Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podstawowym celem w biologii jest zrozumienie, w jaki sposób wzorce pojawiają się podczas rozwoju. Kilka grup wykazało, że wzorce można osiągnąć in vitro, gdy komórki macierzyste są przestrzennie ograniczone do mikrowzorców, tworząc w ten sposób modele eksperymentalne, które oferują unikalne możliwości zidentyfikowania, in vitro, podstawowych zasad organizacji biologicznej.
Tutaj opisujemy naszą własną implementację metodologii. Dostosowaliśmy technikę foto-patterningu, aby zmniejszyć zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt, aby ułatwić ustalenie metody w standardowym laboratorium biologii komórki. Opracowaliśmy również darmową, otwartą i łatwą w instalacji platformę do analizy obrazu, aby precyzyjnie zmierzyć preferencyjne położenie subpopulacji komórek w koloniach o standardowych kształtach i rozmiarach. Metoda ta umożliwia ujawnienie istnienia zdarzeń wzorcowych nawet w pozornie zdezorganizowanych populacjach komórek. Technika ta zapewnia wgląd ilościowy i może być wykorzystana do rozdzielenia wpływów środowiska (np. sygnałów fizycznych lub sygnalizacji endogennej) na dany proces wzorcowania.
Wprowadzenie
W systemach ssaków, wzorce są emergentną właściwością zbiorowego zachowania komórek, a więc wzorce mogą powstawać in vitro, jeśli odpowiednie wskazówki zostaną dostarczone do komórek1,2,3,4,5,6. Jednym ze sposobów ujawnienia wewnętrznej zdolności komórek do samoorganizacji in vitro jest zmuszenie komórek do tworzenia grup/kolonii o określonych kształtach i rozmiarach7,8,9,10. Techniką, która to umożliwia, jest micropatterning11. Mikromodelowanie umożliwia precyzyjne określenie miejsca, w którym cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) osadzają się na powierzchni. To z kolei dyktuje, gdzie komórki mogą przylegać, a tym samym kontroluje, jak komórki organizują się przestrzennie.
Mikromodelowanie to technika o wielu zastosowaniach, na przykład mikromodelowanie umożliwia standaryzację warunków początkowych przed różnicowaniem12. Co ważne, mikrowzorce umożliwiają łatwą kontrolę wielkości, kształtu i odstępów między koloniami komórkowymi, a właściwość ta może być wykorzystana do opracowania eksperymentów mających na celu zbadanie zbiorowej odpowiedzi komórek na morfogen lub na sygnały fizyczne7,8,10,13,14,15,16,17.
Opracowano kilka metod tworzenia mikrowzorów11. Techniki fotowzorcowania są prawdopodobnie najłatwiejszymi metodami do ustanowienia18. Podejścia te mają również tę zaletę, że są precyzyjne, ponieważ mogą być używane do kontrolowania kształtu pojedynczych komórek18,19,20. Wymagają jednak również drogiego specjalistycznego sprzętu, w tym powlekarki wirowej, komory plazmowej i środka czyszczącego UVO (UV-Ozone), które na ogół nie są łatwo dostępne w standardowych laboratoriach biologicznych. Aby ułatwić przyjęcie tej techniki, dostosowaliśmy protokół tak, aby wymagał tylko lampy UVO. Zaczynamy od dostępnych na rynku szkiełek plastikowych, które można przyciąć nożyczkami lub dziurkaczem do pożądanego formatu.
Jednym z ważnych zastosowań mikrowzorów jest możliwość standaryzacji kolonii w celu porównania poszczególnych kolonii w wielu powtórzeniach. Pozwala to na pytanie, w jakim stopniu tworzenie się wzorców w tych koloniach jest powtarzalne, oraz na zbadanie czynników, które wpływają na odporność procesu tworzenia wzorców. Co ważne, kwantyfikacja "uśrednionych" wzorców w wielu standaryzowanych koloniach może również ujawnić procesy wzorcowe, które w przeciwnym razie nie byłyby widoczne. Zaletą możliwości ilościowego określenia wzorców na standaryzowanych koloniach jest możliwość dokładnego pomiaru ekspresji białek, najlepiej na poziomie pojedynczej komórki. Jednak komórki na mikrowzorach są często ciasno upakowane, co utrudnia ich segmentację z dużą dokładnością. Komórki często organizują się w trzech, a nie dwóch wymiarach, a wykrycie i zachowanie informacji trójwymiarowych (3D) podczas segmentacji może być trudne. Po pomyślnej segmentacji komórek potrzebne są metody obliczeniowe do wyodrębnienia informacji o wzorcach z wynikowych zestawów danych.
Opracowaliśmy narzędzia do segmentacji i analizy obrazów, aby pomóc przezwyciężyć te problemy. Ta metoda analizy wykorzystuje wyłącznie bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga znajomości wiersza poleceń ani programowania do wdrożenia. Aby zilustrować tę metodę, używamy mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES), które spontanicznie wyrażają marker wczesnego różnicowania brachyury (Tbra)21,22. Chociaż żaden widoczny układ przestrzenny nie jest wykrywalny wizualnie, metoda ta pozwala na stworzenie mapy preferencyjnego rozmieszczenia komórek T+ w koloniach. Pokazujemy również, że wzorzec Tbra kontrastuje z brakiem preferencyjnej lokalizacji komórek wyrażających Id1, bezpośredni odczyt szlaku białka morfogenetycznego kości (BMP)23. Omówiono również obecne ograniczenia metody i sposób, w jaki można ją zaadaptować do innych systemów eksperymentalnych.
Protokół
UWAGA: Przegląd metody znajduje się w Rysunek 1.
1. Projekt maski
- Zaprojektuj fotomaskę zgodnie z wytycznymi opisanymi w Azioune et al.18. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać odniesienie do producenta oprogramowania i maski użytej w tym badaniu.
UWAGA: Na jednej masce można utworzyć wiele geometrii, rozmiarów lub odstępów między kształtami. Do lampy UV można zamontować fotomaskę o długości 15 cm, która może zawierać do 49 różnych wzorów (przy założeniu chipów o wymiarach 2 cm x 2 cm).
2. Procedura wytwarzania mikrowzorów
- Przygotuj niezbędne materiały.
- Przygotować roztwór 0,1% poloksamu 407 (10 mg na 10 ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pozostawić na shakerze w temperaturze pokojowej. Poloksamer 407 rozpuszcza się po około 20 minutach.
- Ułóż film laboratoryjny (patrz Tabela Materiałów) na dnie kwadratowej szalki Petriego o średnicy 10 cm. Będzie ona używana jako komora do osadzania matrycy.
- Oczyść powierzchnię fotomaski, najpierw 100% acetonem, następnie 100% izopropanolem, a na końcu ddH2O. Jeśli to możliwe, wysusz fotomaskę na powietrzu lub w inny sposób osusz maskę czystym ręcznikiem papierowym.
- Przygotuj kwadratowy, sztywny i nieprzezroczysty kawałek plastiku o dokładnie takim samym rozmiarze jak fotomaska (dalej nazywana "uchwytem").
UWAGA: Będzie to używane do utrzymywania plastikowych szkiełek nakrywkowych w kontakcie z fotomaską podczas etapu oświetlenia. - Włącz lampę UVO i uruchom oświetlenie rozgrzewające przez 10 minut.
- Tworzenie wiórów fotowzorzystych.
UWAGA: Możliwe jest dostosowanie procedury do tworzenia wiórów o dowolnym pożądanym rozmiarze. Dla uproszczenia opisujemy tutaj procedurę generowania okrągłego chipa z mikrowzorem o średnicy 12 mm.- Za pomocą dziurkacza o średnicy 12 mm wytnij hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i umieść je na nowej, czystej szalce Petriego.
UWAGA: Przez cały czas używaj rękawiczek, aby uniknąć kontaktu skóry z powierzchnią plastiku, ponieważ może to uszkodzić obróbkę powierzchni. - Ostrożnie usuń folię ochronną z szkiełek nakrywkowych za pomocą pęsety.
UWAGA: Należy unikać uszkadzania powierzchni tworzywa sztucznego, ponieważ może to wpłynąć na rozmieszczenie komórek na chipie podczas procedury wysiewu (rozdział 3). - Umieść fotomaskę na czystej i stabilnej powierzchni (np. pudełku z fotomaską), chromowaną stroną do góry i dodaj kroplę 2 μl ddH2O w miejscu żądanego projektu chipa.
- Położyć szkiełko nakrywkowe na kropli ddH2O i delikatnie docisnąć.
UWAGA: Upewnij się, że plastikowa strona, która jest skierowana w stronę fotomaski, jest stroną, która była chroniona przez folię, która została usunięta we wcześniejszym kroku. - Umieść uchwyt na plastikowych szkiełkach i ostrożnie przymocuj tę kanapkę za pomocą zacisków, aby plastikowe elementy stykały się z fotomaską.
UWAGA: Umieść zaciski jak najbliżej miejsca, w którym znajdują się plastikowe szkiełka, aby zapewnić, że plastikowe szkiełka są idealnie utrzymane w kontakcie z powierzchnią fotomaski. - Umieść zespół w lampie UVO w odległości około 2 cm od źródła światła i świec przez 10 min.
UWAGA: Moc światła szacuje się na 6 mW/cm2 przy długości fali 254 nm, gdy chip jest umieszczony w odległości 2 cm od źródła. - Przytrzymaj kanapkę z fotomaską na dole i ostrożnie zdejmij zaciski, utrzymując nacisk jedną ręką, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek podczas demontażu kanapki. Wyjmij uchwyt, upewniając się, że wszystkie plastikowe elementy nadal znajdują się na masce i nie przyklejają się do uchwytu.
- Dodaj ddH2O na wierzch frytek i delikatnie odłącz wióry od fotomaski.
UWAGA: Jeśli plastikowy chip przykleił się do fotomaski, odłącz chip za pomocą plastikowej końcówki pipety, aby popchnąć chip, trzymając pęsetę nieco nad chipem na wypadek nagłego oderwania się chipa. - Na koniec umieść fotowzorzyste chipy w komorze osadzania matrycy.
UWAGA: Upewnij się, że podświetlona strona chipa jest skierowana do góry.
- Za pomocą dziurkacza o średnicy 12 mm wytnij hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i umieść je na nowej, czystej szalce Petriego.
- Zdeponuj plik matrix.
UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tej sekcji powinny być wykonywane w kapturze do hodowli tkankowych.- Przefiltrować roztwór poloksamu 407 przez filtr polieterosulfonowy (PES) o stężeniu 0,22 μm.
- Przygotować roztwór powlekający ECM, mieszając 500 μg/ml sterylnego, przefiltrowanego poloksamu 407 i 1 mg/ml żelatyny.
UWAGA: Patrz również Tabela 1 w celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących innych możliwych cząsteczek ECM. - Dodać 200 μl roztworu powlekającego na każdy podświetlony wiór. Folia laboratoryjna zapobiegnie wypadnięciu kropli na zewnątrz chipa.
- Dodać 3 cm szalkę Petriego wypełnioną ddH2O w celu ograniczenia parowania i umieścić ją razem z frytkami w temperaturze 4 °C na noc.
3. Procedura wysiewu
UWAGA: Kroki opisane poniżej zostały zoptymalizowane dla mysich embrionalnych komórek macierzystych CGR8 (mESC)24 przy użyciu standardowej pożywki mESC (zobacz również Tabelę Materiałów). Zasadniczo możliwe jest jednak dostosowanie procedury do każdego typu komórki. Należy również zauważyć, że konwencjonalna hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy nie jest tutaj opisana, ponieważ obszerną dokumentację można znaleźć gdzie indziej25.
- Odessać roztwór powlekający i inkubować wióry dwukrotnie przez co najmniej 5 minut w sterylnym PBS.
- W międzyczasie przygotuj zawiesinę komórkową 5,5 x 105 komórek/ml w ciepłym podłożu.
- Odpipetuj 200 μl zawiesiny komórek na każdy chip (~100 000 komórek/cm2).
- Zamknij komorę wysiewającą i pozostaw komórki do przylegania przez 1 godzinę w inkubatorze.
- Po upływie 1 godziny napełnić dołki płytki wielodołkowej (płytki 4-dołkowej lub 24-dołkowej w zależności od liczby wiórów) 500 μl/dołek ciepłego podłoża i przenieść wiórki do płytki za pomocą sterylnej pęsety.
- Energicznie wstrząsnąć płytką w celu oderwania nieprzylegających komórek. Zassać pożywkę i natychmiast zastąpić świeżą, ciepłą pożywką. Sprawdź pod mikroskopem, czy wzór jest widoczny (Rysunek 2a).
UWAGA: W przypadku korzystania z linii komórkowych innych niż mESC lub inne białka macierzy może być konieczne zoptymalizowanie czasu adhezji (patrz również Tabela 2). - Powtarzaj ten krok, aż wzorce staną się wyraźnie widoczne, jak pokazano na Rysunek 2a.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie i decyduje o powodzeniu zabiegu. Zbyt intensywna procedura mycia może spowodować oderwanie komórek, natomiast niewystarczające mycie może spowodować, że komórki pozostaną połączone między wzorami (ryc. 2c,d).
4. Fiksacja
UWAGA: Po 48 godzinach w hodowli komórki powinny tworzyć gęste kolonie, które ściśle podążają za kształtem wzorów (jak pokazano w Rysunek 2b).
- Pozostawiając wióry na płycie, usuń ~90% podłoża, pozostawiając tylko tyle podłoża, aby zapobiec wysychaniu frytek.
UWAGA: Ważne jest, aby chip nigdy nie wyschł, aby uniknąć plam na artefaktach i zapobiec oderwaniu się komórek od powierzchni. Ze względu na hydrofobowość powierzchni wióra między wzorami kleju, wiór może mieć tendencję do odmokania. Na tym etapie utrwalacz może spowodować oderwanie się dużych kopulastych kolonii od chipa. Mycie powinno być bardzo delikatne, najlepiej przez pipetowanie płynu z boku studzienki, a nie bezpośrednio na wiór. - Dodać co najmniej 500 μl roztworu utrwalającego na bazie paraformaldehydu (PFA) do dołka i inkubować przez 10 min.
UWAGA: Jeśli kolonie wydają się szczególnie grube (więcej niż 5 warstw komórek), może być konieczne dostosowanie czasu utrwalania do 20 minut. - Po utrwaleniu przemyć 3 razy roztworem myjącym (PBS z 0,01% poloksamerem 407). Dodatkowe płukanie przy użyciu 50 mM NH4Cl rozcieńczonego w roztworze myjącym może być interkalowane w celu stłumienia resztkowej aktywności sieciowania PFA.
- Próbki inkubować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokującym.
UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez około tydzień przed barwieniem. Jeśli tak, uszczelnij płytkę folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu.
5. Barwienie immunologiczne
- Przygotować komorę barwienia, umieszczając arkusz folii laboratoryjnej na dnie kwadratowej szalki Petriego o powierzchni 10 cm.
- Przygotuj roztwory przeciwciał (w Tabeli 3 znajduje się wykaz przeciwciał i rozcieńczeń stosowanych w tym artykule).
- Umieść chip w komorze barwienia stroną podpierającą komórki skierowane do góry i natychmiast dodaj 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na chip.
UWAGA: Na tym etapie wióry nie powinny być łatwe do zwilżenia, jak w kroku 4.1. Należy jednak nadal zachować ostrożność, ponieważ ważne jest, aby frytki nie wyschły. Jeśli konieczne jest przetworzenie wielu wiórów, wykonaj krok 5.3 do każdego wióra po kolei. - Inkubować przez 1 godzinę na platformie obrotowej w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Jeśli komórki utworzyły duże struktury 3D, może być wymagany dłuższy czas inkubacji, aby umożliwić równomierne barwienie próbki. Czas inkubacji może być wydłużony do 24 godzin. Jednak komora barwienia musi zawierać 3 cm naczynie wypełnione wodą, a komora barwienia musi być uszczelniona folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu. - Przenieś frytki na świeżą płytkę wielodołkową i umyj 3 razy roztworem myjącym.
- Przeprowadzić inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi, jak opisano w krokach 5.3 i 5.4.
- Zamontuj chip na szkiełku mikroskopowym za pomocą 20 μl dowolnego standardowego medium montażowego (np. Mowiol).
6. Obrazowanie
UWAGA: Obrazowanie można wykonać za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego. W tym przypadku podajemy jedynie zalecenia mające na celu zapewnienie jakości obrazu, która będzie wystarczająca do późniejszej analizy ilościowej.
UWAGA: Aby uniknąć stronniczości operatora, kolonie do obrazowania powinny być wybierane tylko za pomocą sygnału obwiedni jądrowej (aby sprawdzić, czy kolonia prawidłowo podąża za kształtem wzorca). Unikaj sprawdzania sygnału interesujących Cię markerów, z wyjątkiem regulacji ustawień mikroskopu.
- Upewnij się, że głębia bitowa akwizycji wynosi 12 lub 16 bitów.
- Zidentyfikuj odpowiednie ustawienia, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny dla każdego kanału obrazu. W szczególności należy unikać przycinania obrazu.
- Dołącz kanał do obrazowania autofluorescencji mikrowzoru (patrz Rysunek 3).
- Dostosuj rozmiar obrazu i współczynnik powiększenia, aby uzyskać rozmiary wokseli w zakresie od 0,1 do 0,6 μm w osiach x i y oraz od 0,2 do 2 μm w osi z.
UWAGA: Na przykład w tym badaniu użyliśmy odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40x (apertura numeryczna równa 1,3), rozmiarem obrazu 1024 x 1024 pikseli bez zoomu cyfrowego i rozmiarem kroku z 0,5 μm. Dało to rozmiar woksela 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm. - Dla każdej kolonii zdefiniuj minimalną i maksymalną pozycję wzdłuż osi z, aby upewnić się, że cała kolonia zostanie nabyta. Co najmniej jedna płaszczyzna o słabym lub zerowym sygnale powinna znajdować się poniżej i powyżej kolonii.
- Upewnij się, że orientacje stosu z są uzyskiwane spójnie (zawsze od góry do dołu lub zawsze od dołu do góry)
- Dostosuj szybkość skanowania, rozdzielczość obrazu, uśrednianie klatek i wzmocnienia detektora, aby określić optymalną jakość obrazu i czas obrazowania. Orientacyjnie, czas obrazowania dla jednej kolonii, jak pokazano na Rysunek 3, wynosił około 2–3 minut. Wykonaj akwizycję obrazu.
UWAGA: Wszystkie obrazy, aby były porównywalne, muszą być uzyskane pod tym samym mikroskopem z tym samym obiektywem i ustawieniami akwizycji. - Na koniec akwizycji zapisz wszystkie obrazy i przypisz unikatową konwencję nazewnictwa, aby zidentyfikować warunki eksperymentalne, które reprezentuje każdy obraz.
UWAGA: Zobacz Rysunek 4 jako przykład, ta konwencja zostanie użyta później podczas procedury analizy. Należy pamiętać, że obrazy mogą być zapisywane w dowolnym formacie obsługiwanym przez BioFormats 26. Jeśli kolonie są większe niż pole widzenia, można użyć wtyczki do szycia ImageJ27. Należy również pamiętać, że w przypadku przeszywania może być konieczna korekta zwijania oświetlenia.
7. Analiza obrazu
UWAGA: Zalecane specyfikacje komputera dla tej procedury to: 16 GB RAM, wielordzeniowy procesor 3,33 GHz i co najmniej 50 GB miejsca na dysku (lub więcej, w zależności od liczby układów, które zostały zobrazowane). Oprogramowanie zostało przetestowane w systemach Linux, Windows i MacOS. PickCells to wieloplatformowa aplikacja do analizy obrazów z graficznym interfejsem użytkownika dedykowanym do analizy zbiorowej organizacji komórek na złożonych wielowymiarowych obrazach (Blin i in., w przygotowaniu). Należy pamiętać, że więcej informacji na temat PickCells, jak również dokumentację dla konkretnych modułów wymienionych tutaj, można znaleźć w Internecie: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Należy również pamiętać, że interfejs może ulec zmianie w miarę ulepszania oprogramowania. Jeśli interfejs różni się od tego, co pokazano na rysunku lub filmie, zapoznaj się z instrukcją online.
- Zainstaluj i uruchom PickCells zgodnie z dokumentacją dostępną online.
- Zaimportuj obrazy i sprawdź dokładność podanych informacji (Rysunek 4-1).
- Udokumentuj nazwę każdego kanału.
- Segmentuj jądra na podstawie sygnału obwiedni jądrowej za pomocą modułu Nessys28 (Rysunek 4-2) i podaj prefiks (na przykład "jądra"), który będzie używany do nazywania wygenerowanych obrazów segmentowanych.
UWAGA: Dokumentację dotyczącą użytkowania i regulacji parametrów można znaleźć pod adresem https://framagit.org/pickcellslab/nessys. - Sprawdź i edytuj segmentacje, jeśli to konieczne, korzystając z modułu edytora segmentacji (Rysunek 4-3)
UWAGA: Jeśli z jakiegokolwiek powodu proces segmentacji nie przyniósł zadowalających wyników, ręcznie usuń obrazy w folderze bazy danych, a także usuń węzeł "wynik segmentacji" w widoku MetaModel. Następnie powtórz kroki 7.4 i 7.5. Jeśli segmentacja tylko małego podzbioru obrazów nie przyniosła zadowalających wyników, użyj samodzielnej aplikacji Nessys (patrz link w 7.4), spróbuj segmentacji na "wadliwych obrazach" i zastąp odpowiedni plik w folderze bazy danych). - Segmentacja sygnału autofluorescencji wzorca za pomocą podstawowego modułu segmentacji (Rysunek 4-4)
- Podaj prefiks ("wzorzec", na przykład), który będzie używany do nazywania wygenerowanych obrazów podzielonych na segmenty.
- Wybierz kanał zawierający sygnał autofluorescencji.
- Zastosuj redukcję szumów; zazwyczaj użycie filtra Gaussa o wielkości ziarna 10 x 10 x 0,5 wokseli daje zadowalające wyniki.
- Ustaw dolny próg tak, aby tło było wyświetlane na niebiesko, a pierwszy plan był biały. Ustaw również górny próg na jego maksymalną wartość, aby uniknąć wykluczenia wysokich intensywności z wyniku końcowego (czerwone obszary).
- Wybierz opcję Pomiń, aby przejść do ostatniego kroku.
- Kliknij Zakończ i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
- Jeśli chodzi o jądra, wyniki segmentacji można teraz wizualnie sprawdzić i w razie potrzeby skorygować za pomocą modułu edytora segmentacji (Rysunek 4-5).
- Tworzenie obiektów jądrowych i obliczanie podstawowych cech obiektów.
- Uruchom moduł funkcji wewnętrznych z paska zadań po lewej stronie głównego interfejsu (Rysunek 4-6).
- Zamknij panele Ellipsoid Fitter i Surface Extractor, aby otwarty był tylko panel Basic Features.
- Wybierz Nucleus jako typ obiektu i wybierz prefiks podany w kroku 7.4 dla "obrazów podzielonych na segmenty".
- Naciśnij przycisk Compute i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
UWAGA: Po tym kroku nie będzie już możliwa ponowna edycja segmentacji jąder.
- Tworzenie obiektów wzorca i obliczanie podstawowych cech obiektu. Powtórz kroki od 7.8.1 do 7.8.4, tylko tym razem wybierz Typ niestandardowy jako typ obiektu i prefiks podany w kroku 7.6.1 dla obrazów podzielonych na segmenty.
UWAGA: Po wykonaniu tego kroku nie będzie już można ponownie edytować segmentacji wzoru. - Przechowuj nazwę obrazu, do którego należy każde jądro, jako atrybut jądra.
- Kliknij Data > Nowy atrybut i wybierz Nucleus w wyskakującym oknie dialogowym, a następnie kliknij OK.
- Wybierz opcję Zbierz dane z innych obiektów połączonych z węzłem i kliknij przycisk Dalej.
- W lewym panelu wybierz opcję Obraz, a następnie kliknij dwukrotnie znak przesłuchania pod flagą Zakończ w panelu Definicja ścieżki, aby ustawić węzeł obrazu jako cel ścieżki.
- Rozwiń okienko Dostępne atrybuty w lewym panelu i wybierz atrybut nazwy.
- Rozwiń okienko operacji redukcji i wybierz opcję Pobierz jeden, a następnie kliknij przycisk zmiany i kliknij przycisk Dalej.
- Wpisz "Nazwa obrazu", naciśnij Tab i kliknij OK.
- Utwórz atrybut "znormalizowanej współrzędnej" w obiektach jądrowych (Rysunek 4-7).
- Dostosuj kroki od 7.10.1 do 7.10.6, aby przechowywać współrzędne środka ciężkości wzoru jako atrybut jądra. Nazwij ten nowy atrybut "Współrzędna wzorca".
- Następnie kliknij Dane > Nowy atrybut, wybierz Nucleus i kliknij OK.
- Wybierz opcję Zdefiniuj funkcję między wektorami przestrzennymi lub kierunkowymi węzła i kliknij przycisk Dalej.
- W polu Typ funkcji wybierz pozycję Operacja szykowa, w polu V1 wybierz pozycję Wektor elementu, a następnie pozycję Centroid, a w polu Wersja 2 wybierz pozycję Wektor elementu, a następnie pozycję Współrzędna wzorcae.
- Kliknij przycisk Dalej, wpisz "Współrzędna znormalizowana" w polu Nazwa i kliknij przycisk Zakończ.
- Wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanego tabulatorami.
8. Analiza R
- Pobierz i zainstaluj Rstudio.
UWAGA: Informacje o oprogramowaniu i łącza do pobrania są dostępne pod adresem https://www.rstudio.com/. - Pobierz skrypty języka R wymagane do tej analizy.
UWAGA: Skrypty można pobrać z repozytorium GitLab: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr. - Otwórz Rstudio.
UWAGA: Jeśli uruchamiasz skrypty po raz pierwszy, zainstaluj wymagane pakiety języka R (ggplot2 i skale). - W Rstudio otwórz binnedmap_template. Skrypt języka R.
- Ustaw katalog roboczy na lokalizację pliku źródłowego.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w skrypcie, aby dostosować skrypt do dowolnego zestawu danych w celu uzyskania map przestrzennych, jak pokazano w Rysunek 5.
- Uruchom skrypt, aby wygenerować mapy zagęszczenia.
Wyniki
Opisana tutaj metoda fotowzorowania umożliwia precyzyjną organizację hodowlanych komórek w kolonie o zdefiniowanych kształtach i rozmiarach. Sukces tej procedury powinien być wyraźnie widoczny bezpośrednio po wysiewaniu komórek (krok 3.7), ponieważ przylegające komórki będą gromadzić się zgodnie z projektem fotomaski, jak pokazano na Rysunku 2a. Po 1 h od wysiewania poszczególne wzory mogą nie być w pełni zlewne (tylko kilka komórek na wzór), jednak w miarę proliferacji komórek z czasem wzory zostaną całkowicie skolonizowane, a poza powierzchniami adhezyjnymi znajdzie się jedynie bardzo niewiele komórek (Rysunek 2b). Dokładny wygląd hodowli będzie zależny od linii komórkowej. Na przykład mESC tworzą kopułowate kolonie10. Chip, na którym wzorowanie nie jest wyraźne od 1 do 2 h po wysiewaniu komórek, wskazuje na niepowodzenie procedury (Rysunek 2c,d).
Duże i grube kolonie mogą czasami stanowić wyzwanie w kontekście jednorodnego barwienia. Sugerujemy przeprowadzenie fiksacji i permeabilizacji komórek w jednym kroku (sekcja 4), ponieważ może to poprawić penetrację przeciwciał29. Jest to powód, dla którego wybrany roztwór fiksacyjny zawiera detergent. Rysunek 3 przedstawia sygnał fluorescencyjny spodziewany po immunobarwieniu. Zauważmy, że jasne komórki Id1-dodatnie znajdują się w gęstych obszarach (jasne obszary NPC) kolonii (Rysunek 3A). Takie wskazówki są pomocne przy ocenie jakości procedury barwienia przeciwciałami. Należy również zauważyć, że mikrowzory utworzone za pomocą obecnej techniki wykazują autofluorescencję. Sygnał ten (Rysunek 3A,B najlewiejsze obrazy) jest przydatny na etapie analizy do przestrzennej rejestracji kolonii względem siebie i stworzenia wyników pokazanych na Rysunku 5. Sygnał autofluorescencji jest zazwyczaj najsilniejszy, gdy próbka jest wzbudzana laserem 405 nm i w tym celu ten kanał powinien pozostać niebarwiony. Rysunek 3 pokazuje również, jak komórki są precyzyjnie ograniczone do wzorów o różnych kształtach.
Analiza danych obrazowych jest przeprowadzana w programie PickCells, darmowym oprogramowaniu o otwartym kodzie źródłowym opracowanym w naszym laboratorium (Blin et al., w przygotowaniu). Oprogramowanie to zawiera moduły analizy obrazu służące do odczytu i sortowania obrazów konfokalnych (Rysunek 4-1), segmentacji (Rysunek 4-2,4-4) i kurateli segmentowanych obiektów (Rysunek 4-3,4-5), obliczania cech obiektów, takich jak współrzędne lub średnia intensywność (Rysunek 4-6), oraz eksportu danych (Rysunek 4-7,4-8). Co istotne, opracowaliśmy niezawodną metodę segmentacji jąder komórkowych o nazwie Nessys28, która jest szczególnie odpowiednia dla gęstych i heterogenicznych populacji komórek, takich jak komórki hodowane na mikrowzorach (Rysunek 3). Rysunek 4-2 przedstawia reprezentatywny wynik działania modułu Nessys, w którym każda pojedyncza komórka otrzymuje dokładny, unikalny identyfikator kolorystyczny. Konieczna powinna być jedynie minimalna edycja, choć jest ona możliwa, jeśli użytkownik tak zdecyduje (Rysunek 4-3). Na koniec PickCells udostępnia szereg modułów wizualizacyjnych do prezentacji danych. Przykład przedstawiono na Rysunku 4-6: kolonia w kształcie pierścienia jest renderowana w 3D, a jądra komórkowe są zakodowane kolorami zgodnie z ich położeniem wzdłuż osi z. Po zwalidowaniu analizy w PickCells dane mogą zostać wyeksportowane w celu utworzenia map przestrzennych w programie R przy użyciu skryptów dostępnych pod adresem (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr), jak pokazano na Rysunku 530.
Wykazaliśmy niedawno, że ograniczenie przestrzenne mESC na małych (30 00 µm2) dyskowych lub eliptycznych mikowzorach kieruje rozmieszczeniem subpopulacji komórek wykazujących ekspresję markeru mezodermalnego Tbra10. Aby zaprezentować naszą metodę, badamy tutaj, czy na rozmieszczenie Tbra może wpływać sygnalizacja BMP w większych koloniach (90 0 µm2). Rysunek 5A pokazuje, że gdy mESC są hodowane na dużych dyskowych mikowzorach, komórki Tbra+ są preferencyjnie ograniczone do peryferii wzorca (mapa gęstości Tbra+), gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa (patrz niebieska mapa po lewej stronie Rysunku 5A). To rozmieszczenie Tbra zostało potwierdzone przez mapę średniej intensywności Tbra.
Dane te wykazują, że metoda ta pozwala na ujawnienie informacji niewidocznych gołym okiem. Rzeczywiście, na podstawie Rysunku 3 widać, że wizualna ocena pojedynczej kolonii nie jest wystarczająca do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej ekspresji Tbra. Wynika to w szczególności z istotnej zmienności między koloniami, która została ilościowo określona i przedstawiona na najbardziej prawym panelu Rysunku 5A.
Technika ta wykazuje również, że dla Id1 (celu sygnalizacji BMP) nie występuje wykrywalny wzorzec, co może wskazywać, że w tym kontekście wzorzec T nie jest sterowany przez sygnalizację BMP.
Mikrowzorowanie umożliwia wymuszenie na koloniach przyjęcia niemal dowolnej pożądanej geometrii. Jest to szczególnie przydatne do badania odpowiedzi układu na różne geometrie. Przykładowo, można przypuszczać, że jeśli w centrum kolonii wytworzy się gradient morfogenów, utworzenie otworu w kolonii zaburzy ten gradient. Co ciekawe, wciąż obserwujemy wzorowanie na mikrowzorze w kształcie pierścienia, choć w mniej stabilny sposób (Rycina 5B).
Rysunek 1: Przegląd metody. Schemat przedstawiający główne etapy metody. Dla każdego etapu pod nazwą zadania podano szacowany czas jego trwania, a schemat ilustruje cel procedury. W przypadku dostępności zamieszczono również odniesienie do odpowiedniej ryciny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Wygląd hodowli 1 h i 48 h po wysianiu komórek na mikowzorce. Obrazy w polu jasnym mESC wysianych na mikrowzory. (a) Przewidywana organizacja komórek 1 h po wysianiu; wzory powinny być wyraźnie identyfikowalne. (b) Oczekiwany wynik po 48 h hodowli. Komórki mESC proliferowały i nadal są ściśle ograniczone do kształtów wzoru. (c–d) Możliwe nieoptymalne wyniki: albo bardzo niewiele komórek przylega do tworzywa poza obrzeżem szkiełka (c), albo komórki przylegają pomiędzy wzorami (d). Patrz Tabela 2 do przewodnika rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy konfokalne immunobarwionych kolonii hodowanych na mikrowzorcach.
Reprezentatywne kolonie mESC po immunofluorescencji na (A) Id1 a kompleks porów jądrowych lub (B) Tbra i LaminB1. Dla każdego barwienia przedstawiono kolonię wyhodowaną na mikro-wzorcu w kształcie dysku oraz kolonię wyhodowaną na mikro-wzorcu w kształcie pierścienia. Poszczególne kanały przedstawiono jako obrazy w skali szarości. Zwróć uwagę na wyraźny sygnał autofluorescencji mikro-wzorca (pobudzenie laserem 405 nm). Pasek skali reprezentuje 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Schemat procedury analizy obrazów. Lista obrazów konfokalnych 3D zostaje zaimportowana do programu PickCells w celu przeprowadzenia analizy (1). Ten przykład przedstawia eksperyment z dwoma różnymi kształtami (dyskami i pierścieniami, tak jak w Rysunek 2). Konwencja nazewnictwa obrazów jest przedstawiona po lewej stronie, a interfejs programu PickCells po prawej. Następnie wykorzystuje się moduł Nessys do automatycznej segmentacji jąder (2). Na zrzucie ekranu każde poszczególne jądro ma przypisany unikalny kolor, co wskazuje na prawidłową segmentację. Autofluorescencja wzorca została również poddana segmentacji, tym razem z wykorzystaniem modułu „basic segmentation” (4). Tło pojawia się w kolorze niebieskim, a sygnał biały zostanie zdefiniowany jako kształt wzorca. Następnie dokonuje się wizualnej inspekcji wysegmentowanych kształtów w celu zapewnienia dokładności segmentacji, a w razie potrzeby są one edytowane przy użyciu modułu edytora segmentacji (3–5). Zrzuty ekranu przedstawiają obrysy wykrytych kształtów. Kształty różowe i żółte zostały poddane edycji. Na koniec obliczono cechy obiektów i wyeksportowano je do pliku w celu późniejszego przetworzenia w programie R (6–7). Przedstawiono zrzut ekranu kolonii wyrenderowanej w widoku 3D (6). W krokach od 2 do 6 obok numeru kroku zamieszczono ikony dostępne w interfejsie PickCells w momencie pisania niniejszego artykułu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla dwóch różnych czynników transkrypcyjnych i kształtów mikrowzorców
Ssegmentowana mapa przestrzenna dla mESC hodowanych przez 48 h na (A) mikrowzory w kształcie dysku lub (B) pierścieniowate mikrowzory. Dla każdego kształtu mikrowzoru po lewej stronie przedstawiono mapę gęstości komórek, niezależnie od ich fenotypu, z niebieską skalą kolorystyczną. Następnie dla każdego markera (Tbra w górnym rzędzie i Id1 w dolnym rzędzie) podano trzy oddzielne mapy, od lewej do prawej: mapę gęstości wyłącznie komórek wykazujących ekspresję markera (analiza oparta na progu), mapę średniej intensywności markera (log2) oraz mapę odchylenia standardowego intensywności markera. Intensywności podano w arbitralnych jednostkach fluorescencji. Na każdej mapie kształt mikrowzoru zaznaczono biały kontur. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| typ macierzy zewnątrzkomórkowej | Żelatyna | Fibonektyna | Macierz błony podstawnej | |
| Stężenie | stężenie macierzy pozakomórkowej (ECM) | 1 mg/ml | 20 μg/mL | 200 μg/mL |
| Stężenie poloksameru 407 | 500 μg/mL | 400 μg/mL | 1 mg/ml | |
| Przetestowano za pomocą | mESC (mysie embrionalne komórki macierzyste) | TAK | TAK | TAK |
| mEpiSC | NIE | TAK | TAK | |
| Pożywka bezsurowicza | NIE | TAK | TAK |
Tabela 1: Testowane stężenia poloksameru 407 i ECM. Tabela ta przedstawia zestawienie stężeń ECM i poloksameru 407, które zostały przetestowane w naszym laboratorium. Dla każdej kombinacji ECM/poloksameru 407 wskazano typ komórek, dla których pomyślnie uzyskano wzorowanie, a także informację, czy hodowla zawierała surowicę. mESC = embrionalne komórki macierzyste myszy, mEpiSC = komórki macierzyste epiblastu myszy.
| Procedura | Obserwacja | Możliwy problem | Roztwór |
| Mikrowzorowanie | Niska adhezja komórek | niewłaściwy stosunek stężenia ECM/poloksameru 307 | Zwiększyć stosunek stężenia ECM do poloksameru 307 |
| Czas przywierania komórek zbyt krótki | Zwiększyć czas inkubacji, aby zapewnić komórkom odpowiedni czas na prawidłowe przytwierdzenie się do wzorów (krok 3.4). W celu optymalizacji tego etapu pomocne może być sprawdzanie komórek pod mikroskopem, co pozwala wykryć zmianę morfologii wskazującą na rozpoczęcie procesu adhezji komórek. | ||
| Płukania zbyt intensywne (krok 3.6) | Podczas wymiany pożywki należy unikać pipetowania jej bezpośrednio na chipy. Zamiast tego należy delikatnie nanieść pożywkę na ścianki studzienki. | ||
| Komórki przylegają pomiędzy wzorami | niewłaściwy stosunek stężenia ECM do poloksameru 307 | Zmniejszyć stosunek stężenia ECM do poloksameru 407 | |
| Czas adhezji komórek zbyt długi | Skrócić czas inkubacji (krok 3.4). | ||
| Przemycia nieskuteczne (krok 3.6) | Energiczne potrząsanie płytką jest zazwyczaj wystarczające do odseparowania nadmiaru komórek. W przypadku typów komórek, które wykazują silną adhezję do chipa, bezpośrednie pipetowanie na chip może poprawić wynik. Zwiększenie liczby przemyć również może pomóc, zwłaszcza w celu zapewnienia, że po tym kroku w medium nie pozostaną żadne wolne komórki. | ||
| Komórki nie odwzorowują ściśle kształtu wzorca | Niezgodny typ komórek i geometria wzoru | Zaprojektuj wiele geometrii/rozmiarów do umieszczenia na fotomasece, aby umożliwić przetestowanie i zidentyfikowanie optymalnego rozmiaru wzoru dla danego kształtu wzoru i typu komórek. Prosimy o zapoznanie się z sekcją „Limitations” (Ograniczenia) w dyskusji. | |
| Nieoptymalne fotoprintowanie – można to zdiagnozować, obserwując ostrość sygnału autofluorescencji. Granice wzorów powinny być ostre, tak jak przedstawiono na rys. 2. Jeśli krawędzie wzorów wydają się rozmyte, należy usprawnić etap fotoprintowania. | Rozmyte krawędzie wzoru wskazują, że szkiełko plastikowe nie przylegało wystarczająco blisko do powierzchni maski podczas etapu naświetlania. Należy upewnić się, że elementy mocujące szkiełka do fotomaski są wyrównane oraz że podczas procedury naświetlania do zespołu przyłożono stały i wystarczający nacisk. | ||
| Barwienie | Niejednorodne barwienie | czas inkubacji przeciwciał zbyt krótki | Wydłużyć czas inkubacji przeciwciał (do 24 h w temperaturze pokojowej) |
| kolonie spłaszczone podczas procedury montowania | Zamocuj preparaty z mikrowzorcami w komorze, takiej jak chamlide lub cytoo-chambers, aby przeprowadzić zarówno immunobarwienie, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwoli to na lepsze zachowanie struktury 3D kolonii. | ||
| Odrywanie kolonii podczas procedury barwienia | Dewetting chipa | Pozostaw odpowiednią ilość medium lub użyj dwóch pipet: jednej do usunięcia medium, a drugiej do dodania świeżego roztworu | |
| Kolonie pod mikroskopem wyglądają na ścięte | kolonie zostały uszkodzone podczas montowania chipa na szkiełku mikroskopowym | Należy zachować szczególną ostrożność podczas montowania chipów. Alternatywnie można montować szkiełka z mikrowzorcami w komorach, takich jak chamlide lub cytoochambers, aby przeprowadzić zarówno immunobarwienie, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwala to również na zachowanie ultrastruktury kolonii. |
Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów.Tabela ta przedstawia przegląd możliwych nieoptymalnych wyników. Wymieniono w niej również potencjalne źródła problemów wraz z zalecanymi rozwiązaniami.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy metodę analizy pojawiających się wzorców w kulturach komórkowych. Do standaryzacji kształtu i wielkości kolonii komórkowych stosuje się uproszczone podejście do mikrowzorców, a my prezentujemy narzędzia do analizy obrazu i skrypty R, które umożliwiają wykrywanie i kwantyfikację wzorców w obrębie tych kolonii.
Proponowana przez nas metoda jest do pewnego stopnia podobna do wcześniej opublikowanej metody31 , w której autorzy koncentrują się na warunkach hodowli, wykorzystując komercyjnie dostępne mikrowzorce, w celu uzyskania powtarzalnego tworzenia listków zarodkowych w koloniach ESC do badania wczesnych zdarzeń gastrulacji in vitro. Nasz cel jest bardziej skoncentrowany na dostarczeniu uogólnionego potoku do odkrycia tworzenia wzorców in vitro, gdzie zbiorowa organizacja komórek może stać się widoczna dopiero po analizie statystycznej. Z tego powodu zapewniamy solidny proces analizy obrazu, który umożliwia dokładną identyfikację i analizę pozycji jądra w przestrzeni 3D nad wieloma koloniami (patrz również sekcja "Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców" w tym omówieniu). Zdecydowaliśmy się również na opracowanie prostego, wewnętrznego podejścia do mikrowzorów, które oferuje bardziej elastyczną i tańszą alternatywę dla komercyjnie dostępnych rozwiązań w dłuższej perspektywie, co mamy nadzieję będzie przydatne dla społeczności.
Na koniec zauważamy, że podczas rewizji tego manuskryptu wydano nowy pakiet do analizy wzorców in vitro podobny do naszych skryptów R32. Ten nowy pakiet akceptuje tabele cech komórek jako dane wejściowe, które można uzyskać z wysokoprzepustowych platform obrazowania. Uważamy, że tabela cech jąder wygenerowana w kroku 7 naszego protokołu mogłaby w zasadzie służyć jako dane wejściowe do tego nowego pakietu, chociaż sami nie testowaliśmy tej możliwości.
Możliwość dostosowania metody do innych typów komórek i geometrii kolonii
Podejście to prezentujemy w kontekście badania powstawania mezodermalnych czynników transkrypcyjnych w hodowlach komórek pluripotencjalnych w obecności surowicy. Metodę tę można jednak łatwo dostosować do innych typów komórek i hodowli bez surowicy, chociaż może być konieczna optymalizacja stężeń ECM/poloksamu 407 (patrz Tabela 1 dla badanych stężeń i Tabela 2 dla przewodnika rozwiązywania problemów). Metoda może być również dostosowana do większych lub mniejszych rozmiarów mikrowzorów oraz do szerokiej gamy kształtów w zależności od potrzeb użytkownika. Jednak podczas ustalania metody ważne jest, aby mieć świadomość, że nie wszystkie kombinacje kształtu/typu komórki są optymalne. Na przykład mESC wyraża wysokie poziomy E-kadheryny33, 34 umożliwiając tym komórkom tworzenie zbiorowych struktur obejmujących obszary pozbawione ECM. Komórki te nie są ściśle zgodne z geometriami o ostrych kątach lub z małymi otworami we wzorze. Zauważ na przykład, że na pierścieniu na rysunku 3B komórki są w trakcie kolonizacji obszaru centralnego. W naszych rękach mniejszy obszar centralny nie zmuszał mESC do tworzenia kolonii w kształcie pierścienia. Dlatego zdecydowanie zaleca się uwzględnienie różnorodności geometrii podczas projektowania fotomaski, aby móc przetestować i zidentyfikować optymalne rozmiary i krzywizny, które będą odpowiednie dla wybranego typu komórki.
Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest długość eksperymentu i tempo proliferacji komórek. W przypadku niektórych szybko proliferujących typów komórek (w tym komórek pluripotencjalnych) utrzymanie komórek na mikrowzorcach przez wiele dni może być trudne (w przypadku mESC trzy dni to maksimum). Również wysiewanie komórek na mikrowzorcach nie zawsze przebiega optymalnie dla każdej kolonii, dlatego wskazane jest wysiewanie nadmiaru kolonii, aby mieć zapasowe.
Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców
Szczególną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania "uśrednionych" wzorców poprzez łączenie wyników analizy obrazu z wielu powtórzonych kolonii (ryc. 5). Może to ujawnić wzorce zdarzeń, które nie są widoczne podczas inspekcji poszczególnych kolonii. Wadą tego podejścia "uśredniającego" jest to, że może ono pominąć pewne rodzaje powtarzających się wzorów, na przykład małe plamki lub wąskie paski. Jednak tego typu wzory mogą zostać ujawnione za pomocą kombinacji starannie dobranych rozmiarówwzorów 8. Ponadto opisany tutaj potok analizy obrazu dostarcza danych ilościowych zarówno w rozdzielczości pojedynczej komórki, jak i kolonii, oferując możliwość zbadania poziomu zmienności między koloniami (ryc. 5) lub przeprowadzenia analizy sąsiadów w wielu skalach10.
Kolejną ważną zaletą metody uśredniania jest to, że daje ona możliwość mapowania preferencyjnej lokalizacji wielu markerów bez ograniczeń dostępnych fluoroforów kanałów detekcji. Rzeczywiście, chociaż w prezentowanej tu pracy posługujemy się tylko dwoma markerami różnicowania, zdolność do standaryzacji kolonii i wyodrębniania "uśrednionych" wzorców umożliwia porównanie map rozmieszczenia z różnych zestawów kolonii w celu ujawnienia uogólnionych relacji przestrzennych markerów względem siebie.
Ponadto, mimo że skupiliśmy się tutaj na badaniu markerów różnicowania, metoda analizy może zostać rozszerzona o badanie innych procesów biologicznych, dla których dostępne są markery jądrowe. Na przykład mikrowzorzec linii komórkowej zawierającej wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacjifluorescencji 35 (FUCCI) umożliwiłby zbadanie, w jaki sposób geometria na poziomie kolonii może wpływać na zdarzenia cyklu komórkowego w grupie.
Kierunki na przyszłość
Metoda ta jest podatna na średnioprzepustową analizę obrazów, jednak pozyskiwanie obrazów nie jest obecnie w pełni zautomatyzowane i może stać się ograniczeniem w przypadku bardzo dużych eksperymentów. Regularne rozmieszczenie kolonii powinno umożliwić stworzenie w pełni zautomatyzowanych procedur akwizycji, podobnych do tych, które zostały opracowane dla średniej liczby pojedynczych komórek20. Jednak ze względu na to, że rozmiar pola wymagany do zobrazowania kolonii jest duży, co może wymagać mozaikowania, a także dlatego, że kolonie są trójwymiarowe, wysoce pożądane jest zmniejszenie zarówno rozmiaru zestawu danych, jak i czasu akwizycji poprzez obrazowanie tylko odpowiednich kolonii. W związku z tym w przyszłości możliwe jest podjęcie działań mających na celu opracowanie "inteligentnego" mikroskopu zdolnego do identyfikacji odpowiednich kolonii i dostosowania współrzędnych obrazowania do każdej próbki. Pozwoli to nie tylko skrócić czas i wysiłek, ale także zapobiec potencjalnym uprzedzeniom operatora.
Potoki analizy mogą być również bardziej wydajne dzięki zmniejszeniu liczby kroków, które użytkownik musi wykonać. Mamy w planach zbudowanie mechanizmu budowania potoków i zintegrowanie R bezpośrednio z naszym oprogramowaniem (zobacz także problemy pickcells-api#3 i pickcells-rjava#1 w narzędziu do śledzenia problemów w naszych repozytoriach kodu [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Pełna automatyzacja procedury analizy zmniejszy czas i wysiłek oraz ograniczy potencjalne błędy użytkowników.
Na koniec zauważamy, że nasza metoda analizy nie oddaje jeszcze w pełni dynamicznej natury wzorców komórkowych. Niektóre ograniczone informacje dynamiczne można wyodrębnić, badając szeregi czasowe obrazówmigawkowych 8,10,36. Jednak możliwość rejestrowania historii populacji komórek jest wysoce pożądana, jeśli chcemy lepiej zrozumieć, w jaki sposób pojawiają się wzorce. Jednym z ograniczeń jest to, że dokładne śledzenie pojedynczych komórek w gęstej populacji komórek 3D pozostaje bardzo trudnym zadaniem37. Nasza metoda wykrywania komórek wykorzystuje otoczkę jądrową i działa szczególnie dobrze w przypadku gęstych i nakładających się na siebie populacji komórek28. Żywe reportery otoczki jądrowej są łatwo dostępne28,38, a jedną z zalet techniki mikromodelowania jest to, że można ją wykorzystać do zapobiegania przemieszczaniu się komórek poza pole widzenia podczas długotrwałego obrazowania. Ogólnie rzecz biorąc, jesteśmy przekonani, że zautomatyzowane śledzenie komórek będzie możliwe do osiągnięcia przy użyciu kombinacji niedawno opracowanych narzędzi 28,39,40 i że powinno to przynieść nowe informacje na temat podstawowych zasad samoorganizacji.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez stypendium podoktorskie Sir Henry'ego Wellcome'a (WT100133 do G.B.), stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA do S.L.) oraz stypendium doktoranckie Wellcome Trust do (108906/Z/15/Z do D.W.). Jesteśmy również wdzięczni dr Manuelowi Thery'emu za jego rady dotyczące adaptacji techniki fotomodelowania.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 31350-010 | uchwyt w dygestoriach |
| 1 i razy; Mistrzowska kwarcowa antyrefleksyjna chromowa maska | fotograficzna Toppan Photomask | Niestandardowy projekt | |
| 24-dołkowe płytki | Corning | 3526 | |
| 4-dołkowe płytki | Nunclon Delta | 176740 | |
| 5% Surowica osła | Sigma | D9663 | |
| Przeciwjądrowy kompleks porów | Abcam | ab24609 | Mysz monoklonalna, użyj 1:1000 |
| Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Królik poliklonalny, stosować 1:200 |
| Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Poliklonalny królik, stosować 1:1000 |
| Anti-Tbra | R& D | AF2085 | Kozioł ployklonal, stosować 1:400 |
| Roztwór blokujący | NA | NA | 0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 5% Surowica dla osła 0,003% Azek sodu W PBS |
| CGR8 mESC | NA | Odniesienie: Mountford i wsp. PNAS, 1994 | |
| Roztwór utrwalający | NA | NA | 4% PFA rozcieńczony w roztworze myjącym |
| Surowica bydlęca płodu | Gibco | 10270-106 | muszą zostać przetestowane w celu zapewnienia zgodności z konserwacją ESC |
| Żelatyna | Sigma | G1890 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
| Film laboratoryjny | VWR | 291-1212 | |
| Oprogramowanie do edytora układu | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
| Edytor układu Oprogramowanie | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
| L-glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
| mESC Pożywka | hodowlana NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-merkaptoetanol 1 razy; aminokwasy endogenne kwasy, 2 mM L-glutamina 1 mM pirogronian sodu | |
| NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | UWAGA: Toksyczny, należy obchodzić się z nierozcieńczonymi substancjami w dygestoriach i nosić sprzęt ochronny |
| PBS (barwienie immunologiczne) | Sigma | P4417 | Rozcieńczyć w 200 ml ddH2O |
| PBS (hodowla tkankowa) | Gibco | 11140-035 | |
| Prowadnice plastikowe | Ibidi | IB-10813 | |
| Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Sondy molekularne | P36930 | |
| Azydek sodu | Sigma | 8591 | UWAGA: Toksyczny, uchwyt w dygestoriach i noszenie sprzętu ochronnego |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360070 | |
| TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s Zalecenia bezpieczeństwa |
| Roztwór myjący | NA | NA | 0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 W PBS |
Bibliografia
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells. BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. Stem cell bioengineering: building from stem cell biology. Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20 (8), 878(2018).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939(2017).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Tewary, M., et al. A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning. Development. , (2017).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells. Development. 145 (18), (2018).
- Micropatterning in cell biology. Pt. A. , Elsevier. Amsterdam. (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).
- Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo. bioRxiv. , 202366(2017).
- Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells. Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).
- Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens. PloS One. 4 (7), e6438(2009).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Etoc, F., et al. A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization. Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514(2010).
- Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis. Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).
- Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).
- Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).
- Mountford, P., et al. Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D. bioRxiv. , 502872(2018).
- Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC cancer. 10, 106(2010).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org/ (2013).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).
- Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens. PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384(2019).
- Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).
- Pieters, T., van Roy, F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. eLife. 7, e32839(2018).
- Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. 14 (12), 1141(2017).
- Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. Nuclear Lamins a and B1. The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).
- McDole, K., et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).
Przedruki i uprawnienia
