Method Article

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowane metody demonstrują laboratoryjne procedury izolacji organów od zwierząt zakażonych wirusem Zika i ilościowego oznaczania wiremii. Celem procedury jest ilościowe określenie miana wirusa w obszarach obwodowych i OUN myszy w różnych punktach czasowych po zakażeniu lub w różnych warunkach eksperymentalnych w celu zidentyfikowania czynników wirusologicznych i immunologicznych regulujących zakażenie wirusem Zika. Zademonstrowane procedury izolacji narządów pozwalają zarówno na ilościowe oznaczanie mian wirusa metodą formowania ostrości, jak i ilościową ocenę mian wirusa metodą PCR. Techniki szybkiej izolacji narządów mają na celu zachowanie miana wirusa. Kwantyfikacja miana wirusa za pomocą testu zogniskowania pozwala na szybką ocenę przepustowości wirusa Zika. Zaletą testu skupiającego jest ocena zakaźnego wirusa, ograniczeniem tego testu jest możliwość toksyczności narządowej zmniejszającej granicę wykrywalności. Ocenę miana wirusa łączy się z ilościową PCR, a przy użyciu kontroli kopii rekombinowanej RNA ocenia się liczbę kopii genomu wirusa w narządzie z dolną granicą wykrywalności. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te zapewniają dokładną, szybką, wysokoprzepustową metodę analizy mian wirusa Zika na obrzeżach i w OUN zwierząt zakażonych wirusem Zika i mogą być stosowane do oceny miana wirusa w narządach zwierząt zakażonych większością patogenów, w tym wirusem dengi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Zika (ZIKV) to arbowirus należący do rodziny flaviviridae, która obejmuje ważne neuroinwazyjne ludzkie patogeny, takie jak wirus Powassan (POWV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV) i wirus Zachodniego Nilu (WNV)1. Po jego izolacji i zidentyfikowaniu pojawiały się okresowe doniesienia o zakażeniach ZIKV u ludzi w Afryce i Azji2,3,4,5 oraz epidemie w Ameryce Środkowej i Południowej (przejrzane w reference6). Jednak dopiero niedawno uznano, że ZIKV powoduje ciężką chorobę7. Obecnie istnieją tysiące przypadków chorób neurologicznych i wad wrodzonych związanych z infekcjami ZIKV. Szybkie pojawienie się ZIKV wywołało wiele pytań dotyczących: dlaczego następuje wzrost nasilenia choroby, jaka jest odpowiedź immunologiczna na zakażenie ZIKV oraz czy istnieją patologie o podłożu wirusowym i/lub immunologicznym związane ze wzrostem objawów neurologicznych i wad wrodzonych. Obecnie obserwuje się pośpiech w zrozumieniu choroby związanej z ośrodkowym układem nerwowym (OUN) związanej z ZIKV, a także potrzeba szybkiego przetestowania skuteczności leków przeciwwirusowych i szczepionek przeciwko ZIKV. W tym kontekście opracowaliśmy metody szybkiej analizy miana ZIKV zarówno na obrzeżach, jak i w OUN przy użyciu testów formowania ogniskowego specyficznych dla ZIKV (FFA).

Małe modele zwierzęce są ważne dla zrozumienia postępu choroby i wczesnej oceny szczepionek, terapii i leków przeciwwirusowych. Stworzyliśmy małe modele zwierzęce do badania choroby arbowirusowej, używając różnych szczepów myszy do modelowania infekcji u ludzi i ochrony przed patogenami wirusowymi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Korzystając z tego wcześniejszego doświadczenia, zaczęliśmy modyfikować techniki stosowane do oceny wirusa WNV i dengi, pokrewnego flawiwirusa do oceny miana ZIKV w obu narządach obwodowych, a także w klasie CNS21,23,24. Zalety tych metod w porównaniu z innymi testami to: 1) to, że łączą one w sobie zdolność do pobierania do analizy zarówno narządów obwodowych, jak i OUN; 2) metody można dostosować do cytometrii przepływowej, do pomiarów wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych, wraz z mianami wirusów na tym samym zwierzęciu w tym samym narządzie; 3) technika zbioru jest przystosowana do analizy histologicznej; 4) ZIKV FFA jest szybką, wysokoprzepustową metodą analizy miana wirusa; oraz 5) Metody te mogą być stosowane do oceny mian wirusów w narządach zwierząt zakażonych większością patogenów25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury niniejszego badania są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu St. Louis. SLU jest w pełni akredytowany przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).

1. Izolacja narządów

UWAGA: Wirus nie jest stabilny w temperaturze pokojowej (RT), więc liczba zwierząt zbieranych jednorazowo musi być starannie zaplanowana, aby zachować miano wirusa.

  1. Zakażone myszy należy zastosować wybraną dawkę i drogę, w zależności od wymaganego fenotypu. W ramach tego protokołu należy zainfekować 8-10-tygodniowe myszy C57BL/6 płci męskiej i żeńskiej z niedoborem receptora interferonu typu I (Ifnar1-/-).
    1. Znieczulenie myszy Ifnar1-/- koktajlem ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Przetestuj odruch pedałowania przez mocne uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić znieczulenie. Podawać 1 x 105 jednostek tworzących ognisko (FFU) ZIKV w 50 μl podskórnie (SC) przez podnóżek.
  2. Przygotuj wszystkie materiały potrzebne do zbioru dzień wcześniej: 2 nożyczki, kleszcze i 20 ml 70% etanolu (EtOH) w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml do dezynfekcji narzędzi.
    1. Przygotuj strzykawki i igły: strzykawkę o pojemności 20 ml do perfuzji, igły 23 G (około 1 na klatkę) i 1 ml strzykawkę z igłą 25 G (1 na 3-5 myszy). Przed ważeniem probówek dodaj stalowe koraliki (w kapturze) do probówek z nakrętką O-ring o pojemności 1,5 ml (po jednej na każdy narząd). Probówki muszą być odpowiednie do homogenizacji.
  3. Przygotuj w dniu zbiorów materiały potrzebne do perfuzji i zamrożenia narządów.
    1. Napełnij wiaderko z lodem suchym lodem i 70% EtOH, aby zrobić kąpiel lodową. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zakładając, że potrzeba 25-30 ml PBS na mysz na każdą perfuzję, 5-10 ml na rdzeń kręgowy). Zaopatrz się w znieczulenie, koktajl ketaminy i ksylazyny i przyjmij 300 μl na mysz. Umieścić wszystkie materiały i wszelkie dodatkowe probówki wymagane do cytometrii przepływowej itp. w pojemniku wtórnym w celu przetransportowania do obiektu dla zwierząt.
  4. Przestrzegać wszystkich niezbędnych procedur przy wejściu, w tym zakładania i zdejmowania środków ochrony osobistej podczas wchodzenia i wychodzenia z obiektu dla zwierząt.
    ostrożność: Wszystkie procedury należy przeprowadzić w certyfikowanym komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
  5. Podawać znieczulenie, 200-500 μL, dootrzewnowo w zależności od wielkości i wagi zwierzęcia. Jeśli pracujesz sam, podawaj znieczulenie jednemu zwierzęciu na raz, aby uniknąć zabicia zwierząt przed pobraniem narządów.
    1. Potwierdź dawkę znieczulenia, ściskając palec u nogi kleszczami, aby ocenić odruch pedałowania. Nie kontynuuj, chyba że całkowicie nie odpowiadasz. Użyj szpilek, aby przymocować mysz do tablicy woskowej. W tym momencie oblaj mysz 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia włosów podczas procedury pobierania narządów
  6. Śmiertelne krwawienie przez nakłucie serca.
    1. Za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz zwierzę przez klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Zbieraj krew przez nakłucie serca (~ 800 μL), może to być używane do wielu testów, w tym chemii klinicznej, hematologii, cytometrii przepływowej w celu wykrycia odpowiedzi specyficznych dla antygenu oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do analizy liczby kopii wirusa.
    2. W przypadku analizy wirusowego RNA metodą qRT-PCR należy pobrać krew do probówki EDTA w przypadku ekstrakcji z krwi pełnej lub w probówce mikrowirówkowej w przypadku ekstrakcji z surowicy. (W przypadku surowicy wirować probówkę z maksymalną prędkością w wirówce, w temperaturze pokojowej, przez 20 minut i usunąć surowicę do osobnej probówki). Po zakończeniu dodać liniowy poliakrylamid jako nośnik do próbki surowicy. RNA może być następnie analizowane lub przechowywane w temperaturze -80 °C w celu dalszego przetwarzania w późniejszym terminie.
  7. Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml PBS w temperaturze pokojowej (lub 37 °C) i przelej myszy, wkładając igłę motylkową do lewej komory. Przebij prawy przedsionek, aby umożliwić wydostanie się krwi i PBS. Powoli podawaj PBS, sprawdzając kolor wątroby, aby potwierdzić, że zwierzę jest całkowicie perfundowane. Wątroba powinna zmienić kolor z ciemnoczerwonego na różowy łososiowy.
    1. Jeśli przygotowujesz narządy do histologii, pozostaw igłę motylkową na miejscu, a następnie przetapiaj 20 ml lodowatego 4% paraformaldehydu. Jeśli tak, wygodnie jest podłączyć strzykawkę do 3-drogowego kranu z podłączonymi do niego obiema strzykawkami, włączając i wyłączając zawór, gdy naprzemiennie przełącza się między PBS i PFA.
  8. Pobieraj organy do oznakowanych, zważonych probówek. W przypadku narządów obwodowych postępuj zgodnie z ustaloną kolejnością zbiorów: wątroba, śledziona, nerki i płuca.
    1. Weź tylko jeden płat z wątroby, nie ma znaczenia, który, ale we wszystkich eksperymentach zawsze staraj się wziąć ten sam płat z kawałkiem tej samej wielkości. Podobnie w przypadku nerek i płuc należy wziąć tę samą nerkę i płuco. Jeśli cytometria przepływowa ma być również zakończona, każdy narząd może zostać przecięty na pół. Przechowuj połówkę, która ma być użyta do cytometrii, w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia zbiorów.
    2. Natychmiast po pobraniu umieść każdy narząd w oznakowanej probówce i umieść w kąpieli z suchym lodem. Miano wirusa zmniejsza się z czasem w temperaturze pokojowej, dlatego czas potrzebny na pobranie narządów jest niezwykle ważny. Myszy muszą być spójne, więc po bezpieczeństwie kolejnym priorytetem jest szybkość.
      nuta: W przypadku pobierania narządów do mian wirusów, bardzo pomocne jest pobranie mózgu przez drugą osobę w tym momencie, aby zachować miana wirusa.
  9. Usuń pozostałe narządy z jamy ciała myszy, aby uzyskać dostęp do kręgosłupa i czaszki.
    1. Zdejmij mysz z planszy i usuń futro, a następnie usuń ręce i nogi.
      Usuń głowę myszy za pomocą nożyczek do dekapitacji, lub chirurgicznych, aby pobrać mózg, przecinając czaszkę ząbkowanymi nożyczkami LaGrange przez otwór wielki. Następnie oderwij czaszkę kleszczami i zgarnij mózg szpatułką.
    2. Za pomocą mocnych, stępionych nożyczek usuń żebra i inne kości otaczające kręgosłup. Następnie przetnij kość miednicy, odsłaniając otwór kręgowy na poziomie lędźwiowym. W tym miejscu powinna być widoczna mała końcówka rdzenia kręgowego.
    3. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej PBS i igły 18 G, aby wydalić rdzeń kręgowy poprzez "przepłukanie" rdzenia kręgowego od odcinka lędźwiowego do odcinka szyjnego kręgosłupa na szalce Petriego.
    4. Ostrożnie umieść ściętą końcówkę igły wewnątrz otworu kręgowego, unikając nadmiernego nacisku, aby zapobiec wtargnięciu igły w trzon kręgu. Przytrzymać mocno, aby wywrzeć nacisk na trzon kręgu i igłę, a następnie nacisnąć tłok strzykawki, aby usunąć pępowinę. Natychmiast przenieś rdzeń kręgowy do oznaczonej rurki i umieść w kąpieli z suchym lodem.
  10. Powtarzaj procedurę ze wszystkimi zwierzętami, aż do zakończenia zbiorów. Umieść narzędzia żniwne w 70% etanolu między zwierzętami. Postaw na spójność i szybkość. Odstęp czasu między poszczególnymi pobraniami narządów powinien być stały, aby nie zniekształcać wyników miana wirusa.
  11. Po zakończeniu należy zdezynfekować komorę bezpieczeństwa biologicznego i wszystkie materiały przed wyjęciem jej z pomieszczenia dla zwierząt.
  12. Wyjmij każdą probówkę z łaźni lodowej i zważ probówki, aby określić wagę narządów. Aby określić masę narządów, odejmij masę pustej probówki od masy narządu zawierającego probówkę.
    nuta: Na tym etapie narządy mogą zostać zamrożone w temperaturze -80 °C w celu dalszego przetwarzania w późniejszym terminie lub narządy mogą być homogenizowane bezpośrednio przed zamrożeniem pojedynczych podwielokrotności. Wielokrotne zamrażanie rozmrażających próbek zmniejsza miano wirusa. Dlatego ważne jest, aby wykonać tę samą procedurę dla wszystkich eksperymentów w ramach jednego projektu.

2. Homogenizacja narządów

  1. Przygotuj 3 znakowane probówki z zatrzaskami o pojemności 1,5 ml dla każdego narządu, który ma być homogenizowany.
  2. Jeżeli próbki nie są homogenizowane bezpośrednio po zbiorze, należy usunąć probówki z temperatury -80 °C. Próbki nie muszą być rozmrażane w celu homogenizacji.
  3. Umieść próbki na lodzie, aby były zimne, aby zminimalizować utratę miana wirusa. Następnie dodaj 1 ml zimnego DMEM zawierającego 5% FBS do każdego narządu zawierającego probówkę.
  4. Natychmiast ubij rurki w ubijaku do koralików zgodnie z instrukcjami producenta. Homogenizuj wszystkie narządy za pomocą stalowych kulek w urządzeniu do homogenizowania kulek. Sprawdź, czy każdy narząd został całkowicie zhomogenizowany.
  5. Odwiruj szczątki narządów w mikrofudze o sile 12 000 x g przez 5 minut w mikrofudze schłodzonej do 8 °C. Następnie włóż rurki z powrotem do wiadra z lodem. W komorze bezpieczeństwa biologicznego porcjować próbki do probówek w celu przeprowadzenia niezbędnych testów. Następnie włóż rurki z powrotem do wiadra z lodem.
  6. Do testu tworzenia ostrości należy podać 500 μl do oznakowanej probówki. Następnie umieść rurki w stojaku na wiaderku z lodem. Podwielokrotność 50 μl do probówki na RNA do fluorogenicznego ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) w celu pomiaru liczby kopii genomu wirusa.
  7. Wyizolować całkowite RNA z narządów zakażonych zwierząt za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA. Określ RNA wirusa flawiwirusa za pomocą zestawów sond starterowych specyficznych dla ZIKV, które rozpoznają unikalne sekwencje w każdym genomie flawiwirusa. Określ liczbę kopii wirusa za pomocą plazmidu kontrolnego zawierającego zdefiniowany dodatni jednoniciowy RNA wygenerowany in vitro przy użyciu polimerazy T7 zawierającej docelowe sekwencje ZIKV.
  8. Pozostałą próbkę, o objętości około 300 μl, przelać do trzeciej probówki i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -80 °C.
    nuta: Jeżeli próbki nie były wcześniej zamrożone, należy je zamrozić w temperaturze -80 °C. Jeśli próbki zostały wcześniej zamrożone, przed zatrzymaniem należy przejść do testu tworzenia ogniska i/lub izolacji RNA.

3. Test na tworzenie ogniska wirusa Zika26

UWAGA: Ważne jest, aby uwzględnić kontrolę bez wirusa i kontrolę pozytywną. Kontrola pozytywna jest serią rozcieńczeń zapasu wirusa o znanym stężeniu. Nie wszystkie kontrole muszą znajdować się na tej samej płytce, ale gdy test staje się większy niż 5 płytek, należy dodać więcej kontroli i rozłożyć je na płytkach. Uważaj, aby nie zarysować monowarstwy ani końcówkami pipet, ani przez energiczne mycie. Miano wielu narządów może być natłuszczane tego samego dnia lub w różnych dniach. Jednak pojedynczy narząd nie powinien być miężny przez wiele dni, ponieważ różne warunki testowe mogą wpływać na miano wirusa. Zdecydowanie zaleca się uruchomienie pojedynczego narządu w ciągu jednego dnia.

  1. Przed dniem przeprowadzenia testu należy przygotować komórki i odczynniki potrzebne do przeprowadzenia testu ogniskowania.
    1. Przygotować pożywkę wzrostową zawierającą 500 ml DMEM z 5 ml HEPES i 25 ml FBS. Mieć komórki Vero-Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) rosnące w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed rozpoczęciem testu. Komórki Vero nie powinny mieć wysokiego pasażu ani nigdy nie powinny rosnąć ponad 100% zbiegu przed rozpoczęciem testu.
    2. Przygotować 500 ml 2% roztworu metylocelulozy przez autoklawowanie szklanej butelki o pojemności 1 l z 10 g metylocelulozy i dużym mieszadłem oraz oddzielnej szklanej butelki o pojemności 1 l z 500 mlH2O. Jeśli woda w autoklawie ostygła, podgrzej ją w kuchence mikrofalowej, aż butelka będzie gorąca w dotyku, ale nie wrząca.
    3. Delikatnie wlej ciepłą/gorącą wodę do butelki z metylocelulozą w kapturze do hodowli tkankowej. Częściowo zakręć butelkę i mieszaj na płycie grzejnej, aż metyloceluloza znajdzie się w roztworze (1-4 godziny). Podwielokrotność 2% roztworu metylocelulozy przelać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 2% metylocelulozy można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
    4. Przygotować 5% roztwór paraformaldehydu w PBS do utrwalenia płytek i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Przygotować 1x bufor do płukania do prób formowania ostrości, dodając 0,05% Triton X-100 do PBS i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować 1x bufor barwiący FFA, dodając 1 mg / ml saponiny do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu potrzeby. Można je przygotować z jedno-dwutygodniowym wyprzedzeniem.
  2. Obliczyć liczbę płaskodennych 96-dołkowych płytek potrzebnych do oznaczenia, tak aby każdy narząd był posiany w trzech egzemplarzach. Uwzględnij wystarczającą liczbę dodatkowych studzienek do kontroli dodatnich i ujemnych.
    1. Wyhoduj wystarczającą liczbę komórek Vero w pożywce wzrostowej, aby ukończyć zaprojektowany test. Trypsynizuj komórki Vero i policz je, zawieszając je ponownie w 1,5 x 105 komórek na ml w pożywce wzrostowej. Umieść komórki Vero w 96 dołkach z płaskim dnem w 3,0 x 104 komórkach Vero-WHO / studzience w pożywkach wzrostowych, dodając 200 μl na studzienkę.
    2. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez noc, upewnić się, że płytki są wypoziomowane w inkubatorze, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w studzience.
      nuta: Każde laboratorium hoduje komórki Vero nieco inaczej; celem jest 90-95% zlewającej się monowarstwy w każdym studzience w dniu testu na obecność wirusa Zika.
  3. Rozcieńczyć próbki wirusa Zika w dniu testu. Jeżeli próbki narządów były wcześniej homogenizowane, wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić do rozmrożenia przed umieszczeniem próbek na lodzie w celu przeprowadzenia testu.
    1. Na lodzie przygotuj okrągłodenną płytkę 96-dołkową, dodając 180 μl zimnej pożywki wzrostowej do rzędów od B do H, pozostawiając rząd A pusty. Dodać 150 μl każdej homogenizowanej próbki narządu do rzędu A okrągłej płytki dennej.
    2. Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenia każdej próbki za pomocą pipety wielokanałowej. Rozcieńczyć próbki na okrągłodennej 96-dołkowej płytce, dodając 20 μl próbki do 180 μl pożywki wzrostowej, zmieniając końcówki pipet między każdym rozcieńczeniem.
  4. Przygotuj płytkę tworzącą ognisko, usuwając pożywkę z płaskiej płytki 96-dołkowej pokrywającej komórki Vero. Zrób to bezpośrednio przed dodaniem próbek wirusa, aby zapobiec wysychaniu monowarstwy.
    1. Dodać 100 μl rozcieńczenia wirusa do każdego dołka na płytce Vero. Dodaj próbkę za pomocą tego samego zestawu końcówek, przechodząc od najniższego do najwyższego stężenia. Płyty skalne na boki 2-4 razy, uważając, aby nie zawirować.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 godziny. Upewnij się, że płytki w inkubatorze są wypoziomowane. Podczas inkubacji rozgrzać 2% metylocelulozy do RT.
    3. Rozcieńczyć 2% roztwór metylocelulozy w pożywce wzrostowej. Rozcieńczenie powinno być w stosunku około 2:1 2% metylocelulozy do pożywki wzrostowej. Utrzymuj w temperaturze pokojowej, aż nadejdzie czas użycia. Dodać 1-2 krople/dołek (ustawić pipetę na 125 μl) pożywki metylocelulozowej: pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
    4. Inkubować 32-40 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ponieważ komórki Vero każdego z nas rosną nieco inaczej, czynniki takie jak zbieganie się komórek i szczep wirusa Zika mogą zmienić czas inkubacji.
  5. Napraw komórki Vero za pomocą przygotowanego 5% roztworu paraformaldehydu.
    1. Dodaj 50 μl 5% paraformaldehydu do każdej studzienki na wierzchu warstwy metylocelulozy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalanie można przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C, ale przykryj płytkę parafilmem, aby zmniejszyć parowanie.
    2. Zrzuć nakładkę i media z komórek do pojemnika na odpady wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umyć delikatnie PBS, 150 μL/studzienkę. Usuń PBS z płytek i wyjmij płytkę z BSL-2.
    3. Powtórzyć płukanie PBS 2x, dodając 150 μL/studzienkę. Następnie wyjmij PBS. Dodaj 150 μl / studzienkę 1x bufor do płukania FFA i pozostaw na 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność utrwalonych komórek.
  6. Wykryj infekcję za pomocą pierwotnego przeciwciała Zika. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe 4G2 (D1-4G2-4-15) o stężeniu 1 μg/ml w buforze barwiącym FFA. Przygotuj wystarczającą ilość przeciwciał do całego testu.
    nuta: Trzymaj się z dala od pieluch laboratoryjnych lub innych materiałów chłonnych o wysokiej zawartości kłaczków, ponieważ włókna będą miały negatywny wpływ na obrazowanie ognisk.
    1. Usuń bufor myjący FFA z płytek. Dodać 50 μl/basenik pierwszorzędowego przeciwciała do buforu barwiącego FFA. Uszczelnić płytki parafilmem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Test można przeprowadzić z inkubacją przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Wizualizacja infekcji poprzez dodanie drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z HRP. Przygotować wtórne przeciwciało anty-mysie znakowane HRP w stężeniu 1:5 000 w buforze barwiącym FFA. Przygotuj wystarczającą ilość przeciwciał do całego testu.
    1. Umyj komórki 3x buforem do mycia FFA, usuwając bufor myjący, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Wybarwić komórki przeciwciałem drugorzędowym w buforze barwiącym FFA w stężeniu 50 μl/basenik. Inkubować 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Umyj komórki 3x buforem do mycia FFA, usuwając bufor myjący, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Dodać 50 μl/studzienkę substratu Trueblue.
    3. Uważnie obserwuj płytki, czekając 2-15 minut, aż plamy będą w pełni zdefiniowane, a tło minimalne. Po wyświetleniu plam delikatnie umyj je wodą, chroniąc monowarstwę dłonią przed siłą płynącej wody. Osusz ręczniki papierowe (NIE PIELUCHY) i zobrazuj tak szybko, jak to możliwe.
    4. Spoty mogą być liczone ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika spotów. W przypadku ręcznego liczenia można użyć lunety do analizy, aby pomóc w wizualizacji.
    5. Dla każdej próbki należy wybrać rozcieńczenie z łatwo rozróżniającymi ogniskami (np. 20 do 200 na dołek) i obliczyć miano w jednostkach tworzących ognisko na ml (FFU/ml), używając średniej z podwójnych dołków: FFU / ml = (średnia ogniska / studzienka) × (współczynnik rozcieńczenia) ÷ (ml inokulum).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić miana ZIKV za pomocą protokołu opisanego powyżej, myszy Ifnar1-/- zostały zainfekowane ZIKV (PRVABC59) poprzez wstrzyknięcie podskórne (SC) do opuszki stopy. W tym przypadku podanie 1 x 105 FFU ZIKV 8-12-tygodniowym myszom Ifnar1-/- SC nie jest śmiertelne, ale wirus może replikować się zarówno na obrzeżach, jak i w OUN. Ta dawka i droga są wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej patogenu gospodarza i chorobotwórczo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem ZIKV może powodować chorobę neurologiczną, dlatego obecne modele zwierzęce do badania patogenezy, odpowiedzi immunologicznych i skuteczności ochronnej szczepionek i leków przeciwwirusowych muszą koncentrować się na kontroli wirusa w obrębie OUN. Jednym z wyzwań związanych ze skupieniem się na chorobach ośrodkowego układu nerwowego jest to, że często odbywa się to kosztem badania infekcji obwodowych. Zaproponowane tutaj metody izolacji narządów koncentrują się na potrzebie szybkiej oceny zakażenia ZIKV z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Pinto jest finansowany z grantu zalążkowego z Saint Louis University School of Medicine i funduszy startowych z Saint Louis University School of Medicine. Dr Brien jest finansowany przez K22AI104794 wczesnego badacza z NIH NIAID, a także grant zalążkowy ze Szkoły Uniwersytetu Saint Louis. W przypadku wszystkich finansowanych osób grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-chloropropan (BCP)MRCBP151
Strzykawka 10 ccThermo Fisher ScientificBD 309642
18 GThermo Fisher Scientific22-557-145
Strzykawka 1 cc TBThermo Fisher Scientific14-823-16H
20 ccThermo Fisher Scientific05-561-66
24-rurkowy młynek do koralikówThermo Fisher Scientific15 340 163
Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mmThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° C Inkubator kultur tkankowychPrzeciwciało Nuair5800
4G2w domu
96-dołkowe płytki z płaskim dnemMidsciTP92696
96-dołkowe okrągłe płytki denneMidsciTP92697
Basix 1,5 ml ThermoFisher Scientific02-682-002
Skoncentrowane bakteriobójczezszywki wybielające30966CT
Analizator CTL S6Uniwersalny analizatorCTL
Zakrzywione nożyczki do cięciaNarzędzia do nauki precyzyjnej14061-11
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia - wysoka glukoza Z 4,500 mg / L glukozyMiliporeSigmaD5671
Etanol (klasa biologii molekularnej)MilliporeSigmae7023
Płodowa surowica bydlęcaMilliporeSigmaF0926-500ML
KleszczeFine Science Tools11036-20
Lodowaty kwas octowyMilliporeSigma537020
Koza przeciwciało anty-mysie znakowane HRPMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Izopropanol (klasa biologii molekularnej)MilliporeSigmaI9516
Koktajl ketamina/ksylazynaMedycyna
L-glutaminaMilliporeSigmag7513
Magmax RNA zestaw do oczyszczaniaThermo Fisher ScientificAM1830
Milipore,metylocelulozaSigmaM0512
MikrowirówkaEpendorf5424R
MiniCollect 0,5 ml probówki EDTABio-one450480
Rurki O-ringThermo Fisher Scientific21-403-195
Jednoetapowa mieszanka q RT-PCRThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehydThermo Fisher ScientificEMS-15713-S
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemMilliporeSigmad8537-500ml
Pipety wielokanałowe ProlineSartorius72230/72240
Pipety jednokanałowe ProlineSartorius728230
Woda wolna od RNAzywaThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC genRB192
Platforma bujanaThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinMilliporeSigmas7900
Łyżka/szpatułkaFine Science Tools10090-17
Prosty nożyczki do cięciaFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
Prawdziwe niebieskie podłożeVWR95059-168
TrypsynaMilliporeSigmaT3924-100ML
Strzykawka S6porównawcza

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles