degradacji informacyjnych RNA (mRNA) poprzez reakcję na nietranslowane regiony 3' (3' UTR) w bona fide docelowych genach1. Ekspresja miRNA może być regulowana przez mechanizmy transkrypcyjne i potranskrypcyjne. Brak równowagi takich mechanizmów regulacyjnych powoduje niekontrolowane i charakterystyczne poziomy ekspresji miRNA w wielu chorobach, w tym nowotworach2. Pojedyncze miRNA może mieć wiele interakcji z różnymi mRNA. W związku z tym pojedyncze mRNA może być kontrolowane przez różne miRNA. W związku z tym wewnątrzkomórkowe sieci sygnalizacyjne są pod silnym wpływem wyraźnie wyrażonych miRNA, które mogą inicjować i pogarszać fizjologiczne zaburzenia i choroby2,3,4,5,6. Chociaż zmienioną ekspresję miRNA zaobserwowano w różnych typach nowotworów, mechanizmy molekularne, które modulują sposoby działania komórek rakowych w połączeniu z miRNA, są nadal w dużej mierze nieznane.

Coraz więcej dowodów pokazuje, że onkogenne lub tłumiące nowotwory role miRNA zależą od typów nowotworów. Na przykład, celując w skrzynkę widełkową o3 (FOXO3), miR-155 promuje proliferację komórek, przerzuty i chemooporność raka jelita grubego7,8. W przeciwieństwie do tego, ograniczenie inwazji komórek glejaka jest indukowane przez miR-107 poprzez regulację neurogennego białka homologicznego locus notch 2 (NOTCH2) expression9. Ocena interakcji miRNA-cel w związku z funkcjami miRNA jest nieodzowną częścią lepszego zrozumienia, w jaki sposób miRNA regulują różne procesy biologiczne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym10. Ponadto odkrycie celów miRNA w dobrej wierze może dodatkowo zapewnić precyzyjną strategię terapii opartej na miRNA różnymi lekami przeciwnowotworowymi. Jednak głównym wyzwaniem w dziedzinie miRNA jest identyfikacja bezpośrednich celów miRNA. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe metody jako powtarzalne podejścia eksperymentalne do oznaczania docelowego genu miRNA. Udany projekt eksperymentalny identyfikacji celu miRNA obejmuje różne etapy i rozważania (Rysunek 1). Porównanie poziomów dojrzałych miRNA w komórkach nowotworowych i normalnych komórkach może być jedną z powszechnych procedur wyboru interesującego miRNA (Figura 1A). Badanie funkcjonalne wybranego miRNA w celu wykrycia wpływu miRNA na proliferację komórek jest ważne, aby zawęzić listę najlepszych potencjalnych celów miRNA będącego przedmiotem zainteresowania (Figura 1B). W oparciu o eksperymentalnie potwierdzone funkcje miRNA, wymagany jest systematyczny przegląd literatury i bazy danych w połączeniu z programem przewidywania celu miRNA w celu wyszukania najistotniejszych informacji na temat funkcji genów (Rysunek 1C). Identyfikację prawdziwych genów docelowych miRNA można osiągnąć, wdrażając eksperymenty, takie jak test lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, PCR w czasie rzeczywistym i western blotting (Figura 1D). Celem obecnego protokołu jest zapewnienie kompleksowych metod kluczowych eksperymentów, opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowania krzywej dawka-odpowiedź oraz testu lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu. Obecny protokół może być przydatny do lepszego zrozumienia funkcji poszczególnych miRNA i implikacji miRNA w terapii raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Analiza ekspresji dojrzałego mikroRNA (miRNA)

  1. Synteza komplementarnego DNA (cDNA) dojrzałych miRNA
    1. Do probówek paskowych do PCR dodać 254 ng całkowitego RNA oraz 4,5 µL mieszaniny odwrotnej nukleazy I (DNase I), a następnie uzupełnić objętość do 18 µL wodą ultrapure (Rysunek 2A). Przygotować reakcję dla każdej próbki całkowitego RNA oczyszczonego z kilku linii komórkowych, stosując odpowiednią ilość mieszaniny DNase I w zależności od całkowitej liczby reakcji.
      UWAGA: Mieszaniny DNase I składają się z DNase I (1,8 µL), inhibitora rybonukleazy (0,3 µL) oraz 25 mM MgCl2 (2,4 µL). W celu powtarzalnego pozyskiwania całkowitego RNA zastosowano metodę ekstrakcji kolumnowej zamiast metody ekstrakcji opartej na fenolu i chloroformie. Doniesiono, że wydajność ekstrakcji niektórych miRNA może się różnić w zależności od liczby komórek przy zastosowaniu metody ekstrakcji opartej na fenolu i chloroformie11,12.
    2. Inkubować probówki w termocyklerze. Prowadzić inkubację przez 10 min w 37 °C, a następnie dezaktywować termicznie DNase I poprzez 5 min inkubacji w 90 °C. Natychmiast po inkubacji umieścić probówki na lodzie.
    3. Przenieść 7,1 µL całkowitego RNA traktowanego DNase I do dwóch zestawów nowych probówek, a następnie dodać 1,5 µL starterów antysensownych dla genu dehydrogenazy glikolowej-3-fosforanu (GAPDH) (Rysunek 2B).
      UWAGA: Ilość całkowitego RNA do syntezy cDNA na tym etapie wynosi 100 ng. Stężenie zapasowe starterów antysensownych GAPDH wynosi 10 µM. Dodanie starterów antysensownych GAPDH służy do generowania cDNA GAPDH przy użyciu metody z starterem specyficznym dla genu.
    4. Inkubować probówki w termocyklerze. Rozpocząć od 80 °C przez 5 min, a następnie prowadzić reakcję w 60 °C przez 5 min. Natychmiast po inkubacji umieścić probówki na lodzie.
    5. Do każdej reakcji dodać 3,4 µL mieszaniny enzymów do odwrotnej transkrypcji (RT) (Rysunek 2B). Mieszaniny enzymów RT składają się z 100 mM doksyrybonukleotydów trifosforanowych (0,15 µL), 10x buforu RT (1,5 µL), inhibitora rybonukleazy (0,75 µL) oraz enzymu odwrotnej transkrypcji (1 µL). Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny w zależności od całkowitej liczby reakcji.
    6. Do każdej reakcji dodać 3 µL 5x starterów RT dla specyficznego miRNA (Rysunek 2B).
      UWAGA: Objętość całkowita dla każdej reakcji wynosi 15 µL.
    7. Prowadzić reakcję w termocyklerze. Rozpocząć od 16 °C przez 30 min, następnie 42 °C przez 30 min i na koniec 85 °C przez 5 min. Przechowywać w 4 °C do czasu zakończenia prac (Rysunek 2B). Na tym etapie w jednej probówce generowane są jednoniciowe cDNA zarówno dla specyficznego miRNA, jak i dla genu GAPDH.
  2. Reakcja polimerazy łańcuchowej (PCR) w czasie rzeczywistym i analiza danych
    1. Rozcieńczyć każde cDNA wodą ultrapure w stosunku 1:49.
    2. Przygotować mieszaniny reakcyjne dla specyficznego miRNA i GAPDH (Tabela 1). W celu detekcji specyficznego miRNA i GAPDH przygotować reakcje w trzech powtórzeniach dla każdej próbki cDNA.
    3. Przeprowadzić real-time PCR i analizę danych (Rysunek 2C). Analizować dane przy użyciu porównawczej metody CT13,14.

2. Transfekcja mimiku mikroRNA (miRNA)

UWAGA: W kroku 1 wybrano miRNA-107. Ponieważ miRNA-107 jest wyciszone w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami prawidłowymi, można przypuszczać, że miRNA-107 jest miRNA o działaniu supresorowym. W przypadku miRNA, które wykazuje nadekspresję w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami prawidłowymi (np.. miRNA-301), w krokach 2, 3 i 4 można zastosować oligosomery antysensowne przeciwko miRNA-301.

  1. Policz komórki za pomocą komory liczbowej, a następnie wysiej je na płytkę 96-dołkową. Gęstość komórek wynosi 2 x 103 komórek/100 µL na każdy dołek. Nie należy używać pożywek do hodowli komórkowej zawierających penicylinę i streptomycynę (P/S), ponieważ P/S może obniżyć wydajność transfekcji.
  2. Przygotuj zestaw mieszanin do transfekcji, aby następnego dnia przeprowadzić transfekcję komórek przy kilku końcowych stężeniach kontrolnego mimiku miRNA oraz mimiku miRNA-107 (Rysunek 3).
    1. Z roztworu zapasowego (stężenie 25 μM) kontrolnego mimiku miRNA lub mimiku miRNA-107, rozcieńcz i dodaj odpowiednią ilość kontrolnego mimiku lub mimiku miRNA-107 do pożywki z obniżoną zawartością surowicy wraz z odczynnikiem do transfekcji, korzystając z probówek do mikrowirówki (Rysunek 3A). Delikatnie wymieszaj mieszaniny zawierające oligonukleotydy za pomocą mikropipety. Całkowita ilość oligonukleotydów (kontrolny mimik miRNA + mimik miRNA-107) powinna być taka sama w każdym dołku. Dołki kontrolne (blank) zawierają 100 µL pożywki do hodowli komórkowej oraz pożywkę z obniżoną zawartością surowicy zawierającą odczynnik do transfekcji, bez komórek.
  3. Po 10-minutowej inkubacji w komorze do hodowli komórkowej ponownie delikatnie wymieszaj mieszaniny zawierające oligonukleotydy, a następnie dodaj 50 μL mieszaniny do każdego dołka. Przechowuj transfekowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej. Po 6-12 h inkubacji wymień pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji na świeżą pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą zarówno płodową surowicę bydlęcą (FBS), jak i P/S. Inkubuj komórki przez kolejne 72 h. Całkowity czas działania mimiku miRNA wynosi 96 h.

3. Test sulforodaminą B (SRB)

  1. Fiksacja komórek
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z każdego dołka płytki i niezwłocznie wlać do każdego z nich 100 μL 10% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Ostrożnie odessać pożywkę z każdego dołka, aby uniknąć uszkodzenia komórek i ich odklejenia od dna.
      UWAGA: Przygotować 40% TCA, dodając 20 g proszku TCA do 50 mL wody destylowanej. Z 40% TCA przygotować 10% TCA poprzez rozcieńczenie 40% TCA wodą destylowaną w stosunku 1:3.
    2. Przechowywać płytkę zawierającą 10% TCA w lodówce (4 °C) przez 1 h.
    3. Przemyć płytkę kilka razy, zanurzając ją w kuwecie z wodą, a następnie osuszyć. Usunąć nadmiar wody z wnętrza dołków, opukując płytkę, aż w dołkach nie zostanie woda. Pozostawić płytkę na blacie laboratoryjnym do wyschnięcia przed przejściem do następnego kroku.
  2. Barwienie komórek
    1. Pipetować 50 μL 0,4% roztworu SRB do każdego dołka, w tym do dołków kontrolnych (blank). Delikatnie potrząsnąć płytką, aż 0,4% roztwór SRB równomiernie pokryje dno dołków.
      UWAGA: Przygotować i użyć 0,4% roztworu SRB, dodając 0,4 g proszku SRB do 100 mL 1% kwasu octowego. Ostrożnie wstrząsnąć roztworem w celu wymieszania. Butelkę z 0,4% roztworem SRB owinąć materiałem chroniącym przed światłem, np. folią aluminiową. Przechowywać 0,4% roztwór SRB w lodówce.
    2. Po inkubacji od 40 min do 60 min przemyć płytkę, płucząc ją 1% kwasem octowym. Myć płytkę do momentu całkowitego usunięcia niezwiązanego barwnika (Rysunek 3B).
    3. Pozostawić płytkę na blacie laboratoryjnym do wyschnięcia przed przejściem do następnego kroku.
      UWAGA: Płytka powinna być całkowicie sucha przed przejściem do kroku 3.3.
  3. Pomiar absorbancji
    1. Pipetować 100 μL roztworu zasady Tris (10 mM) do odpowiednich dołków, w tym do dołków kontrolnych (blank). Pozostawić płytkę na wytrząsarce przez 10 min. Zmierzyć absorbancję przy 492 nm.

4. Tworzenie krzywej zależności efektu od dawki

  1. Przeanalizuj dane z testu SRB w arkuszu kalkulacyjnym. Odejmij wartość absorbancji tła od wartości absorbancji każdej grupy, a następnie oblicz średnią (AVE) oraz odchylenie standardowe (STD) wartości absorbancji dla każdej grupy.
  2. Oblicz procent średniej absorbancji (AVE%) oraz procent odchylenia standardowego (STD%) dla każdej grupy, wykorzystując wartości absorbancji z testu SRB.
    UWAGA: Wartość AVE% dla grupy traktowanej kontrolnym mimikiem miRNA wynosi 100%. Oblicz STD%, korzystając z następującego wzoru: STD% = (STD każdej grupy / AVE absorbancji grupy traktowanej kontrolnym mimikiem) x 100.
  3. Zaimportuj surowe dane, w tym stężenia czynnika traktującego, AVE% oraz STD%, do oprogramowania, ustawiając te dane w pionowych kolumnach. Ponieważ logarytm z 0 nie jest zdefiniowany, ustaw pierwsze stężenie na osi X na wartość bliską 0 (np.., 0.01).
  4. Kliknij Utwórz wykres karta i wybierz Proste słupki błędu dla wykresów punktowychWybierz Kolumny arkusza roboczego jako wartości symboli i kliknij DalejW panelu formatu danych wybierz pary XY i kliknij NastępnyWybierz odpowiednie kolumny danych w panelu wyboru danych. Kliknij Zakończ przycisk służący do utworzenia wykresu.
    UWAGA: Oś X reprezentuje stężenia, oś Y wskazuje procent średniej absorbancji dla każdego stężenia (AVE%), a słupki błędów określają procent odchylenia standardowego dla każdego stężenia (STD%).
  5. Kliknij dwukrotnie oś X, aby zmodyfikować typ skali oraz skalowanie osi. Zmień typ skali z liniowej na logarytmiczną. Zmień wartości początkowe i końcowe zakresu odpowiednio na 0,01 i 200.
  6. Kliknij prawym przyciskiem myszy na dowolnym wykresie rozrzutu, wybierz opcję Curve fit (Dopasowanie krzywej), a następnie przejdź do podkategorii User-defined (Zdefiniowane przez użytkownika). Wybierz Dose-response curve (Krzywa dawka-odpowiedź), klikaj przyciski Next (Dalej), a następnie kliknij przycisk Finish (Zakończ). Krzywa dawka-odpowiedź została teraz wygenerowana wraz z kartą raportu (Rycina 4A).
    1. Aby wprowadzić równanie 1 do oprogramowania w celu wygenerowania krzywej dawka-odpowiedź, kliknij przycisk Analiza przejdź do karty i zaznacz Kreator regresjiPrzejdź do Zdefiniowany przez użytkownika w kategorii równanie, a następnie kliknij Nowy przycisk. Wprowadź Równanie 1, zmienne, parametry początkowe i ograniczenia do odpowiednich pustych pól (Rycina 4B, C). Kliknij Dodać jako przycisk i ustaw nazwę równania jako Krzywa zależności dawka-odpowiedźNazwa równania jest teraz generowana w podkategorii Zdefiniowany przez użytkownika w kategorii równań. f oznacza procent żywotności komórek (% żywotności komórek) w równaniu 1.

Równanie 1
Wzór matematyczny f=(y0-R)(1-(x^n/(k^n+x^n)))+R w kontekście równania stanu równowagi statycznej.

  1. Przejdź do karty raportu, a następnie sprawdź wartości n, k oraz R.
    UWAGA: y0 oznacza 100% żywotności komórek w grupie traktowanej kontrolnym mimikiem miRNA, n oznacza współczynnik typu Hilla (nachylenie wykresu), k oznacza stężenie mimiku miRNA-107 wywołujące 50% maksymalnego efektu mimiku miRNA-107 (półmaksymalne stężenie hamujące, IC50), a R oznacza pozostałą frakcję niepodatną (frakcję oporną)15. Równanie użyte do wygenerowania krzywej zależności dawka-odpowiedź uznaje zakres od y0 do wartości R (jeśli występuje) za 100% (Rysunek 4A). W związku z tym konieczne jest uzyskanie skorygowanej wartości k (IC50), obliczanej w oparciu o zakres od y0 do wartości zero (Rysunek 4A). Skorygowaną wartość k (IC50) wraz z innymi wartościami ICx (np.. od IC10 do IC90) można uzyskać za pomocą równania 2, które pochodzi z równania 1. Wyprowadzenie równania 2 z równania 1 przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.

Równanie 2
Równanie równowagi statycznej, x=k*(sqrt((y0-f)/(f-R)))<sup>n</sup>; ilustracja wzoru.

  1. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w komórce, w której zastosowano równanie 2. Wykorzystując równanie 2 oraz parametry z wygenerowanej krzywej zależności dawka-odpowiedź, można obliczyć skorygowane wartości ICx, w zakresie od IC10 do IC90 (Rysunek 4D).
  2. Wpisz w komórce znak równości, a następnie formułę rozpoczynającą się od nawiasu. Podczas wprowadzania formuły ustal wartości n, k i R jako bezwzględne odwołania do komórek, dodając znak dolara do odpowiadającego im kolumny i wiersza, aby stałe wartości te nie zmieniły się podczas automatycznego kopiowania formuły w dół wierszy (Rysunek 4D). Alternatywnie, skorygowane wartości można obliczyć ręcznie za pomocą równania 2.
    UWAGA: Wartość IC90 nie jest wyznaczana, gdy wartość R jest większa niż 10. Ponadto, jeśli wartość R przekracza 20, nie wyznacza się również wartości IC80 (Rysunek 4D).

5. Weryfikacja bezpośredniego genu docelowego interesującego mikroRNA

UWAGA: Po przeprowadzeniu eksperymentu funkcjonalnego, takiego jak test SRB, potwierdzono, że miRNA-107 jest miRNA supresorowym i jest wysoce prawdopodobne, że miRNA-107 bezpośrednio celuje w onkogeny. Należy sprawdzić listę wszystkich przewidywanych genów docelowych za pomocą programu do przewidywania celów miRNA, takiego jak TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), a następnie zawęzić listę do potencjalnych kandydatów na cele w oparciu o funkcję genu w bazach danych, takich jak PubMed i GeneCards.

  1. Projektowanie starterów do klonowania 3' niekodującej regionu (UTR)
    1. Wpisz nazwę genu w serwisie GeneCards (https://www.genecards.org/) i kliknij Symbol genu. Przejdź do przeglądarki genomu Ensembl, klikając Identyfikator Ensembl genu, a następnie kliknij ID transkrypcji w tabeli transkrypcji. Następnie kliknij Eksony istniały w Wyświetlacze oparte na transkryptach lista po lewej stronie.
    2. Skopiuj sekwencje nukleotydowe 3’ UTR i wklej je do programu do projektowania starterów. Ponownie skopiuj sekwencje z tego programu i wklej je do edytora tekstu. Sprawdź obecność sekwencji wiązania miRNA oraz obecność miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych wykorzystywanych do klonowania.
      UWAGA: Jeśli w obrębie 3' UTR nie występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, enzymy restrykcyjne wybrane do klonowania mogą zostać wykorzystane w kolejnym etapie.
    3. W programie do projektowania starterów wprowadź sekwencje 3’ UTR i przystąp do projektowania starterów forward i reverse zgodnie z następującymi parametrami. Długość: 20–30 nukleotydów, Tm: 45–58 °C, zawartość GC: 40-60%. Różnica między wartościami Tm obu starterów powinna być mniejsza niż 5 °CSekwencje starterów użytych w niniejszym badaniu zostały podane w Rycina uzupełniająca 2Do zaprojektowanych starterów należy dodać sekwencje rozpoznawania enzymów restrykcyjnych oraz 4 losowe nukleotydy.
  2. Gradientowa PCR
    1. Przygotuj 25 µL mieszanin reakcyjnych PCR zawierających zaprojektowane primery dla jednej temperatury przyłączania (Tabela 2). Przygotować odpowiednią ilość mieszanin, bazując na całkowitej liczbie reakcji. Wymieszać roztwór poprzez pipetowanie, a następnie dodać 25 µL mieszanin reakcyjnych do każdej probówki. Wiruj probówki przez kilka sekund.
    2. Przeprowadź 35–40 cykli PCR, od etapu denaturacji do etapu elongacji. Ustaw cykl PCR zgodnie z następującymi krokami: 98 °C przez 1 min (1 cykl, etap aktywacji polimerazy), 95 °C przez 10 s (etap denaturacji), 45 °C-68 °C przez 30 s (etap przyłączania), 68 °C (etap elongacji, 10 s–1 min na 1000 bp), 68 °C przez 3 min (etap przerwania reakcji), a następnie schłodzić do 4 °C.
    3. Produkty PCR należy poddać elektroforezie i sprawdzić obecność prążków na 1% żelu agarozowym z użyciem markerów wielkości DNA. Należy wyznaczyć optymalną temperaturę przyłączania (Rycina 5A). Ponownie przeprowadzić amplifikację 3’ UTR genu, stosując optymalną temperaturę przyłączania dla następnego etapu.
  3. Podwójne trawienie
    1. Przygotować w probówce mieszaniny reakcyjne zawierające dwie enzymy restrykcyjne, XhoI (lub AsiSI) oraz NotI (Tabela 3). Inkubować mieszaniny przez 3-4 h w łaźni wodnej (37 °C).
    2. Produkty podwójnego trawienia należy rozdzielić w 1% żelu agarozowym, a następnie wyciąć prążki w świetle UV. W przypadku wektorów lucyferazy, przed nałożeniem na żel, należy poddać wektory poddane podwójnemu trawieniu reakcji z 10 U fosfatazy alkalicznej przez kolejną 1 h, aby zapobiec recyrkularyzacji podczas etapu ligacji.
    3. Oczyść produkty PCR poddane podwójnemu trawieniu oraz wektory lucyferazy z wyciętych prążków.
  4. Ligacja produktów PCR do wektorów lucyferazy
    1. Wykonaj 20 μL mieszanin reakcyjnych ligacji zawierających ligazę DNA (Tabela 4).
      UWAGA: Stosunek molowy produktu PCR (insertu) do wektora lucyferazy może wynosić 3:1, 1:1 lub 2:1.
    2. Krótko wiruj probówkę przez 10–15 s, a następnie inkubuj w temperaturze 16 °C przez noc w termocyklerze.
      UWAGA: Alternatywnie probówkę można inkubować w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni w celu przeprowadzenia ligacji. Na tym etapie insert PCR zostanie sklonowany do regionu położonego poniżej genu reporterowego renilli (Rycina 5B). Wiązanie cząsteczek miRNA do sklonowanej 3’ UTR genu może prowadzić do spadku aktywności lucyferazy renilla. Lucyferaza świetlika służy do normalizacji poziomów ekspresji lucyferazy renilla.
  5. Transformacja i PCR kolonii
    1. Dodaj mieszaniny ligacyjne (3-5 μL) do probówki zawierającej komórki kompetentne. Delikatnie opukać probówkę i przechowywać w lodzie (20 min).
      UWAGA: Przed dodaniem mieszanin ligacji należy rozmrozić kompetentne komórki na lodzie.
    2. Szybko i ostrożnie przenieś probówkę do bloku grzewczego. Po szoku termicznym (42 °C (przez 30 s – 1 min), a następnie umieścić probówkę w lodzie na 20 min.
    3. Wysiewamy komórki kompetentne na płytkę z agarem Luria-Bertani (LB). Inkubujemy komórki kompetentne w inkubatorze (37 °C) przez noc.
      UWAGA: Ampicylina (50-100 µg/mL) znajduje się na płytce agarowej.
    4. Wybrać pojedynczą kolonię i zawiesić E. coli do jednej z probówek w 8-probówkowej pasku zawierających wodę ultrapure. Powtórz ten krok, aby resuspender E. coli z losowo wybranych 4–8 kolonii (Rycina 5C).
    5. Transfer 25 μL z E. coli suspensję do kolejnego zestawu probówek 8-pasmowych. W tej chwili dostępne są 2 zestawy probówek zawierających E. coli zawiesina
      UWAGA: Jedna probówka służy do kolonialnej reakcji PCR, a druga do inokulacji. E. coli zawiesinę do inokulacji można przechowywać tymczasowo w 4 °C (Rycina 5C).
    6. Przeprowadź reakcję colony PCR, wykorzystując E. coli zawiesinę. Krok ten służy do określenia, czy kolonie zawierają insert. Należy wybrać najlepsze kolonie do inokulacji i wyizolować wektory lucyferazy zawierające 3' UTR genu (Rysunek 5C).
      UWAGA: Powtórz kroki 5.1–5.5 dla każdego 3' UTR wybranych genów. Postępuj zgodnie z warunkami reakcji PCR przedstawionymi w Tabela 2 poprzez zastąpienie DNA genomicznego przez E. coli suspensja
  6. Test lucyferazowy
    1. Przygotuj płytkę 24-dołkową. Użyj 1-2 x 104 komórki w 500 μL pożywka do hodowli komórkowych do każdego dołka. Do transfekcji nie należy używać pożywek do hodowli komórkowej zawierających P/S, ponieważ ich zastosowanie może obniżyć wydajność transfekcji.
    2. Przetransfekuj 50 ng wektorów lucyferazy do komórek z mimikiem kontrolnym lub specyficznym mimikiem miRNA, używając odczynnika do transfekcji (Rysunek 5D). W przypadku badania efektów konkretnego mimiku miRNA w więcej niż jednym stężeniu, należy zachować taką samą całkowitą ilość oligosów w każdej studzience (patrz krok 2).
    3. Następnego dnia należy dwukrotnie przemyć wnętrze dołków solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
    4. Zastosuj 200 μL odczynnika lizującego do dołków i przeprowadzić pełną lizę komórek przed pomiarem aktywności lucyferazy.
      UWAGA: Pozostaw płytkę na inkubatorze z wytrząsaniem przez co najmniej 15 min.
    5. Przenieś 5-10 μL lizatu komórkowego do nowej probówki i dodaj 100 μL odczynnika I. Roztwór należy natychmiast wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie zmierzyć aktywność lucyferazy świetlika za pomocą luminometru.
      UWAGA: Odczytaj aktywność lucyferazy świetlika przez 10–15 s.
    6. Dodaj 100 μL odczynnika II do tej samej probówki, a następnie wymieszać poprzez dwukrotne pipetowanie. Odczytać aktywność lucyferazy Renilla przez 10–15 s przy użyciu luminometru. Powtórzyć kroki 5.6.5 i 5.6.6 dla każdej próbki.
    7. Oblicz stosunek renilli do świetlika (Rysunek 5E).
      UWAGA: Aktywność lucyferazy świetlika odzwierciedla wydajność transfekcji konstruktów lucyferazy do komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne i dokładne potwierdzenie poziomów miRNA jest istotne dla interpretacji danych, na podstawie których możliwa jest klasyfikacja miRNA w oparciu o ich przewidywaną rolę w rozwoju i progresji choroby. Poziomy miRNA-107 i miRNA-301 zmierzono w trzech liniach komórkowych trzustki przy użyciu ilościowej PCR z zastosowaniem sond. Synteza cDNA zarówno specyficznego miRNA, jak i genu referencyjnego w jednej reakcji może zwiększyć powtarzalność danych. PANC-1 i CAPAN-1 to ludzkie linie komórkowe gruczolakoraka przewodowego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Strategie określania celów miRNA w dobrej wierze z funkcjami miRNA będącego przedmiotem zainteresowania są niezbędne do zrozumienia wielorakich ról miRNA. Identyfikacja docelowych genów miRNA może być wskazówką do interpretacji zdarzeń sygnalizacji komórkowej modulowanych przez miRNA w komórce. Odkrycie funkcjonalnie ważnych genów docelowych miRNA może dostarczyć podstawowej wiedzy potrzebnej do opracowania terapii opartej na miRNA w leczeniu raka.

Kilka metod, takich jak mikromacierze, sekwen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1D1A3B03035662); oraz Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka stożkowa 15 mlSPL Life Sciences50015
Płytka 24-dołkowaThermo Scientific 142475
Probówka stożkowa 50 mlSPL Life Sciences50050
Płytka 6-dołkowaFalcon353046
6x barwnik ładujący DNAReal Biotech CorporationRD0061 ml
8-nasadkowypasek Zastosowany BiosystemsN8010535Do syntezy cDNA
8-probówkowy pasekApplied BiosystemsN8010580Do syntezy cDNA
96-dołkowa płytkaFalcon353072
Kwas octowySigmaA6283-1L1 L
Agaroza ABio BasicD0012500 g
Fosfataza alkalicznaNew England BiolabsM0290S10 000 U/ml
AmpicillinBio basic Canada IncAB002825 g
pasków probówek AriaMx 96Agilent Technologies401493Do PCR w czasie rzeczywistym
System AriaMx do PCR w czasie rzeczywistymAgilent TechnologiesG8830AqPCR amplifikacja, wykrywanie i analiza danych
AsiSINew England BiolabsR063010 000 jednostek/ml
komórek CAPAN-1ATCCHTB-79
Kaptur do hodowli komórkowychLabtechModel: LCB-1203B-A2
Komory liczące z ukośnikiem w kształcie litery VPaul Marienfeld650010Licznik komórek
Bufor CutSmartNew England BiolabsB7204S10X stężenie
DMEMGibco11965-092500 mL
Zestaw do ekstrakcji żelu DNABionicsDN30200200 prep
drabinka DNANIPPON Genetics EUROPEMWD11 Kb drabinka
DNase IInvitrogen18068015100 jednostek
System testów reporterowych z podwójną lucyferazyPromegaE1910100 testów
Surowica bydlęcapłodu Gibco26140-079500 mL
HIT kompetentne komórkiReal Biotech Corporation (RBC)RH617Kompetentne komórki
HPNE komórkiATCC CRL-4023
Bulion agarowy LBBio BasicSD7003250 g
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-0270,75 mL
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778-0750,75 mL
LuminometrPromegaModel: E5311
Probówka do mikrowirówekEppendorf22431021
Czytnik mikropłytekTECANInfinite F50
kontrola miRNA naśladujeAmbion44640585 nmole
miRNA-107 naśladujeAmbion44640665 nmole
miRNeasy Mini KitQiagen21700450 prep
Mupid-2plus (system do elektroforezy)TaKaRaModel: AD110
NotINew England BiolabsR318920 000 jednostek/ml
Program Oligo ExplorerGeneLinkDo projektowania podkładów
Nasadki pasków tub optycznych (8x pasek)Agilent Technologies401425Do PCR w czasie rzeczywistym
Opti-MEMGibco31985-070500 ml
komórek PANC-1ATCCCRL-1469
Penicylina/streptomycynaGibco15140-122100 ml
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaGibco14040117 1000 ml
minipreparat DNA plazmidu S& V zestawBionicsDN10200200 przygotowanie
PrimeSTAR GXL DNA polimerazaTaKaRaR050A250 jednostek
WytrząsarkaTECANPlatforma wibracyjna
Inkubator wstrząsającyLabtechModel: LSI-3016A
Oprogramowanie Sigmaplot 14Systat Software IncDo generowania krzywej dawka-odpowiedź
Sulforodamina B w proszkuSigmaS1402-5G5 g
SYBR green master mixSmobioTQ12001805401-3Wiążący barwnik fluorescencyjny do
dsDNA T4 Ligaza DNATaKaRa2011A25 000 U
TaqMan master mixApplied Biosystems4324018200 reakcji, bez AmpErase UNG
Test mikroRNA TaqMan (has-miR-107)Applied Biosystems4427975ID testu: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
Test mikroRNA TaqMan (has-miR-301)4427975Applied Biosystems: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
Zestaw TaqMan miR RTApplied Biosystems43665971,000 reakcji
Inkubator Thermo CO2 (BB15)ThermoFisher Scientific37 ° C i 5% inkubacji CO2
Kwas trichlorooctowySigma91228-100G100 g
Baza TrizmaSigmaT4661-100G100 g
Woda ultraczystaInvitrogen10977-015500 mL
Termocykler Veriti 96 wellApplied BiosystemsDo amplifikacji DNA (lub cDNA)
XhoINew England BiolabsR014620 000 jednostek/ml
Identyfikator testu

Bibliografia

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47(2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202(2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Funkcja mikroRNAgeny docelowe mikroRNAPCR w czasie rzeczywistymtest SRBtest lucyferazytransfekcja mimik w mikroRNAkrzywa zale no ci dawka odpowiedtest proliferacji kom rekprogram do przewidywania gen w docelowych

Powiązane artykuły