Artykuł metodologiczny

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59633

⸱

26 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Streszczenie

Najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z rakiem są przerzuty, proces, który wymaga rozproszenia komórek rakowych z guza pierwotnego do miejsc wtórnych. Niedawno ustaliliśmy, że rozsiew komórek rakowych w pierwotnym raku piersi i w miejscach przerzutów w płucach zachodzi tylko w drzwiach zwanych mikrośrodowiskiem guza z przerzutami (TMEM). Numer drzwi TMEM jest prognostykiem dla odległego nawrotu choroby przerzutowej u pacjentek z rakiem piersi. Drzwi TMEM składają się z komórki rakowej, która nadmiernie eksprymuje białko regulatorowe aktyny Mena w bezpośrednim kontakcie z okołonaczyniowym, proangiogennym makrofagiem, który wyraża wysokie poziomy TIE2 i VEGF, gdzie obie te komórki są ściśle związane z komórką śródbłonka naczynia krwionośnego. Komórki rakowe mogą przenikać do wnętrza przez drzwi TMEM z powodu przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych zaaranżowanej przez wspólną aktywność makrofagów związanych z TMEM i komórek rakowych wykazujących ekspresję MONA związanych z TMEM. W niniejszym artykule opisano dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń za pośrednictwem TMEM: obrazowanie przyżyciowe i immunofluorescencja tkanek stałych. Chociaż obie metody mają swoje zalety i wady, połączenie ich może zapewnić najbardziej kompletne analizy przepuszczalności naczyń krwionośnych za pośrednictwem TMEM, a także mikrośrodowiskowych warunków wstępnych dla funkcji TMEM. Ponieważ proces przerzutowy w raku piersi i prawdopodobnie w innych rodzajach raka obejmuje rozsiewanie komórek rakowych przez drzwi TMEM, konieczne jest zastosowanie dobrze ugruntowanych metod analizy aktywności wejścia TMEM. Dwie opisane tutaj metody zapewniają kompleksowe podejście do analizy aktywności wejściowej TMEM, zarówno u zwierząt wcześniej leczonych, jak i leczonych farmakologicznie, co ma ogromne znaczenie dla badań przedklinicznych środków zapobiegających rozprzestrzenianiu się komórek nowotworowych za pośrednictwem TMEM.

Wprowadzenie

Ostatnie postępy w naszym zrozumieniu przerzutów nowotworowych ujawniły, że przejście z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) i indukcja migrującej/inwazyjnej subpopulacji komórek nowotworowych same w sobie nie są wystarczające do rozpowszechnienia hematogennego1. Rzeczywiście, wcześniej sądzono, że przerzuty komórek rakowych wewnątrznaczyniowych przez cały śródbłonek związany z rakiem jako neowaskulatura guza często charakteryzują się niskim pokryciem perycytów i jako takie są wysoce przepuszczalne i niestabilne2,3,4. Chociaż wysoce sugerują wadliwe funkcje w obrębie guza, modyfikacje naczyń krwionośnych podczas kancerogenezy same w sobie nie dostarczają dowodów na to, że komórki nowotworowe mogą łatwo i w niekontrolowany sposób przenikać do naczyń krwionośnych. Wnioski z badań obrazowania przyżyciowego (IVI), w których komórki nowotworowe są znakowane fluorescencyjnie, a unaczynienie jest znakowane poprzez dożylne wstrzyknięcie sond fluorescencyjnych (takich jak dekstran lub kropki kwantowe), pokazują, że podczas gdy naczynia nowotworowe są jednolicie przepuszczalne dla dektransu o niskiej masie cząsteczkowej (np. 70 kD), dektrans o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kD) i komórki nowotworowe mogą przenikać przez śródbłonek tylko w wyspecjalizowanych miejscach wewnątrznaczynienia, które są preferencyjnie zlokalizowane w punkcie rozgałęzienia naczyniowego5,6,7. Analizy immunohistochemiczne (IHC) z wykorzystaniem modeli zwierzęcych i materiału pochodzącego od pacjentów wykazały, że miejsca te są "drzwiami", które specjalizują się w regulacji przepuszczalności naczyń krwionośnych, lokalnie i przejściowo, zapewniając krótkie okno możliwości dla migrujących/inwazyjnych komórek nowotworowych do wejścia do krążenia. Drzwi te nazywane są "Mikrośrodowiskiem Nowotworu Przerzutów" lub "TMEM" i, jak można się spodziewać, ich gęstość koreluje ze zwiększonym ryzykiem rozwoju choroby przerzutowej u pacjentek z rakiem piersi8,9,10.

Każde wejście TMEM składa się z trzech różnych typów komórek: makrofaga okołonaczyniowego, komórki nowotworowej nadmiernie wyrażającej białko regulatorowe aktyny dla ssaków (Mena) oraz komórki śródbłonka, wszystkie pozostające ze sobą w bezpośrednim kontakcie fizycznym1,5,9,10,11,12,13. Kluczowym wydarzeniem dla funkcji TMEM jako bramy wewnątrznaczyniowej jest miejscowe uwalnianie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) do leżącego poniżej naczynia przez makrofagi okołonaczyniowe14. VEGF może zakłócać homotypowe połączenia między komórkami śródbłonka15,16,17,18,19, zjawisko, które powoduje przejściowy przeciek naczyniowy, znany również jako przepuszczalność "pękająca", zgodnie z opisem w badaniach IVI 5. Wykazano, że makrofagi TMEM wyrażają receptor kinazy tyrozynowej TIE2, który jest niezbędny do funkcji TMEM za pośrednictwem VEGF i naprowadzania tych makrofagów do niszy okołonaczyniowej5,20,21,22. Oprócz regulacji rozprzestrzeniania się komórek rakowych i przerzutów, wykazano, że makrofagi TIE2+ są centralnymi regulatorami angiogenezy guza21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. W związku z tym makrofagi TIE2+ stanowią krytyczny składnik mikrośrodowiska guza i główny regulator kaskady przerzutowej.

Aby lepiej zrozumieć przepuszczalność naczyń krwionośnych za pośrednictwem TMEM (tj. "pękanie"), bardzo ważne jest odróżnienie jej od innych sposobów przepuszczalności naczyń, które nie są związane z rozpuszczaniem połączeń komórka-komórka śródbłonka. W nienaruszonym śródbłonku (takim, którego ścisłe i przylegające połączenia nie są przerwane) istnieją trzy główne typy przepuszczalności naczyń: (a) pinocytoza, która może, ale nie musi, być sprzężona z transcytozą spożytego materiału; b) transport materiału przez okna śródbłonka; oraz (c) transport materiału przez szlak przykomórkowy, który jest regulowany przez ścisłe połączenia śródbłonka15,16,17,18,19,32,33,34. Chociaż w wielu nowotworach są one rozregulowane, wyżej wymienione tryby przepuszczalności naczyń krwionośnych zostały opisane głównie w kontekście prawidłowej fizjologii i homeostazy tkanek, których skrajne są tkanki o ograniczonej przepuszczalności (np. bariera krew-mózg, bariera krew-jądra), albo o dużej przepuszczalności (np. fenestrowane naczynia włosowate aparatu kłębuszkowego nerkowego)34,35,36,37.

Korzystając z wielofotonowego obrazowania intravital i multipleksowanej mikroskopii immunofluorescencyjnej, jesteśmy w stanie odróżnić przepuszczalność naczyń za pośrednictwem TMEM ("pękanie") od innych sposobów przepuszczalności naczyń w guzach piersi. Aby to osiągnąć, wykonujemy pojedyncze wstrzyknięcie dożylne sondy znakowanej fluorescencyjnie o dużej masie cząsteczkowej u myszy. Spontaniczne pęknięcia można następnie uchwycić za pomocą obrazowania przyżyciowego u żywych myszy; lub alternatywnie, wynaczynienie sondy można określić ilościowo za pomocą badań kolokalizacji z unaczynieniem krwi (np. CD31+ lub Endomucin+) i drzwiami TMEM przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawione tutaj protokoły opisują obie te techniki, które mogą być stosowane niezależnie lub w połączeniu ze sobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem żywych zwierząt muszą być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. Procedury opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych oraz za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Albert Einstein College of Medicine (IACUC).

1. Ocena "przenikalności na rozerwanie" przy użyciu obrazowania żywych zwierząt

  1. Przeszczepianie syngenicznych guzów piersi do gospodarzy myszy z fluorescencyjnymi makrofagami
    1. Wygeneruj kawałki tkanki nowotworowej nadające się do przeszczepu.
      1. Generowanie znakowanych fluorescencyjnie guzów w modelach raka sutka u myszy, krzyżując spontaniczne, autochtoniczne, genetycznie zmodyfikowane myszy myszy z rakiem sutka MMTV-PyMT z transgenicznymi myszami wykazującymi ekspresję fluorescencyjnych reporterów38,39 [np. wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), wzmocnione białko fluorescencyjne cyjanu (ECFP) lub Dendra2].
      2. Pozwól myszom MMTV-PyMT z fluorescencyjnie znakowanymi guzami urosnąć do rozmiaru nie większego niż 2 cm (w wieku około 10-12 tygodni).
      3. Poddaj eutanazji myszy z guzem MMTV-PyMT, umieszczając je w komorze z 5% izofluranem do 30 sekund po ustaniu wszystkich oddechów.
      4. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
      5. Usuń włosy z brzucha myszy poddanej eutanazji za pomocą miejscowego kremu do depilacji.
      6. Umieścić na lodzie szalkę Petriego z pożywką do hodowli komórkowych DMEM/F12.
      7. Umieść mysz i szalkę Petriego na lodzie w dygestorium.
      8. Zdezynfekuj brzuch myszy 70% alkoholem etylowym.
      9. Za pomocą sterylnych rękawiczek i narzędzi chirurgicznych (wysterylizowanych nożyczek, kleszczy i ostrza) usuń guzy i umieść je na szalce Petriego.
      10. Pokrój guz na małe kawałki (o wymiarach ~2 mm x 2 mm x 2 mm), odrzucając wszelkie martwicze części, gdy znajdują się na szalce Petriego.
    2. Przeszczep fragmenty guza do gospodarzy biorców.
      1. Wychowuj myszy za pomocą genetycznie modyfikowanych fluorescencyjnie makrofagów, np. MacGreen40 lub MacBlue 41 myszy (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Pozwól myszom FVB z fluorescencyjnie znakowanymi makrofagami osiągnąć wiek ~ 4-6 tygodni).
      3. Znieczulij myszy FVB fluorescencyjnie znakowanymi makrofagami w komorze przy użyciu 5% izofluranu z tlenem jako gazem nośnym.
      4. Zmniejsz znieczulenie do ~3% izofluranu i nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
      5. Usuń włosy z ponad 4 gruczołu sutkowego myszy.
      6. Oczyść skórę za pomocą betadyny. Ważne jest, aby zachować sterylne warunki przez pozostałą część zabiegu. Obejmuje to używanie wysterylizowanych narzędzi i odczynników.
      7. Wykonaj małe nacięcie ~ 2-3 mm tuż poniżej 4brodawki sutkowej.
      8. Wypreparuj, aż poduszeczka tłuszczowa sutka zostanie odsłonięta.
      9. Weź kawałek guza z szalki Petriego i pokryj go sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową.
      10. Przeszczep guzy pod 4poduszeczkę tłuszczową sutka.
      11. Zamknij nacięcie za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
      12. Stale monitoruj zwierzę, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia i będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie należy również zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt do czasu pełnego wyzdrowienia.
      13. Aby zminimalizować infekcje, dodaj 1 ml antybiotyku enrofloksacyny 100 mg / ml do butelki z wodą pitną zwierzęcia (8 uncji).
      14. Pozwól guzom rosnąć aż do wyczuwalnego palpacyjnie (~5 mm; ~4 tygodnie).
      15. W zależności od eksperymentu, przydziel myszy do grup poddanych działaniu substancji i wykonaj odpowiednie zabiegi, jeśli ma to zastosowanie.
  2. Zestaw do obrazowania przyżyciowego
    1. Włącz dwufotonowy laser i detektory mikroskopu.
    2. Włącz skrzynkę grzewczą i podgrzej stolik x-y mikroskopu.
    3. Umieść wykonany na zamówienie stage insert42 w x-y stage.
  3. Przygotowanie okna obrazowania
    1. Przed przystąpieniem do obrazowania należy przeprowadzić autoklaw autoklawu wykonane na zamówienie okrągłe okno obrazowania frame42.
    2. Za pomocą pipety lub strzykawki insulinowej umieść cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na ramie okiennej i przymocuj okrągłą szklaną pokrywę o średnicy 8 mm.
      UWAGA: 1) Ważne jest, aby uniknąć pozostawiania osadów na przezroczystym otworze szkła nakrowego. 2) Ważne jest, aby przykleić szkło nakrywkowe do ramy okiennej co najmniej 1 godzinę przed użyciem do obrazowania.
    3. Ostrożnie wytrzeć nadmiar cyjanoakrylanu na przezroczystym otworze szkła nakrywkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej zwilżonej niewielką ilością acetonu.
  4. Przygotowanie cewnika do żyły ogonowej do podawania płynów i barwników fluorescencyjnych podczas obrazowania
    1. Wytnij 30-centymetrowy kawałek rurki polietylenowej, aby zbudować cewnik do żyły ogonowej.
    2. Odłączyć część igły 30 G od stożka Luer, delikatnie zginając igłę w przód i w tył, aż do pęknięcia.
      UWAGA: Igła powinna być trzymana blisko stożka Luer, a nie końcówki igły. Można to zrobić za pomocą szczypiec lub kleszczy, aby chwycić igłę, aby zapobiec zranieniu igły.
    3. Włóż koniec igły do jednego końca rurki polietylenowej.
    4. Włóż ostry koniec kolejnej igły 30 G, trzymając jej stożek Luer, do przeciwległego końca rurki.
    5. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, przymocuj ją do stożka Luer zmontowanego cewnika i przepłucz cewnik do żyły ogonowej, upewniając się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. W celu znakowania naczyń krwionośnych napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 100 μl 10 mg/kg 155 kDa dektran-tetrametylorodaminy (TMR) lub kropek kwantowych.
  5. Przygotowanie myszy do obrazowania
    1. Znieczul mysz w klatce pod (~ 1 stopa poniżej) lampy grzewczej za pomocą 4%-5% izofluranu zmieszanego ze 100% tlenem ustawionym na przepływ 1,5-2 l na minutę.
    2. Włącz lampę grzewczą nad chirurgicznym obszarem roboczym. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania fizjologicznej temperatury ciała myszy podczas operacji.
    3. Umieść mysz pod lampą grzewczą i obniż znieczulenie do 2%-3% na czas trwania zabiegu.
      UWAGA: Pamiętaj, aby trzymać lampę grzewczą w bezpiecznej odległości (~1 stopa) od myszy, aby uniknąć przegrzania.
    4. Umieść maść okulistyczną na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu oczu i ślepocie.
    5. Sprawdź, czy mysz jest znieczulona, wykonując test szczypania palców u stóp. Jeśli zwierzę się wycofa, zwiększ dawkę izofluranu o 1% i przetestuj ponownie za 1-2 min.
    6. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej w najbardziej dystalnym punkcie ogona.
    7. Przymocuj cewnik do żyły ogonowej do ogona za pomocą małego kawałka taśmy laboratoryjnej, która owija się wokół ogona i przykleja się do igły, aby upewnić się, że nie zostanie usunięta.
    8. Wstrzyknąć 50 μl PBS na godzinę przez cewnik do żyły ogonowej, aby zapewnić odpowiednie nawodnienie. Bardzo ważne jest, aby unikać wstrzykiwania zbyt dużej ilości płynu (nie więcej niż 200 μl na godzinę) lub pęcherzyków powietrza do cewnika, ponieważ może to być śmiertelne dla myszy.
    9. Usuń włosy z brzucha nad 4. i 5. gruczołem sutkowym za pomocą kremu do depilacji.
    10. Oczyść skórę betadyną i pozostaw do wyschnięcia.
    11. Wykonaj podłużne nacięcie w linii środkowej, zaczynając bezpośrednio nad narządami płciowymi i przenieś nacięcie do poziomu górnej części czwartego gruczołu sutkowego.
    12. Przenieś nacięcie poprzecznie do górnej części 4. gruczołu sutkowego. Bardzo ważne jest, aby w tym momencie nie dopuścić do pogorszenia dopływu krwi.
    13. Wyciąć poduszeczkę tłuszczową sutka z otrzewnej, tworząc płat tkankowy za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek.
      UWAGA: Obrazowanie płatów skóry jest podatne na znaczne artefakty ruchowe i odwodnienie tkanek. Unika się ich, jak opisano wcześniej43,44, poprzez przymocowanie sztywnego kawałka gumy z tyłu do strony skóry płata (w celu usztywnienia tkanki miękkiej i odizolowania jej od reszty ciała), a następnie umieszczenie guza w płytkim oknie obrazowania, aby zachować nawodnienie. Ma to kluczowe znaczenie dla stabilnego obrazowania, ponieważ guz i otaczająca tkanka w tym otoczeniu są bardzo zgodne.
    14. Ustabilizować płat skóry, przyklejając (za pomocą kleju cyjanoakrylowego) mały kawałek sztywnej gumy o wymiarach 2 cm x 2 cm po stronie skóry płata. Guz powinien znajdować się w środku obszaru stabilizowanego przez gumę.
    15. Utrzymuj odsłoniętą tkankę nawodnioną kroplami PBS.
    16. Nałóż małą warstwę cyjanoakrylanu na zewnętrzną krawędź wykonanej na zamówienie ramy okna obrazowania.
    17. Nałóż małą kroplę PBS (~10–20 μl) na środek szkła nakrywkowego.
    18. Osusz otaczającą tkankę płata chusteczką laboratoryjną. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że cyjanoakrylan na ramie okiennej nie styka się z PBS na szybie, ponieważ może to spowodować polimeryzację i przedwczesne związanie cyjanoakrylanu.
    19. Przymocuj małe okienko obrazowania do płata tkankowego z guzem w środku przezroczystego otworu.
    20. Wyjmij skrzynkę grzewczą ze sceny.
    21. Przenieś znieczulony cewnik myszy i żyły ogonowej do etapu mikroskopu. Zachowaj szczególną ostrożność, aby upewnić się, że cewnik żyły ogonowej nie wypadnie.
    22. Umieść mysz na scenie w pozycji leżącej.
    23. Umieścić stożek nosowy izofluranu nad pyskiem, aby zapewnić utrzymanie znieczulenia.
    24. Włóż okienko do otworu na niestandardowej płycie stolika x-y.
    25. Umieść skrzynkę grzewczą z powrotem na scenie, aby utrzymać fizjologiczną temperaturę.
    26. Monitoruj parametry życiowe zwierzęcia, mocując sondę pulsoksymetru za pomocą czujnika klipsowego do tylnej łapy.
    27. Powoli zmniejszaj izofluran do 0,5%-1%, aby utrzymać odpowiedni przepływ krwi i uniknąć nadmiernego znieczulenia myszy.
  6. Obrazowanie przyżyciowe
    UWAGA: Obrazowanie, które opisujemy w tej sekcji, zostało wykonane na specjalnie zbudowanym dwulaserowym mikroskopie wielofotonowym, który został wcześniej opisany5,39,45. Krótko mówiąc, laser femtosekundowy służy do generowania 90-sekundowego impulsowego światła laserowego wyśrodkowanego na 880 nm. Światło fluorescencyjne jest wykrywane za pomocą trzech z czterech jednocześnie rejestrujących detektorów (niebieski = 447/60, zielony = 520/65 i czerwony 580/60; centralna długość fali/szerokość pasma) po oddzieleniu od światła wzbudzenia przez dichroik (Chroma, Z720DCXXR). Statyw mikroskopu zawiera soczewkę obiektywową o dużej odległości roboczej (2 mm) 25x, 1,05 NA (apertura numeryczna). Należy zauważyć, że chociaż użyliśmy mikroskopu zbudowanego na zamówienie, opisany poniżej protokół można również zrealizować na dowolnym dostępnym na rynku mikroskopie wielofotonowym.
    1. Umieść kroplę wody destylowanej między obiektywem mikroskopu 25x, 1.05 NA a szkłem nakrywkowym okna, aby nawiązać kontakt optyczny.
    2. Użyj okularu mikroskopu, aby ustawić ostrość na obszarach z fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi w pobliżu powierzchni okna.
    3. Znajdź płynące naczynia krwionośne i oznaczone makrofagi. Bardzo ważne jest, aby naczynia krwionośne miały płynny przepływ w celu oceny dynamiki układu krwionośnego.
    4. Przełącz mikroskop w tryb wielofotonowy.
    5. Ustaw górną i dolną granicę serii z, która mierzy około 50 μm.
      1. Ustaw górną granicę serii Z, używając regulatora ostrości, aby przesunąć obiektyw do żądanej pozycji początkowej, w najbardziej powierzchownej pozycji i zaznaczając tę pozycję jako zero w oprogramowaniu, klikając przycisk Z Góra.
      2. Ustaw dolną granicę serii Z, przesuwając obiektyw do najgłębszej warstwy (zwykle 50-70 μm od góry w przypadku mniejszych guzów) i klikając przycisk Z pozycja Dolna.
      3. Ustaw rozmiar kroku Z na 5 μm.
    6. Kliknij przycisk panelu Time-Lapse i ustaw odstęp czasu między akwizycjami na co najmniej 10 s, aby zapewnić odpowiedni czas na uzupełnienie wody nad soczewką obiektywu. Odbywa się to ręcznie za pomocą pipety do wyciskania na obiektywie podczas długiego upływu czasu.
    7. Wyjąć strzykawkę z PBS w cewniku do żyły ogonowej i zastąpić ją inną strzykawką zawierającą 155 kDa dekstran-TMR (tetrametylo rodaminę).
    8. Wstrzyknąć 100 μl 155 kDa dstro-TMR przez cewnik do żyły ogonowej.
    9. Po wstrzyknięciu należy wymienić strzykawkę TMR na strzykawkę PBS.
    10. Uzyskaj obrazowanie poklatkowe Z-Stack, klikając przyciski Z-Stack i Time-Lapse, a następnie klikając przycisk nagrywania.
    11. Wstrzykuj 50 μL PBS co 30-45 minut, aby utrzymać odpowiednie nawodnienie zwierzęcia. Należy unikać wstrzykiwania więcej niż 200 μl na raz, ponieważ może to spowodować przeciążenie płynem.
  7. eutanazja
    1. Zwiększyć stężenie izofluranu do 5% i utrzymywać zwierzę poniżej 5% izofluranu ze stożkiem nosowym na miejscu do 30 s po ustaniu oddychania.
    2. Usuń mysz ze stołu montażowego.
    3. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
  8. Przetwarzanie obrazu
    1. Załaduj wszystkie obrazy do ImageJ i sformatuj je do 5-wymiarowego hyperstacka (x, y, z, t i kanał koloru).
    2. Wykonaj separację nakładania się widm (tj.: GFP i CFP) i eliminację dryfu x-y z hyperstacków przy użyciu ustalonych metod38.
    3. Użyj regulacji jasności i kontrastu, aby zwiększyć poziom bieli kanału krwionośnego, tak aby sygnał tła stał się widoczny.
    4. Dla każdego wycinka z dokładnie sprawdź każdy film pod kątem oznak przejściowego wycieku naczyniowego ("pęknięcia"). Uruchamianie filmów z dużą liczbą klatek na sekundę (40 kl./s) może pomóc w tej identyfikacji.
    5. Po zidentyfikowaniu impulsu przywróć jasność tego kanału do normalnego poziomu i przytnij hyperstack do tego regionu i z-slice.

2. Ocena dekstranu pozanaczyniowego za pomocą stałej analizy tkanek

  1. Guz i przygotowanie próbki
    UWAGA:Druga część tego protokołu zakłada, że guzy piersi zostały pobrane z mysiego modelu raka piersi do przeszczepu ortotopowego (tj. MMTV-PyMT). Model ten może być taki sam jak ten opisany wpierwszej części protokołu, chociaż guzy znakowane fluorescencyjnie nie są w tym momencie konieczne.
    1. Po zakończeniu procesu doświadczalnego (tj. leczenia farmakologicznego itp.) należy wykonać wstrzyknięcie 100 μl 10 mg/ml 155 kDa dekstran-tetrametylorodaminy, 1 godzinę przed poświęceniem myszy.
    2. Poświęć myszy i zbierz guzy piersi.
    3. Utrwal guzy w 10% formalinie przez 48-72 godziny i przystąp do zatapiania parafiny.
    4. Za pomocą mikrotomu wytnij dwa sekwencyjne szkiełka o grubości 5 μm z tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Jeden szkiełko służy do barwienia dekstranu, podczas gdy drugi będzie używany do wykonywania TMEM triple-IHC, dla porównania.
      UWAGA: Protokół potrójnej immunohistochemii TMEM został opisany w innym miejscu 10.
  2. Barwienie IF i skanowanie w poszukiwaniu pierwszego z dwóch kolejnych odcinków
    1. Prześlij preparaty do standardowego protokołu deparafinizacji. Obejmuje to dwa kolejne zanurzenia w ksylenie (10 minut każde), a następnie odwodnienie w seryjnie rozcieńczonych roztworach alkoholu (100%, 95%, 70% i 50% EtOH wH2Oprzez 2 minuty każde zanurzenie).
    2. Pobrać antygen przez ogrzewanie (blisko temperatury wrzenia) skrawków zanurzonych w roztworze cytrynianu (o pH 6,0) przez 20 minut.
    3. Pozostaw próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 15-20 minut, a następnie myj w PBS 3x przez 2 minuty przy każdym myciu.
    4. Blokować przez 60-90 min w buforze blokującym (10% FBS; 1% BSA; 0,0025% żelatyny ze skóry ryb; 0,05% PBST, tj. PBS z 0,05% Tween-20).
    5. Próbki należy inkubować z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko szczurom i królikom, które są skierowane odpowiednio przeciwko endomucynie i TMR, a następnie przemyć w PBST 3 razy po 2 minuty każde.
    6. Inkubować próbki z mieszaniną drugorzędowych przeciwciał osła przeciwko szczurzej IgG (sprzężonej z Alexa-647) i króliczej IgG (sprzężonej z Alexa-488), a następnie przemyć w PBST 3x 2 minuty każda.
    7. Wykonaj rutynowe barwienie DAPI (tj. zanurz w roztworze DAPI na 5-6 minut), zamontuj szkiełka za pomocą "twardego" podłoża montażowego bez glicerolu i przechowuj w ciemnym miejscu do czasu skanowania.
    8. Aby uzyskać optymalne wyniki, zeskanuj slajdy za pomocą cyfrowego skanera całych slajdów.
  3. Analiza obrazu
    1. Uchwyć 10 pól dużej mocy (HPF) na przypadek, używając dowolnego oprogramowania odpowiedniego dla patologii cyfrowej.
    2. Zapisz kanały Endomucin (czerwony) i TMR (zielony) oddzielnie jako TIFF.
    3. Za pomocą ImageJ prześlij pliki TIFF i przekonwertuj je na obrazy 8-bitowe.
    4. Proguj obrazy 8-bitowe do poziomu kontroli negatywnej i wygeneruj dwa binaryzowane obrazy, pokazujące "maski" Endomucin i TMR.
    5. Z narzędzi binarnych wybierz opcję Wypełnij otwory w masce Endomucin.
    6. Wygeneruj i zapisz następujące pięć obszarów zainteresowania: 1) obraz progowy dekstranu jako "Dextran ROI" (ROI1), 2) progowy obraz endomucyny jako "Vascular ROI" (ROI2), 3) odwrócony obraz endomucyny jako "Extravascular ROI" (ROI3), 4) przecięty obraz "Extravascular ROI" i "Dextran ROI" (ROI1 ∩ ROI3) jako "Extravascular Dextran ROI" (ROI4), i 5) cały obraz jako "Tumor ROI" (ROI5).
    7. Podziel obszar ROI4 przez obszar ROI5 i pomnóż przez 100, aby uzyskać procentową powierzchnię, którą dekstran pozanaczyniowy pokrywa w całym guzie.
    8. Powtórz ten proces dla 10-20 HPF na przypadek (w zależności od dostępności tkanki) i wygeneruj średni dekstran zewnątrznaczyniowy (% powierzchni) dla każdego przypadku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Procedury eksperymentalne opisane w niniejszym artykule z protokołem zostały krótko podsumowane i zilustrowane na Rysunku 1A-C.

Aby zmierzyć zależną od TMEM przepuszczalność naczyniową („aktywność pękania” – bursting activity) i zredukować szum eksperymentalny wynikający z innych mechanizmów przepuszczalności naczyniowej (tj. transkomórkowej i parakomórkowej, jak wyjaśniono we wprowadzeniu), wykonaliśmy dożylne (i.v.) wstrzyknięcia sond o wysokiej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły, które można zastosować do wizualizacji i ilościowego określenia określonego rodzaju przepuszczalności naczyń krwionośnych, która jest obecna przy drzwiach TMEM i jest związana z przerwaniem połączeń naczyniowych ścisłych i przylegających. Ten rodzaj przepuszczalności naczyń krwionośnych jest przejściowy i kontrolowany przez trójdzielny kompleks komórek TMEM, jak wyjaśniono powyżej5. Zdolność do identyfikacji i ilościowego określenia przepuszczalności nacz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Analytical Imaging Facility (AIF) w Albert Einstein College of Medicine za wsparcie w zakresie obrazowania. Prace te były wspierane przez granty z NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 i CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics Center i jego Integrated Imaging Program oraz Montefiore's Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant of Surgeons for the Study of the Tumor Microenvironment (CA200561).

GSK współtworzyło manuskrypt, przeprowadziło obrazowanie dla rycin 1C i 3B, opracowało stały protokół analizy tkanek oraz przeanalizowało i zinterpretowało wszystkie dane; JMP jest współautorem manuskryptu i przeprowadził operację oraz obrazowanie przyżyciowe dla ryc. 1B, 2C i 3A; LB & AC przeprowadził operację i obrazowanie przyżyciowe dla ryc. 2B; RJ przeprowadził operację i obrazowanie przyżyciowe dla ryciny 2A; JSC jest współautorem manuskryptu oraz przeanalizował i zinterpretował wszystkie dane; MHO było współautorem manuskryptu oraz analizowało i interpretowało wszystkie dane; i DE przeprowadziły operację i obrazowanie przyżyciowe dla ryciny 2D, były współautorami manuskryptu, opracowały protokoły analizy tkanek stałych i obrazowania przyżyciowego oraz przeanalizowały i zinterpretowały wszystkie dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała przeciw królikom IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
IgG przeciw szczurom (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1600-100
CytrynianEng Scientific Inc9770
Szkiełka nakrywkoweMikroskopia elektronowa Nauki72296-08
Klej cyjanoakrylowyKlej Henkel 1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dekstran-tetrametylo-rodaminaSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucyna (przeciwciało pierwotne)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloksacynaBayer84753076 v-06/2015
Płodowa surowica bydlęcaSigma AldrichF2442
Skóra rybia ŻelatynaFisher ScientificG7765
Strzykawka insulinowaBecton Dickinson309659
IzofluoranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Sztuczna igła do macierzy zewnątrzkomórkowej
(30 g)Becton Dickinson305128
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies CorporationPBS
Rurki polietylenoweScientific Commodities IncBB31695-PE/1
KentScientificMouseOx
Puralube Maść weterynaryjnaDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (przeciwciało pierwotne)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835
Pulsoksymetr

Bibliografia

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42(2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112(2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75(2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271(2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Brama TMEMimmunofluorescencja w tkance utrwalonejdekstran o wysokiej masie cz steczkowejbarwienie endomucynznakowanie dekstranem TMRanaliza dekstranu pozanaczyniowego

Powiązane artykuły