Artykuł metodologiczny

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

DOI:

10.3791/59628

⸱

21 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science and Research Institute for Bioscience & Biotechnology, Hallym University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które są znane z modulacji licznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w wielu chorobach, w tym nowotworach. Te małe regulatorowe RNA oddziałują głównie z nieulegającymi translacji regionami 3' (3' UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), co ostatecznie prowadzi do zahamowania procesów dekodowania mRNA i zwiększenia docelowych degradacji mRNA. W oparciu o poziomy ekspresji i funkcje wewnątrzkomórkowe, miRNA mogą służyć jako czynniki regulacyjne onkogennych i supresyjnych nowotworów mRNA. Identyfikacja bona fide docelowych genów miRNA wśród setek, a nawet tysięcy obliczeniowo przewidywanych celów jest kluczowym krokiem w kierunku rozpoznania ról i podstawowych mechanizmów molekularnych miRNA będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępne są różne programy do przewidywania celu miRNA w celu wyszukiwania możliwych interakcji miRNA-mRNA. Jednak najtrudniejszym pytaniem jest to, jak zweryfikować bezpośrednie geny docelowe interesującego nas miRNA. Protokół ten opisuje powtarzalną strategię kluczowych metod identyfikacji celów miRNA związanych z funkcją miRNA. Protokół ten przedstawia praktyczny przewodnik po procedurach krok po kroku w celu odkrycia poziomów miRNA, funkcji i powiązanych docelowych mRNA przy użyciu opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowaniu krzywej dawka-odpowiedź i teście lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, co jest niezbędne do prawidłowego zrozumienia ról poszczególnych miRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które głównie modulują proces translacji i degradacji informacyjnych RNA (mRNA) poprzez reakcję na nietranslowane regiony 3' (3' UTR) w bona fide docelowych genach1. Ekspresja miRNA może być regulowana przez mechanizmy transkrypcyjne i potranskrypcyjne. Brak równowagi takich mechanizmów regulacyjnych powoduje niekontrolowane i charakterystyczne poziomy ekspresji miRNA w wielu chorobach, w tym nowotworach2. Pojedyncze miRNA może mieć wiele interakcji z różnymi mRNA. W związku z tym pojedyncze mRNA może być kontrolowane przez różne miRNA. W związku z tym wewnątrzkomórkowe sieci sygnalizacyjne są pod silnym wpływem wyraźnie wyrażonych miRNA, które mogą inicjować i pogarszać fizjologiczne zaburzenia i choroby2,3,4,5,6. Chociaż zmienioną ekspresję miRNA zaobserwowano w różnych typach nowotworów, mechanizmy molekularne, które modulują sposoby działania komórek rakowych w połączeniu z miRNA, są nadal w dużej mierze nieznane.

Coraz więcej dowodów pokazuje, że onkogenne lub tłumiące nowotwory role miRNA zależą od typów nowotworów. Na przykład, celując w skrzynkę widełkową o3 (FOXO3), miR-155 promuje proliferację komórek, przerzuty i chemooporność raka jelita grubego7,8. W przeciwieństwie do tego, ograniczenie inwazji komórek glejaka jest indukowane przez miR-107 poprzez regulację neurogennego białka homologicznego locus notch 2 (NOTCH2) expression9. Ocena interakcji miRNA-cel w związku z funkcjami miRNA jest nieodzowną częścią lepszego zrozumienia, w jaki sposób miRNA regulują różne procesy biologiczne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym10. Ponadto odkrycie celów miRNA w dobrej wierze może dodatkowo zapewnić precyzyjną strategię terapii opartej na miRNA różnymi lekami przeciwnowotworowymi. Jednak głównym wyzwaniem w dziedzinie miRNA jest identyfikacja bezpośrednich celów miRNA. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe metody jako powtarzalne podejścia eksperymentalne do oznaczania docelowego genu miRNA. Udany projekt eksperymentalny identyfikacji celu miRNA obejmuje różne etapy i rozważania (Rysunek 1). Porównanie poziomów dojrzałych miRNA w komórkach nowotworowych i normalnych komórkach może być jedną z powszechnych procedur wyboru interesującego miRNA (Figura 1A). Badanie funkcjonalne wybranego miRNA w celu wykrycia wpływu miRNA na proliferację komórek jest ważne, aby zawęzić listę najlepszych potencjalnych celów miRNA będącego przedmiotem zainteresowania (Figura 1B). W oparciu o eksperymentalnie potwierdzone funkcje miRNA, wymagany jest systematyczny przegląd literatury i bazy danych w połączeniu z programem przewidywania celu miRNA w celu wyszukania najistotniejszych informacji na temat funkcji genów (Rysunek 1C). Identyfikację prawdziwych genów docelowych miRNA można osiągnąć, wdrażając eksperymenty, takie jak test lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, PCR w czasie rzeczywistym i western blotting (Figura 1D). Celem obecnego protokołu jest zapewnienie kompleksowych metod kluczowych eksperymentów, opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowania krzywej dawka-odpowiedź oraz testu lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu. Obecny protokół może być przydatny do lepszego zrozumienia funkcji poszczególnych miRNA i implikacji miRNA w terapii raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analiza ekspresji dojrzałego mikroRNA (miRNA)

  1. Synteza dojrzałego komplementarnego DNA miRNA (cDNA)
    1. Dodać 254 ng całkowitego RNA i 4,5 μl mieszanin deoksyrybonukleazy I (DNazy I), a następnie dodać ultraczystą wodę do probówek paskowych PCR, aby uzyskać do 18 μl (Rysunek 2A). Przygotować reakcję dla każdej całkowitej próbki RNA oczyszczonej z kilku linii komórkowych przy użyciu wystarczającej ilości mieszanin DNazy I w oparciu o całkowitą liczbę reakcji.
      nuta: Mieszaniny DNazy I składają się z DNazy I (1,8 μl), inhibitora rybonukleazy (0,3 μl) i 25 mM MgCl2 (2,4 μL). Aby w sposób powtarzalny uzyskać całkowite RNA, zastosowano metodę ekstrakcji kolumnowej zamiast metody ekstrakcji opartej na fenolu i chloroformie. Doniesiono, że wydajność ekstrakcji niektórych miRNA może być zróżnicowana w zależności od liczby komórek przy użyciu metody ekstrakcji opartej na fenolu i chloroformie11,12.
    2. Inkubować probówki w termocyklerze. Uruchomić probówki na 10 minut w temperaturze 37 °C i inaktywować termicznie DNazę I przez 5 minut inkubacji w temperaturze 90 °C. Po inkubacji natychmiast umieścić probówki na lodzie.
    3. Przenieś 7,1 μl całkowitego RNA poddanego działaniu DNazy I do 2 zestawów nowych probówek, a następnie dodaj 1,5 μl starterów antysensownych dla genu dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) (Rysunek 2B).
      nuta: Na tym etapie ilość całkowitego RNA do syntezy cDNA wynosi 100 ng. Podstawowe stężenie starterów antysensownych GAPDH wynosi 10 μM. Dodanie starterów antysensownych GAPDH służy do generowania cDNA GAPDH przy użyciu metody starterów specyficznych dla genu.
    4. Inkubować probówki za pomocą termocyklera. Rozpocząć w temperaturze 80 °C przez 5 minut, a następnie reagować w temperaturze 60 °C przez 5 minut. Po inkubacji natychmiast umieść probówki na lodzie.
    5. Dodać 3,4 μl mieszanin enzymów odwrotnej transkrypcji (RT) do każdej reakcji (Rysunek 2B). Mieszaniny enzymów RT składają się ze 100 mM trifosforanów deoksyrybonukleotydowych (0,15 μl), 10x buforu RT (1,5 μl), inhibitora rybonukleazy (0,75 μl) i enzymu odwrotnej transkrypcji (1 μl). Przygotuj wystarczającą ilość mieszanin w oparciu o całkowitą liczbę reakcji.
    6. Dodaj 3 μl 5x starterów RT dla określonego miRNA w każdej reakcji (Rysunek 2B).
      nuta: Całkowita objętość wynosi 15 μl dla każdej reakcji.
    7. Uruchom rurki za pomocą termocyklera. Rozpocząć w temperaturze 16 °C przez 30 minut, następnie reakcję w temperaturze 42 °C przez 30 minut, a na końcu w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Przytrzymaj w temperaturze 4 °C przez pozostały czas (Rysunek 2B). Na tym etapie generowane są jednoniciowe cDNA zarówno dla specyficznego genu miRNA, jak i genu GAPDH w tej samej probówce.
  2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym i analiza danych
    1. Rozcieńczyć każde cDNA ultraczystą wodą w stosunku 1:49.
    2. Przygotować mieszaniny reakcyjne dla określonego miRNA i GAPDH (tabela 1). W celu wykrycia określonego miRNA i GAPDH należy skonfigurować potrójne reakcje dla każdej próbki cDNA.
    3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym i analizę danych (Rysunek 2C). Analizuj dane za pomocą metody porównawczej CT13,14.

2. MikroRNA (miRNA) Naśladuje Transfekcję

UWAGA: miRNA-107 jest wybierany z kroku 1. Ponieważ miRNA-107 jest regulowany w dół w komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami, można spekulować, że miRNA-107 jest miRNA supresyjnym nowotworem. W przypadku miRNA, które jest regulowane w górę w komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami (np. miRNA-301), oligonukleotydy antysensowne przeciwko miRNA-301 można zastosować w krokach 2, 3 i 4.

  1. Policz komórki za pomocą komory liczącej i umieść komórki w 96-dołkowej płytce. Gęstość komórek wynosi 2 x 103 komórki/100 μl dla każdej studzienki. Nie należy używać pożywek do hodowli komórkowych zawierających penicylinę-streptomycynę (P/S), ponieważ P/S może zmniejszyć skuteczność transfekcji.
  2. Przygotuj zestaw mieszanin do transfekcji do transfekcji komórek w kilku końcowych stężeniach mimiki kontrolnej miRNA i mimiki miRNA-107 następnego dnia (Rysunek 3).
    1. Z zapasu (stężenie 25 μM) mimiki kontrolnej mimiki lub mimiki miRNA-107, rozcieńczyć i dodać odpowiednią ilość mimiki kontrolnej lub mimiki miRNA-107 w pożywce o zredukowanej surowicy wraz z odczynnikiem do transfekcji za pomocą probówek do mikrowirówek (Figura 3A). Delikatnie wymieszać mieszaniny zawierające oligonugolakity za pomocą mikropipety. Całkowita ilość oligonukleotydów (kontrola mimiczna miRNA + mimika miRNA-107) powinna być taka sama w każdym dołku. Ślepe studzienki zawierają 100 μl pożywki do hodowli komórkowych i pożywki o zredukowanej surowicy zawierającej odczynnik do transfekcji bez komórek.
  3. Po 10 minutach inkubacji w kapturze do hodowli komórkowych delikatnie wymieszać mieszaniny zawierające oligo, a następnie dodać 50 μl mieszanin do każdej studzienki. Przechowywać transfekowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 6-12 godzinach inkubacji zastąpić odczynnik do transfekcji zawierającą pożywkę do hodowli świeżych komórek zawierającą zarówno płodową surowicę bydlęcą (FBS), jak i P/S. Dalej inkubować komórki przez 72 godziny. Całkowity czas trwania kuracji mimiką miRNA wynosi 96 godzin.

3. Test sulforodaminy B (SRB)

  1. Utrwalanie komórek
    1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki płytki i niezwłocznie wlać 100 μl 10% kwasu trichlorooctowego (TCA) do każdej studzienki. Ostrożnie zasysaj pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki, aby uniknąć uszkodzenia komórek i oderwania się od dna.
      nuta: Przygotuj 40% TCA, dodając 20 g proszku TCA do 50 ml wody destylowanej. Z 40% TCA uzyskać 10% TCA, rozcieńczając 40% TCA wodą destylowaną w stosunku rozcieńczenia 1:3.
    2. Płytkę zawierającą 10% TCA przechowywać w lodówce (4 °C) przez 1 godzinę.
    3. Umyj talerz kilka razy, zanurzając go w wannie z wodą i wysusz. Usuń nadmiar wody z wnętrza studni, stukając w płytkę, aż w studniach nie będzie już wody. Pozostaw płytkę na stole laboratoryjnym, aby ją wysuszyć przed przejściem do następnego kroku.
  2. Barwienie komórek
    1. Odpipetować 50 μl 0,4% roztworu SRB do każdej studzienki, w tym do studzienek ślepych. Delikatnie potrząsaj płytką, aż 0,4% roztwór SRB będzie konsekwentnie pokrywał dno studzienek.
      nuta: Przygotuj i użyj 0,4% roztworu SRB, dodając 0,4 g proszku SRB do 100 ml 1% kwasu octowego. Ostrożnie wstrząśnij roztworem, aby go wymieszać. Owiń butelkę z 0,4% roztworem SRB w lekki materiał ochronny, taki jak folia aluminiowa. Przechowywać 0,4% roztwór SRB w lodówce.
    2. Po inkubacji przez 40 min do 60 min umyć płytkę, spłukując ją 1% kwasem octowym. Myj płytkę, aż niezwiązany barwnik zostanie całkowicie zmyty (Rysunek 3B).
    3. Pozostaw płytkę na stole laboratoryjnym, aby ją wysuszyć przed przejściem do następnego kroku.
      nuta: Płytka powinna być całkowicie wysuszona przed przejściem do kroku 3.3.
  3. Pomiar absorbancji
    1. Odpipetować 100 μl roztworu zasadowego Tris (10 mM) do odpowiednich studzienek, w tym studzienek ślepych. Trzymaj płytkę na shakerze przez 10 minut. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 492 nm.

4. Generowanie krzywej dawka-odpowiedź

  1. Analizowanie danych testowych SRB w arkuszu kalkulacyjnym. Odejmij absorbancję ślepej próby od wartości absorbancji każdej grupy i oblicz średnią (AVE) i odchylenie standardowe (STD) wartości absorbancji każdej grupy.
  2. Obliczyć procentowy udział średniej absorbancji (AVE%) i odchylenia standardowego (STD%) dla każdej grupy, korzystając z wartości absorbancji testu SRB.
    nuta: AVE% grupy kontrolnej mimicznej leczonej mimiką wynosi 100%. Obliczyć STD% za pomocą następującego wzoru: STD% = (STD każdej grupy / absorbancja AVE kontrolnej grupy mimicznej poddanej działaniu środka mimicznego) x 100.
  3. Zaimportuj surowe dane, w tym stężenia po poddaniu działaniu substancji, AVE% i STD%, do oprogramowania, wyrównując te dane w pionie. Ponieważ log 0 nie jest zdefiniowany, ustaw pierwsze stężenie na osi X na wartość bliską 0 (np. 0,01).
  4. Kliknij kartę Utwórz wykres i wybierz Proste słupki błędów punktowych. Wybierz kolumny arkusza jako wartości symboli i kliknij przycisk Dalej. W panelu formatu danych wybierz pary XY i kliknij przycisk Dalej. Zaznacz odpowiednie kolumny danych w panelu wyboru danych. Kliknij przycisk Zakończ, aby utworzyć wykres.
    nuta: Oś X reprezentuje stężenia, oś Y wskazuje procent średniej absorbancji każdego stężenia (AVE%), a słupki błędu wskazują procent odchylenia standardowego każdego stężenia (STD%).
  5. Kliknij dwukrotnie oś X, aby zmodyfikować typ skali i skalowanie osi. Zmień typ skali z liniowej na logarytmiczną. Zmodyfikuj numer zakresu początkowego i końcowego odpowiednio na 0,01 i 200.
  6. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny wykres punktowy, wybierz opcję Dopasuj krzywą i przejdź do podkategorii zdefiniowanej przez użytkownika. Wybierz opcję Krzywa dawka-odpowiedź, kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Krzywa dawka-odpowiedź jest teraz generowana wraz z zakładką raportu (Rysunek 4A).
    1. Aby wprowadzić równanie 1 w oprogramowaniu w celu wygenerowania krzywej dawka-odpowiedź, kliknij kartę Analiza i wybierz opcję Kreator regresji. Przejdź do opcji Zdefiniowane przez użytkownika w kategorii równania, a następnie kliknij przycisk Nowy. Wstaw równanie 1, zmienne, parametry początkowe i ograniczenia do odpowiednich pustych pól (Rysunek 4B, C). Kliknij przycisk Dodaj jako i ustaw nazwę równania jako Krzywa dawka-odpowiedź. Nazwa równania jest teraz generowana w podkategorii zdefiniowanej przez użytkownika w kategorii równania. f oznacza procent żywotności komórki (% żywotności komórki) w równaniu 1.

Równanie 1
figure-protocol-1

  1. Przejdź do karty raportu, a następnie sprawdź wartości n, k i R.
    UWAGA: y0 wskazuje 100% żywotność komórek grupy kontrolnej mimicznej traktowanej mimikiem, n oznacza współczynnik typu Hilla (nachylenie wykresu), k oznacza stężenie mimiku miRNA-107, które wytwarza 50% maksymalnego efektu mimika miRNA-107 (połowa maksymalnego stężenia hamującego, IC50), a R oznacza pozostałą frakcję nienaruszoną (frakcja oporności)15. Równanie użyte do wygenerowania krzywej dawka-odpowiedź rozpoznaje zakres od wartości y0 do R (jeśli występuje) jako 100% (Rysunek 4A). Dlatego konieczne jest uzyskanie skorygowanej wartości k (IC50), która jest obliczana na podstawie zakresu od y0 do wartości zero (Rysunek 4A). Skorygowane k (IC50) wraz z innymi wartościami ICx (np. IC10 do IC90) można uzyskać za pomocą równania 2, które pochodzi z równania 1. Wyprowadzenie równania 2 z równania 1 przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.

Równanie 2
figure-protocol-2

  1. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy komórkę, do której zastosowano równanie 2. Korzystając z równania 2 i parametrów z wygenerowanej krzywej dawka-odpowiedź, można obliczyć skorygowane wartości ICx, w zakresie odIC 10 do IC90 (Rysunek 4D).
  2. Wprowadź znak równości, a następnie formułę zaczynającą się od nawiasu kwadratowego w komórce. Wprowadzając formułę, ustal wartości n, k i R jako odwołania do komórek bezwzględnych, dodając znak dolara do odpowiedniej kolumny i wiersza, tak aby te stałe wartości nie zostały zmienione podczas automatycznego wypełniania formuły do wierszy (Rysunek 4D). Alternatywnie, skorygowane wartości można obliczyć ręcznie za pomocą równania 2.
    nuta: Wartość IC90 nie jest określana, ponieważ wartość R jest większa niż 10. Ponadto, jeśli wartość R jest wyższa niż 20, wartość IC80 również nie jest określana (Rysunek 4D).

5. Weryfikacja genu bezpośredniego celu interesującego nas mikroRNA

UWAGA: Po przeprowadzeniu funkcjonalnego eksperymentu, takiego jak test SRB, potwierdzono, że miRNA-107 jest miRNA supresyjnym nowotworem i jest wysoce prawdopodobne, że miRNA-107 jest bezpośrednio ukierunkowane na onkogeny. Sprawdź listę wszystkich przewidywanych genów docelowych za pomocą programu do przewidywania celu miRNA, takiego jak TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), a następnie zawęź do potencjalnych celów na podstawie funkcji genu w bazach danych, w tym PubMed i GeneCards.

  1. Projekt podkładu do klonowania 3' nietranslowanego regionu (UTR)
    1. Wpisz nazwę genu w GeneCards (https://www.genecards.org/) i kliknij Symbol genu. Oceń przeglądarkę genomu Ensembl, klikając pozycję Ensembl ID genu, a następnie kliknij pozycję Identyfikator transkryptów w tabeli transkrypcji. Następnie kliknij Eksony istniały na liście Wyświetlacze oparte na transkrypcji po lewej stronie.
    2. Skopiuj sekwencje nukleotydowe 3' UTR i wklej je do programu do projektowania starterów. Skopiuj sekwencje ponownie z tego programu i wklej je do edytora tekstu. Sprawdź obecność sekwencji wiążących miRNA, a także obecność enzymów restrykcyjnych używanych do klonowania.
      nuta: Jeśli w obrębie 3' UTR nie ma miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych, enzymy restrykcyjne wybrane do klonowania można wykorzystać w następnym kroku.
    3. W programie do projektowania starterów zaakceptuj sekwencje 3' UTR i zacznij projektować startery do przodu i do tyłu z następującym warunkiem. Długość: 20-30 nukleotydów, Tm: 45-58 °C, GC%: 40-60%. Różnica między wartościami Tm dwóch starterów powinna być mniejsza niż 5 °C. Sekwencje starterów użyte w tym badaniu przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2. Dodaj sekwencje rozpoznawania enzymów restrykcyjnych, a także 4 losowe nukleotydy do zaprojektowanych starterów.
  2. Gradientowa reakcja PCR
    1. Przygotować 25 μl mieszanin reakcyjnych PCR, w tym zaprojektowane startery, na jedną temperaturę wyżarzania (tabela 2). Przygotuj wystarczającą ilość mieszanin w oparciu o całkowitą liczbę reakcji. Wymieszać roztwór, pipetując i dodać 25 μl mieszanin reakcyjnych do każdej probówki. Wirować probówki przez kilka sekund.
    2. Wykonaj 35-40 cykli PCR od etapu denaturacji do etapu przedłużenia. Ustaw cykl PCR w następujący sposób: 98 °C przez 1 minutę (1 cykl, etap aktywacji polimerazy), 95 °C przez 10 s (etap denaturacji), 45 °C-68 °C przez 30 s (etap wyżarzania), 68 °C (etap przedłużania, 10 s-1 min na 1000 pz), 68 °C przez 3 minuty (etap zakończenia), i na koniec schłodzić do temperatury 4 °C.
    3. Uruchom produkty PCR i sprawdź prążki na 1% żelu agarozowym z drabinkami DNA. Znajdź najlepszą temperaturę wyżarzania (Rysunek 5A). Ponownie amplifikuj 3' UTR genu, używając najlepszej temperatury wyżarzania dla następnego kroku.
  3. Podwójne trawienie
    1. Mieszaniny reakcyjne zawierające dwa enzymy restrykcyjne, XhoI (lub AsiSI) i NotI, należy przygotować w probówce (Tabela 3). Inkubować mieszaniny przez 3-4 godziny w łaźni wodnej (37 °C).
    2. Podwójnie strawione produkty umieść na 1% żelu agarozowym, a następnie przetnij pasma w świetle UV. W przypadku wektorów lucyferazy, przed uruchomieniem na żelu, należy reagować podwójnie strawione wektory z 10 U fosfataz alkalicznych przez kolejną 1 godzinę, aby zapobiec recyrkularyzacji podczas etapu ligacji.
    3. Oczyść podwójnie strawione produkty PCR i wektory lucyferazy z wyciętych prążków.
  4. Ligacja produktów PCR do wektorów lucyferazy
    1. Przygotować 20 μl mieszanin reakcyjnych ligacji, w tym ligazy DNA (tabela 4).
      nuta: Stosunek molowy produktu PCR (insertu) do wektora lucyferazy może wynosić 3:1. 1:1 lub 2:1.
    2. Krótko odwirować probówkę przez 10-15 s i inkubować w temperaturze 16 °C przez noc za pomocą termocyklera.
      nuta: Alternatywnie, probówkę można inkubować w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni w celu podwiązania. Na tym etapie wstawka PCR zostanie sklonowana do regionu znajdującego się poniżej genu reporterowego renilla (Figura 5B). Wiązanie miRNA ze sklonowanym 3' UTR genu może zmniejszyć aktywność renilli. Lucyferazy świetlików służy do normalizacji poziomów ekspresji renilli.
  5. Transformacja i PCR kolonii
    1. Dodać mieszaniny do ligacji (3-5 μl) do probówki zawierającej właściwe komórki. Delikatnie postukaj w tubkę i trzymaj ją na lodzie (20 min).
      UWAGA: Rozmrozić kompetentne komórki na lodzie przed dodaniem mieszanin ligacyjnych.
    2. Szybko i delikatnie przenieś rurkę do bloku grzewczego. Po szoku cieplnym (42 °C przez 30 s-1 min) umieść probówkę na lodzie na 20 min.
    3. Rozłóż kompetentne komórki na płytce agarowej Luria-Bertani (LB). Hodować kompetentne komórki w inkubatorze (37 °C) przez noc.
      nuta: Ampicylina (50-100 μg/ml) znajduje się w płytce agarowej.
    4. Wybierz pojedynczą kolonię i ponownie zawieś E. coli w jednej z 8-paskowych probówek zawierających ultraczystą wodę. Powtórz ten krok, aby ponownie zawiesić E. coli z losowo wybranych 4-8 kolonii (Rysunek 5C).
    5. Przenieść 25 μl zawiesiny E. coli do innego zestawu 8-paskowych probówek. Teraz są 2 zestawy probówek z zawiesiną E. coli.
      nuta: Jedna probówka służy do PCR kolonii, a druga do inokulacji. Zawiesina E. coli do inokulacji może być tymczasowo przechowywana w temperaturze 4 °C (Rysunek 5C).
    6. Wykonaj PCR kolonii przy użyciu zawiesiny E. coli. Ten krok ma na celu ustalenie, czy kolonie zawierają wkładkę. Wybierz najlepsze kolonie do inokulacji i izolacji wektorów lucyferazy zawierających 3' UTR genu (Rysunek 5C).
      nuta: Powtórz krok 5.1-5.5 dla każdego 3' UTR wybranych genów. Postępuj zgodnie z warunkami reakcji PCR pokazanymi w tabeli 2, zastępując genomowe DNA zawiesiną E. coli.
  6. Test lucyferazy
    1. Przygotuj płytkę 24-dołkową. Użyj 1-2 x 104 komórek w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych dla każdego dołka. Nie należy używać pożywek do hodowli komórkowych zawierających P/S do transfekcji, ponieważ użycie P/S może zmniejszyć wydajność transfekcji.
    2. Transfekcja 50 ng wektorów lucyferazy do komórek z kontrolnym mimikiem lub specyficznym mimikiem miRNA za pomocą odczynnika transfekcji (Figura 5D). W przypadku badania przesiewowego działania określonego miRNA naśladującego więcej niż jedno stężenie, utrzymuj całkowitą ilość oligonukleotydów taką samą w każdym dołku (patrz krok 2).
    3. Następnego dnia dwukrotnie umyć wnętrze studzienek roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    4. Nałożyć 200 μl odczynnika do lizy do studzienek i w wystarczającym stopniu przeprowadzić lizę komórek przed pomiarem aktywności lucyferazy.
      nuta: Trzymaj talerz na roztrząsanym talerzu przez co najmniej 15 minut.
    5. Przenieś 5-10 μl lizatu komórkowego do nowej probówki i dodaj 100 μl odczynnika I. Natychmiast wymieszaj roztwór przez pipetowanie i odczytaj aktywność lucyferazy świetlika za pomocą luminometru.
      nuta: Czytaj aktywność lucyferazy świetlików przez 10-15 sekund.
    6. Dodać 100 μl odczynnika II do tej samej probówki, a następnie wymieszać przez dwukrotne pipetowanie. Odczytaj aktywność lucyferazy renilla przez 10-15 s za pomocą luminometru. Powtórzyć kroki 5.6.5 i 5.6.6 dla każdej próbki.
    7. Oblicz stosunek renilli do świetlika (Rysunek 5E).
      nuta: Aktywność świetlika reprezentuje skuteczność transfekcji konstruktów lucyferazy do komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne i dokładne potwierdzenie poziomów miRNA jest ważne dla interpretacji danych, na podstawie których możliwa jest klasyfikacja miRNA na podstawie przewidywanych ról miRNA w rozwoju i progresji choroby. Poziomy miRNA-107 i miRNA-301 mierzono w trzech liniach komórkowych trzustki za pomocą ilościowego PCR opartego na sondzie. Synteza cDNA zarówno specyficznego miRNA, jak i genu referencyjnego w tej samej reakcji może zwiększyć odtwarzalność danych. PANC-1 i CAPAN-1 to ludzkie linie komórkowe gruczolakoraka przewodowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategie określania celów miRNA w dobrej wierze z funkcjami miRNA będącego przedmiotem zainteresowania są niezbędne do zrozumienia wielorakich ról miRNA. Identyfikacja docelowych genów miRNA może być wskazówką do interpretacji zdarzeń sygnalizacji komórkowej modulowanych przez miRNA w komórce. Odkrycie funkcjonalnie ważnych genów docelowych miRNA może dostarczyć podstawowej wiedzy potrzebnej do opracowania terapii opartej na miRNA w leczeniu raka.

Kilka metod, takich jak mikromacierze, sekwen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1D1A3B03035662); oraz Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka stożkowa 15 mlSPL Life Sciences50015
Płytka 24-dołkowaThermo Scientific 142475
Probówka stożkowa 50 mlSPL Life Sciences50050
Płytka 6-dołkowaFalcon353046
6x barwnik ładujący DNAReal Biotech CorporationRD0061 ml
8-nasadkowypasek Zastosowany BiosystemsN8010535Do syntezy cDNA
8-probówkowy pasekApplied BiosystemsN8010580Do syntezy cDNA
96-dołkowa płytkaFalcon353072
Kwas octowySigmaA6283-1L1 L
Agaroza ABio BasicD0012500 g
Fosfataza alkalicznaNew England BiolabsM0290S10 000 U/ml
AmpicillinBio basic Canada IncAB002825 g
pasków probówek AriaMx 96Agilent Technologies401493Do PCR w czasie rzeczywistym
System AriaMx do PCR w czasie rzeczywistymAgilent TechnologiesG8830AqPCR amplifikacja, wykrywanie i analiza danych
AsiSINew England BiolabsR063010 000 jednostek/ml
komórek CAPAN-1ATCCHTB-79
Kaptur do hodowli komórkowychLabtechModel: LCB-1203B-A2
Komory liczące z ukośnikiem w kształcie litery VPaul Marienfeld650010Licznik komórek
Bufor CutSmartNew England BiolabsB7204S10X stężenie
DMEMGibco11965-092500 mL
Zestaw do ekstrakcji żelu DNABionicsDN30200200 prep
drabinka DNANIPPON Genetics EUROPEMWD11 Kb drabinka
DNase IInvitrogen18068015100 jednostek
System testów reporterowych z podwójną lucyferazyPromegaE1910100 testów
Surowica bydlęcapłodu Gibco26140-079500 mL
HIT kompetentne komórkiReal Biotech Corporation (RBC)RH617Kompetentne komórki
HPNE komórkiATCC CRL-4023
Bulion agarowy LBBio BasicSD7003250 g
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-0270,75 mL
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778-0750,75 mL
LuminometrPromegaModel: E5311
Probówka do mikrowirówekEppendorf22431021
Czytnik mikropłytekTECANInfinite F50
kontrola miRNA naśladujeAmbion44640585 nmole
miRNA-107 naśladujeAmbion44640665 nmole
miRNeasy Mini KitQiagen21700450 prep
Mupid-2plus (system do elektroforezy)TaKaRaModel: AD110
NotINew England BiolabsR318920 000 jednostek/ml
Program Oligo ExplorerGeneLinkDo projektowania podkładów
Nasadki pasków tub optycznych (8x pasek)Agilent Technologies401425Do PCR w czasie rzeczywistym
Opti-MEMGibco31985-070500 ml
komórek PANC-1ATCCCRL-1469
Penicylina/streptomycynaGibco15140-122100 ml
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaGibco14040117 1000 ml
minipreparat DNA plazmidu S& V zestawBionicsDN10200200 przygotowanie
PrimeSTAR GXL DNA polimerazaTaKaRaR050A250 jednostek
WytrząsarkaTECANPlatforma wibracyjna
Inkubator wstrząsającyLabtechModel: LSI-3016A
Oprogramowanie Sigmaplot 14Systat Software IncDo generowania krzywej dawka-odpowiedź
Sulforodamina B w proszkuSigmaS1402-5G5 g
SYBR green master mixSmobioTQ12001805401-3Wiążący barwnik fluorescencyjny do
dsDNA T4 Ligaza DNATaKaRa2011A25 000 U
TaqMan master mixApplied Biosystems4324018200 reakcji, bez AmpErase UNG
Test mikroRNA TaqMan (has-miR-107)Applied Biosystems4427975ID testu: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
Test mikroRNA TaqMan (has-miR-301)4427975Applied Biosystems: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
Zestaw TaqMan miR RTApplied Biosystems43665971,000 reakcji
Inkubator Thermo CO2 (BB15)ThermoFisher Scientific37 ° C i 5% inkubacji CO2
Kwas trichlorooctowySigma91228-100G100 g
Baza TrizmaSigmaT4661-100G100 g
Woda ultraczystaInvitrogen10977-015500 mL
Termocykler Veriti 96 wellApplied BiosystemsDo amplifikacji DNA (lub cDNA)
XhoINew England BiolabsR014620 000 jednostek/ml
Identyfikator testu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47(2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202(2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MicroRNA FunctionMicroRNA Target GenesTumor CellsReal Time PCRSRB AssayLuciferase AssayMicroRNA Mimic TransfectionDose Response CurveCell Proliferation AssayTarget Prediction Program

Powiązane artykuły