Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Summary

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Abstract

Podstawowym celem w biologii jest zrozumienie, w jaki sposób wzorce pojawiają się podczas rozwoju. Kilka grup wykazało, że wzorce można osiągnąć in vitro, gdy komórki macierzyste są przestrzennie ograniczone do mikrowzorców, tworząc w ten sposób modele eksperymentalne, które oferują unikalne możliwości zidentyfikowania, in vitro, podstawowych zasad organizacji biologicznej.

Tutaj opisujemy naszą własną implementację metodologii. Dostosowaliśmy technikę foto-patterningu, aby zmniejszyć zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt, aby ułatwić ustalenie metody w standardowym laboratorium biologii komórki. Opracowaliśmy również darmową, otwartą i łatwą w instalacji platformę do analizy obrazu, aby precyzyjnie zmierzyć preferencyjne położenie subpopulacji komórek w koloniach o standardowych kształtach i rozmiarach. Metoda ta umożliwia ujawnienie istnienia zdarzeń wzorcowych nawet w pozornie zdezorganizowanych populacjach komórek. Technika ta zapewnia wgląd ilościowy i może być wykorzystana do rozdzielenia wpływów środowiska (np. sygnałów fizycznych lub sygnalizacji endogennej) na dany proces wzorcowania.

Introduction

W systemach ssaków, wzorce są emergentną właściwością zbiorowego zachowania komórek, a więc wzorce mogą powstawać in vitro, jeśli odpowiednie wskazówki zostaną dostarczone do komórek^1,2^,3,4,5^,6. Jednym ze sposobów ujawnienia wewnętrznej zdolności komórek do samoorganizacji in vitro jest zmuszenie komórek do tworzenia grup/kolonii o określonych kształtach i rozmiarach^7,8,9,10. Techniką, która to umożliwia, jest micropatterning¹¹. Mikromodelowanie umożliwia precyzyjne określenie miejsca, w którym cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) osadzają się na powierzchni. To z kolei dyktuje, gdzie komórki mogą przylegać, a tym samym kontroluje, jak komórki organizują się przestrzennie.

Mikromodelowanie to technika o wielu zastosowaniach, na przykład mikromodelowanie umożliwia standaryzację warunków początkowych przed różnicowaniem¹². Co ważne, mikrowzorce umożliwiają łatwą kontrolę wielkości, kształtu i odstępów między koloniami komórkowymi, a właściwość ta może być wykorzystana do opracowania eksperymentów mających na celu zbadanie zbiorowej odpowiedzi komórek na morfogen lub na sygnały fizyczne^7,8^{,10,13,14,15,16,17}.

Opracowano kilka metod tworzenia mikrowzorów¹¹. Techniki fotowzorcowania są prawdopodobnie najłatwiejszymi metodami do ustanowienia¹⁸. Podejścia te mają również tę zaletę, że są precyzyjne, ponieważ mogą być używane do kontrolowania kształtu pojedynczych komórek^18,19,20. Wymagają jednak również drogiego specjalistycznego sprzętu, w tym powlekarki wirowej, komory plazmowej i środka czyszczącego UVO (UV-Ozone), które na ogół nie są łatwo dostępne w standardowych laboratoriach biologicznych. Aby ułatwić przyjęcie tej techniki, dostosowaliśmy protokół tak, aby wymagał tylko lampy UVO. Zaczynamy od dostępnych na rynku szkiełek plastikowych, które można przyciąć nożyczkami lub dziurkaczem do pożądanego formatu.

Jednym z ważnych zastosowań mikrowzorów jest możliwość standaryzacji kolonii w celu porównania poszczególnych kolonii w wielu powtórzeniach. Pozwala to na pytanie, w jakim stopniu tworzenie się wzorców w tych koloniach jest powtarzalne, oraz na zbadanie czynników, które wpływają na odporność procesu tworzenia wzorców. Co ważne, kwantyfikacja "uśrednionych" wzorców w wielu standaryzowanych koloniach może również ujawnić procesy wzorcowe, które w przeciwnym razie nie byłyby widoczne. Zaletą możliwości ilościowego określenia wzorców na standaryzowanych koloniach jest możliwość dokładnego pomiaru ekspresji białek, najlepiej na poziomie pojedynczej komórki. Jednak komórki na mikrowzorach są często ciasno upakowane, co utrudnia ich segmentację z dużą dokładnością. Komórki często organizują się w trzech, a nie dwóch wymiarach, a wykrycie i zachowanie informacji trójwymiarowych (3D) podczas segmentacji może być trudne. Po pomyślnej segmentacji komórek potrzebne są metody obliczeniowe do wyodrębnienia informacji o wzorcach z wynikowych zestawów danych.

Opracowaliśmy narzędzia do segmentacji i analizy obrazów, aby pomóc przezwyciężyć te problemy. Ta metoda analizy wykorzystuje wyłącznie bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga znajomości wiersza poleceń ani programowania do wdrożenia. Aby zilustrować tę metodę, używamy mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES), które spontanicznie wyrażają marker wczesnego różnicowania brachyury (Tbra)^21,22. Chociaż żaden widoczny układ przestrzenny nie jest wykrywalny wizualnie, metoda ta pozwala na stworzenie mapy preferencyjnego rozmieszczenia komórek T+ w koloniach. Pokazujemy również, że wzorzec Tbra kontrastuje z brakiem preferencyjnej lokalizacji komórek wyrażających Id1, bezpośredni odczyt szlaku białka morfogenetycznego kości (BMP)²³. Omówiono również obecne ograniczenia metody i sposób, w jaki można ją zaadaptować do innych systemów eksperymentalnych.

Protocol

UWAGA: Przegląd metody znajduje się w Rysunek 1.

1. Projekt maski

1. Zaprojektuj fotomaskę zgodnie z wytycznymi opisanymi w Azioune et al.¹⁸. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać odniesienie do producenta oprogramowania i maski użytej w tym badaniu.
   UWAGA: Na jednej masce można utworzyć wiele geometrii, rozmiarów lub odstępów między kształtami. Do lampy UV można zamontować fotomaskę o długości 15 cm, która może zawierać do 49 różnych wzorów (przy założeniu chipów o wymiarach 2 cm x 2 cm).

2. Procedura wytwarzania mikrowzorów

1. Przygotuj niezbędne materiały.
   1. Przygotować roztwór 0,1% poloksamu 407 (10 mg na 10 ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pozostawić na shakerze w temperaturze pokojowej. Poloksamer 407 rozpuszcza się po około 20 minutach.
   2. Ułóż film laboratoryjny (patrz Tabela Materiałów) na dnie kwadratowej szalki Petriego o średnicy 10 cm. Będzie ona używana jako komora do osadzania matrycy.
   3. Oczyść powierzchnię fotomaski, najpierw 100% acetonem, następnie 100% izopropanolem, a na końcu ddH₂O. Jeśli to możliwe, wysusz fotomaskę na powietrzu lub w inny sposób osusz maskę czystym ręcznikiem papierowym.
   4. Przygotuj kwadratowy, sztywny i nieprzezroczysty kawałek plastiku o dokładnie takim samym rozmiarze jak fotomaska (dalej nazywana "uchwytem").
      UWAGA: Będzie to używane do utrzymywania plastikowych szkiełek nakrywkowych w kontakcie z fotomaską podczas etapu oświetlenia.
   5. Włącz lampę UVO i uruchom oświetlenie rozgrzewające przez 10 minut.
2. Tworzenie wiórów fotowzorzystych.
   UWAGA: Możliwe jest dostosowanie procedury do tworzenia wiórów o dowolnym pożądanym rozmiarze. Dla uproszczenia opisujemy tutaj procedurę generowania okrągłego chipa z mikrowzorem o średnicy 12 mm.
   1. Za pomocą dziurkacza o średnicy 12 mm wytnij hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i umieść je na nowej, czystej szalce Petriego.
      UWAGA: Przez cały czas używaj rękawiczek, aby uniknąć kontaktu skóry z powierzchnią plastiku, ponieważ może to uszkodzić obróbkę powierzchni.
   2. Ostrożnie usuń folię ochronną z szkiełek nakrywkowych za pomocą pęsety.
      UWAGA: Należy unikać uszkadzania powierzchni tworzywa sztucznego, ponieważ może to wpłynąć na rozmieszczenie komórek na chipie podczas procedury wysiewu (rozdział 3).
   3. Umieść fotomaskę na czystej i stabilnej powierzchni (np. pudełku z fotomaską), chromowaną stroną do góry i dodaj kroplę 2 μl ddH₂O w miejscu żądanego projektu chipa.
   4. Położyć szkiełko nakrywkowe na kropli ddH₂O i delikatnie docisnąć.
      UWAGA: Upewnij się, że plastikowa strona, która jest skierowana w stronę fotomaski, jest stroną, która była chroniona przez folię, która została usunięta we wcześniejszym kroku.
   5. Umieść uchwyt na plastikowych szkiełkach i ostrożnie przymocuj tę kanapkę za pomocą zacisków, aby plastikowe elementy stykały się z fotomaską.
      UWAGA: Umieść zaciski jak najbliżej miejsca, w którym znajdują się plastikowe szkiełka, aby zapewnić, że plastikowe szkiełka są idealnie utrzymane w kontakcie z powierzchnią fotomaski.
   6. Umieść zespół w lampie UVO w odległości około 2 cm od źródła światła i świec przez 10 min.
      UWAGA: Moc światła szacuje się na 6 mW/^cm2 przy długości fali 254 nm, gdy chip jest umieszczony w odległości 2 cm od źródła.
   7. Przytrzymaj kanapkę z fotomaską na dole i ostrożnie zdejmij zaciski, utrzymując nacisk jedną ręką, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek podczas demontażu kanapki. Wyjmij uchwyt, upewniając się, że wszystkie plastikowe elementy nadal znajdują się na masce i nie przyklejają się do uchwytu.
   8. Dodaj ddH₂O na wierzch frytek i delikatnie odłącz wióry od fotomaski.
      UWAGA: Jeśli plastikowy chip przykleił się do fotomaski, odłącz chip za pomocą plastikowej końcówki pipety, aby popchnąć chip, trzymając pęsetę nieco nad chipem na wypadek nagłego oderwania się chipa.
   9. Na koniec umieść fotowzorzyste chipy w komorze osadzania matrycy.
      UWAGA: Upewnij się, że podświetlona strona chipa jest skierowana do góry.
3. Zdeponuj plik matrix.
   UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tej sekcji powinny być wykonywane w kapturze do hodowli tkankowych.
   1. Przefiltrować roztwór poloksamu 407 przez filtr polieterosulfonowy (PES) o stężeniu 0,22 μm.
   2. Przygotować roztwór powlekający ECM, mieszając 500 μg/ml sterylnego, przefiltrowanego poloksamu 407 i 1 mg/ml żelatyny.
      UWAGA: Patrz również Tabela 1 w celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących innych możliwych cząsteczek ECM.
   3. Dodać 200 μl roztworu powlekającego na każdy podświetlony wiór. Folia laboratoryjna zapobiegnie wypadnięciu kropli na zewnątrz chipa.
   4. Dodać 3 cm szalkę Petriego wypełnioną ddH₂O w celu ograniczenia parowania i umieścić ją razem z frytkami w temperaturze 4 °C na noc.

3. Procedura wysiewu

UWAGA: Kroki opisane poniżej zostały zoptymalizowane dla mysich embrionalnych komórek macierzystych CGR8 (mESC)²⁴ przy użyciu standardowej pożywki mESC (zobacz również Tabelę Materiałów). Zasadniczo możliwe jest jednak dostosowanie procedury do każdego typu komórki. Należy również zauważyć, że konwencjonalna hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy nie jest tutaj opisana, ponieważ obszerną dokumentację można znaleźć gdzie indziej²⁵.

1. Odessać roztwór powlekający i inkubować wióry dwukrotnie przez co najmniej 5 minut w sterylnym PBS.
2. W międzyczasie przygotuj zawiesinę komórkową 5,5 x 10⁵ komórek/ml w ciepłym podłożu.
3. Odpipetuj 200 μl zawiesiny komórek na każdy chip (~100 000 komórek/cm²).
4. Zamknij komorę wysiewającą i pozostaw komórki do przylegania przez 1 godzinę w inkubatorze.
5. Po upływie 1 godziny napełnić dołki płytki wielodołkowej (płytki 4-dołkowej lub 24-dołkowej w zależności od liczby wiórów) 500 μl/dołek ciepłego podłoża i przenieść wiórki do płytki za pomocą sterylnej pęsety.
6. Energicznie wstrząsnąć płytką w celu oderwania nieprzylegających komórek. Zassać pożywkę i natychmiast zastąpić świeżą, ciepłą pożywką. Sprawdź pod mikroskopem, czy wzór jest widoczny (Rysunek 2a).
   UWAGA: W przypadku korzystania z linii komórkowych innych niż mESC lub inne białka macierzy może być konieczne zoptymalizowanie czasu adhezji (patrz również Tabela 2).
7. Powtarzaj ten krok, aż wzorce staną się wyraźnie widoczne, jak pokazano na Rysunek 2a.
   UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie i decyduje o powodzeniu zabiegu. Zbyt intensywna procedura mycia może spowodować oderwanie komórek, natomiast niewystarczające mycie może spowodować, że komórki pozostaną połączone między wzorami (ryc. 2c,d).

4. Fiksacja

UWAGA: Po 48 godzinach w hodowli komórki powinny tworzyć gęste kolonie, które ściśle podążają za kształtem wzorów (jak pokazano w Rysunek 2b).

1. Pozostawiając wióry na płycie, usuń ~90% podłoża, pozostawiając tylko tyle podłoża, aby zapobiec wysychaniu frytek.
   UWAGA: Ważne jest, aby chip nigdy nie wyschł, aby uniknąć plam na artefaktach i zapobiec oderwaniu się komórek od powierzchni. Ze względu na hydrofobowość powierzchni wióra między wzorami kleju, wiór może mieć tendencję do odmokania. Na tym etapie utrwalacz może spowodować oderwanie się dużych kopulastych kolonii od chipa. Mycie powinno być bardzo delikatne, najlepiej przez pipetowanie płynu z boku studzienki, a nie bezpośrednio na wiór.
2. Dodać co najmniej 500 μl roztworu utrwalającego na bazie paraformaldehydu (PFA) do dołka i inkubować przez 10 min.
   UWAGA: Jeśli kolonie wydają się szczególnie grube (więcej niż 5 warstw komórek), może być konieczne dostosowanie czasu utrwalania do 20 minut.
3. Po utrwaleniu przemyć 3 razy roztworem myjącym (PBS z 0,01% poloksamerem 407). Dodatkowe płukanie przy użyciu 50 mM NH₄Cl rozcieńczonego w roztworze myjącym może być interkalowane w celu stłumienia resztkowej aktywności sieciowania PFA.
4. Próbki inkubować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokującym.
   UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez około tydzień przed barwieniem. Jeśli tak, uszczelnij płytkę folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu.

5. Barwienie immunologiczne

1. Przygotować komorę barwienia, umieszczając arkusz folii laboratoryjnej na dnie kwadratowej szalki Petriego o powierzchni 10 cm.
2. Przygotuj roztwory przeciwciał (w Tabeli 3 znajduje się wykaz przeciwciał i rozcieńczeń stosowanych w tym artykule).
3. Umieść chip w komorze barwienia stroną podpierającą komórki skierowane do góry i natychmiast dodaj 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na chip.
   UWAGA: Na tym etapie wióry nie powinny być łatwe do zwilżenia, jak w kroku 4.1. Należy jednak nadal zachować ostrożność, ponieważ ważne jest, aby frytki nie wyschły. Jeśli konieczne jest przetworzenie wielu wiórów, wykonaj krok 5.3 do każdego wióra po kolei.
4. Inkubować przez 1 godzinę na platformie obrotowej w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Jeśli komórki utworzyły duże struktury 3D, może być wymagany dłuższy czas inkubacji, aby umożliwić równomierne barwienie próbki. Czas inkubacji może być wydłużony do 24 godzin. Jednak komora barwienia musi zawierać 3 cm naczynie wypełnione wodą, a komora barwienia musi być uszczelniona folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu.
5. Przenieś frytki na świeżą płytkę wielodołkową i umyj 3 razy roztworem myjącym.
6. Przeprowadzić inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi, jak opisano w krokach 5.3 i 5.4.
7. Zamontuj chip na szkiełku mikroskopowym za pomocą 20 μl dowolnego standardowego medium montażowego (np. Mowiol).

6. Obrazowanie

UWAGA: Obrazowanie można wykonać za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego. W tym przypadku podajemy jedynie zalecenia mające na celu zapewnienie jakości obrazu, która będzie wystarczająca do późniejszej analizy ilościowej.

UWAGA: Aby uniknąć stronniczości operatora, kolonie do obrazowania powinny być wybierane tylko za pomocą sygnału obwiedni jądrowej (aby sprawdzić, czy kolonia prawidłowo podąża za kształtem wzorca). Unikaj sprawdzania sygnału interesujących Cię markerów, z wyjątkiem regulacji ustawień mikroskopu.

1. Upewnij się, że głębia bitowa akwizycji wynosi 12 lub 16 bitów.
2. Zidentyfikuj odpowiednie ustawienia, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny dla każdego kanału obrazu. W szczególności należy unikać przycinania obrazu.
3. Dołącz kanał do obrazowania autofluorescencji mikrowzoru (patrz Rysunek 3).
4. Dostosuj rozmiar obrazu i współczynnik powiększenia, aby uzyskać rozmiary wokseli w zakresie od 0,1 do 0,6 μm w osiach x i y oraz od 0,2 do 2 μm w osi z.
   UWAGA: Na przykład w tym badaniu użyliśmy odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40x (apertura numeryczna równa 1,3), rozmiarem obrazu 1024 x 1024 pikseli bez zoomu cyfrowego i rozmiarem kroku z 0,5 μm. Dało to rozmiar woksela 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm.
5. Dla każdej kolonii zdefiniuj minimalną i maksymalną pozycję wzdłuż osi z, aby upewnić się, że cała kolonia zostanie nabyta. Co najmniej jedna płaszczyzna o słabym lub zerowym sygnale powinna znajdować się poniżej i powyżej kolonii.
6. Upewnij się, że orientacje stosu z są uzyskiwane spójnie (zawsze od góry do dołu lub zawsze od dołu do góry)
7. Dostosuj szybkość skanowania, rozdzielczość obrazu, uśrednianie klatek i wzmocnienia detektora, aby określić optymalną jakość obrazu i czas obrazowania. Orientacyjnie, czas obrazowania dla jednej kolonii, jak pokazano na Rysunek 3, wynosił około 2–3 minut. Wykonaj akwizycję obrazu.
   UWAGA: Wszystkie obrazy, aby były porównywalne, muszą być uzyskane pod tym samym mikroskopem z tym samym obiektywem i ustawieniami akwizycji.
8. Na koniec akwizycji zapisz wszystkie obrazy i przypisz unikatową konwencję nazewnictwa, aby zidentyfikować warunki eksperymentalne, które reprezentuje każdy obraz.
   UWAGA: Zobacz Rysunek 4 jako przykład, ta konwencja zostanie użyta później podczas procedury analizy. Należy pamiętać, że obrazy mogą być zapisywane w dowolnym formacie obsługiwanym przez BioFormats ²⁶. Jeśli kolonie są większe niż pole widzenia, można użyć wtyczki do szycia ImageJ²⁷. Należy również pamiętać, że w przypadku przeszywania może być konieczna korekta zwijania oświetlenia.

7. Analiza obrazu

UWAGA: Zalecane specyfikacje komputera dla tej procedury to: 16 GB RAM, wielordzeniowy procesor 3,33 GHz i co najmniej 50 GB miejsca na dysku (lub więcej, w zależności od liczby układów, które zostały zobrazowane). Oprogramowanie zostało przetestowane w systemach Linux, Windows i MacOS. PickCells to wieloplatformowa aplikacja do analizy obrazów z graficznym interfejsem użytkownika dedykowanym do analizy zbiorowej organizacji komórek na złożonych wielowymiarowych obrazach (Blin i in., w przygotowaniu). Należy pamiętać, że więcej informacji na temat PickCells, jak również dokumentację dla konkretnych modułów wymienionych tutaj, można znaleźć w Internecie: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Należy również pamiętać, że interfejs może ulec zmianie w miarę ulepszania oprogramowania. Jeśli interfejs różni się od tego, co pokazano na rysunku lub filmie, zapoznaj się z instrukcją online.

1. Zainstaluj i uruchom PickCells zgodnie z dokumentacją dostępną online.
2. Zaimportuj obrazy i sprawdź dokładność podanych informacji (Rysunek 4-1).
3. Udokumentuj nazwę każdego kanału.
4. Segmentuj jądra na podstawie sygnału obwiedni jądrowej za pomocą modułu Nessys²⁸ (Rysunek 4-2) i podaj prefiks (na przykład "jądra"), który będzie używany do nazywania wygenerowanych obrazów segmentowanych.
   UWAGA: Dokumentację dotyczącą użytkowania i regulacji parametrów można znaleźć pod adresem https://framagit.org/pickcellslab/nessys.
5. Sprawdź i edytuj segmentacje, jeśli to konieczne, korzystając z modułu edytora segmentacji (Rysunek 4-3)
   UWAGA: Jeśli z jakiegokolwiek powodu proces segmentacji nie przyniósł zadowalających wyników, ręcznie usuń obrazy w folderze bazy danych, a także usuń węzeł "wynik segmentacji" w widoku MetaModel. Następnie powtórz kroki 7.4 i 7.5. Jeśli segmentacja tylko małego podzbioru obrazów nie przyniosła zadowalających wyników, użyj samodzielnej aplikacji Nessys (patrz link w 7.4), spróbuj segmentacji na "wadliwych obrazach" i zastąp odpowiedni plik w folderze bazy danych).
6. Segmentacja sygnału autofluorescencji wzorca za pomocą podstawowego modułu segmentacji (Rysunek 4-4)
   1. Podaj prefiks ("wzorzec", na przykład), który będzie używany do nazywania wygenerowanych obrazów podzielonych na segmenty.
   2. Wybierz kanał zawierający sygnał autofluorescencji.
   3. Zastosuj redukcję szumów; zazwyczaj użycie filtra Gaussa o wielkości ziarna 10 x 10 x 0,5 wokseli daje zadowalające wyniki.
   4. Ustaw dolny próg tak, aby tło było wyświetlane na niebiesko, a pierwszy plan był biały. Ustaw również górny próg na jego maksymalną wartość, aby uniknąć wykluczenia wysokich intensywności z wyniku końcowego (czerwone obszary).
   5. Wybierz opcję Pomiń, aby przejść do ostatniego kroku.
   6. Kliknij Zakończ i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
7. Jeśli chodzi o jądra, wyniki segmentacji można teraz wizualnie sprawdzić i w razie potrzeby skorygować za pomocą modułu edytora segmentacji (Rysunek 4-5).
8. Tworzenie obiektów jądrowych i obliczanie podstawowych cech obiektów.
   1. Uruchom moduł funkcji wewnętrznych z paska zadań po lewej stronie głównego interfejsu (Rysunek 4-6).
   2. Zamknij panele Ellipsoid Fitter i Surface Extractor, aby otwarty był tylko panel Basic Features.
   3. Wybierz Nucleus jako typ obiektu i wybierz prefiks podany w kroku 7.4 dla "obrazów podzielonych na segmenty".
   4. Naciśnij przycisk Compute i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
      UWAGA: Po tym kroku nie będzie już możliwa ponowna edycja segmentacji jąder.
9. Tworzenie obiektów wzorca i obliczanie podstawowych cech obiektu. Powtórz kroki od 7.8.1 do 7.8.4, tylko tym razem wybierz Typ niestandardowy jako typ obiektu i prefiks podany w kroku 7.6.1 dla obrazów podzielonych na segmenty.
   UWAGA: Po wykonaniu tego kroku nie będzie już można ponownie edytować segmentacji wzoru.
10. Przechowuj nazwę obrazu, do którego należy każde jądro, jako atrybut jądra.
    1. Kliknij Data > Nowy atrybut i wybierz Nucleus w wyskakującym oknie dialogowym, a następnie kliknij OK.
    2. Wybierz opcję Zbierz dane z innych obiektów połączonych z węzłem i kliknij przycisk Dalej.
    3. W lewym panelu wybierz opcję Obraz, a następnie kliknij dwukrotnie znak przesłuchania pod flagą Zakończ w panelu Definicja ścieżki, aby ustawić węzeł obrazu jako cel ścieżki.
    4. Rozwiń okienko Dostępne atrybuty w lewym panelu i wybierz atrybut nazwy.
    5. Rozwiń okienko operacji redukcji i wybierz opcję Pobierz jeden, a następnie kliknij przycisk zmiany i kliknij przycisk Dalej.
    6. Wpisz "Nazwa obrazu", naciśnij Tab i kliknij OK.
11. Utwórz atrybut "znormalizowanej współrzędnej" w obiektach jądrowych (Rysunek 4-7).
    1. Dostosuj kroki od 7.10.1 do 7.10.6, aby przechowywać współrzędne środka ciężkości wzoru jako atrybut jądra. Nazwij ten nowy atrybut "Współrzędna wzorca".
    2. Następnie kliknij Dane > Nowy atrybut, wybierz Nucleus i kliknij OK.
    3. Wybierz opcję Zdefiniuj funkcję między wektorami przestrzennymi lub kierunkowymi węzła i kliknij przycisk Dalej.
    4. W polu Typ funkcji wybierz pozycję Operacja szykowa, w polu V1 wybierz pozycję Wektor elementu, a następnie pozycję Centroid, a w polu Wersja 2 wybierz pozycję Wektor elementu, a następnie pozycję Współrzędna wzorcae.
    5. Kliknij przycisk Dalej, wpisz "Współrzędna znormalizowana" w polu Nazwa i kliknij przycisk Zakończ.
12. Wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanego tabulatorami.

8. Analiza R

1. Pobierz i zainstaluj Rstudio.
   UWAGA: Informacje o oprogramowaniu i łącza do pobrania są dostępne pod adresem https://www.rstudio.com/.
2. Pobierz skrypty języka R wymagane do tej analizy.
   UWAGA: Skrypty można pobrać z repozytorium GitLab: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
3. Otwórz Rstudio.
   UWAGA: Jeśli uruchamiasz skrypty po raz pierwszy, zainstaluj wymagane pakiety języka R (ggplot2 i skale).
4. W Rstudio otwórz binnedmap_template. Skrypt języka R.
5. Ustaw katalog roboczy na lokalizację pliku źródłowego.
6. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w skrypcie, aby dostosować skrypt do dowolnego zestawu danych w celu uzyskania map przestrzennych, jak pokazano w Rysunek 5.
7. Uruchom skrypt, aby wygenerować mapy zagęszczenia.

Results

Opisana tutaj metoda foto-patterningu umożliwia precyzyjne organizowanie hodowanych komórek w kolonie o określonych kształtach i rozmiarach. Powodzenie tej procedury powinno być wyraźnie widoczne natychmiast po procedurze wysiewu komórek (krok 3.7), ponieważ przylegające komórki będą grupować się zgodnie z projektem fotomaski, jak pokazano na Rysunek 2a. Po 1 godzinie od wysiewu komórek poszczególne wzorce mogą nie być w pełni zlewające się (tylko kilka komórek na wzór), jednak w miarę namnażania się komórek w czasie, wzorce zostaną w pełni skolonizowane, a tylko kilka komórek znajdzie się poza powierzchniami adhezyjnymi (Rysunek 2b). Dokładny wygląd kultury będzie zależny od linii komórkowej. Na przykład mESC tworzy kolonie w kształcie kopuły¹⁰. Chip, w którym wzór nie jest wyraźny 1 do 2 godzin po wysiewie komórek, wskazuje na niepowodzenie procedury ( Rysunek 2c, d).

Duże i grube kolonie mogą czasami stanowić wyzwanie do jednorodnego zabarwienia. Sugerujemy utrwalenie i przepuszczalność komórek w jednym kroku (sekcja 4), ponieważ może to poprawić penetrację przeciwciał²⁹. To jest powód, dla którego wybrany roztwór utrwalający zawiera detergent. Rycina 3 przedstawia sygnał fluorescencji, który jest oczekiwany po barwieniu immunologicznym. Zauważ, że jasne komórki Id1 dodatnie znajdują się w gęstych regionach (jasnych regionach NPC) kolonii (Rysunek 3A). Wskazówki takie jak ta są przydatne do oceny jakości procedury barwienia przeciwciał. Zauważ również, że mikrowzory stworzone tą techniką są autofluorescencyjne. Ten sygnał (Rysunek 3A,B po lewej większości obrazów) jest przydatny na etapie analizy, aby przestrzennie zarejestrować kolonie między sobą i stworzyć wyniki pokazane w Rysunek 5. Sygnał autofluorescencji jest na ogół najjaśniejszy, gdy próbka jest wzbudzana laserem o długości fali 405 nm i w tym celu kanał ten należy pozostawić bez barwienia. Rysunek 3 pokazuje również, jak komórki są precyzyjnie ograniczone do wzorów o różnych kształtach.

Analiza danych obrazowych jest wykonywana w PickCells, darmowym oprogramowaniu o otwartym kodzie źródłowym opracowanym w naszym laboratorium (Blin et al., w przygotowaniu). To oprogramowanie zawiera moduły analizy obrazu do odczytywania i sortowania obrazów konfokalnych (Rysunek 4-1), do segmentacji ( Rysunek 4-2,4-4) i selekcji obiektów podzielonych na segmenty ( Rysunek 4-3,4-5), do obliczania cech obiektu, takich jak współrzędne lub średnia intensywność ( Rysunek 4-6) oraz do eksportowania danych ( Rysunek 4-7,4-8). Co ważne, opracowaliśmy solidną metodę segmentacji jądrowej o nazwie Nessys²⁸, która jest szczególnie przydatna dla gęstych i niejednorodnych populacji komórek, takich jak komórki hodowane na mikrowzorcach (Rysunek 3). Rysunek 4-2 pokazuje reprezentatywne wyjście modułu Nessys, gdzie każda pojedyncza komórka ma dokładnie przypisaną unikalną tożsamość kolorystyczną. Tylko minimalna edycja powinna być konieczna, jednak edycja jest wykonalna, jeśli użytkownik tak zdecyduje (Rysunek 4-3). Wreszcie, PickCells zapewnia szereg modułów wizualizacyjnych do wizualizacji danych. Przykład jest podany w Rysunek 4-6: kolonia w kształcie pierścienia jest renderowana w 3D, gdzie jądra są oznaczone kolorami zgodnie z ich położeniem wzdłuż osi z. Po zweryfikowaniu analizy w PickCells dane można wyeksportować w celu utworzenia map przestrzennych w R za pomocą skryptów dostępnych pod adresem (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr), jak pokazano w Rysunek 5³⁰.

Ostatnio wykazaliśmy, że przestrzenne ograniczenie mESC na małych (30 000^μm2) mikrowzorcach dysku lub elipsy kieruje wzorcami subpopulacji komórek wyrażających mezodermalny marker Tbra¹⁰. Tak więc, aby zilustrować naszą metodę, pytamy, czy sygnalizacja BMP w większych koloniach (90 000^μm2) może mieć wpływ na wzorce Tbra. Rysunek 5A pokazuje, że gdy mESC są hodowane na dużych mikrowzorcach dyskowych, komórki Tbra+ są preferencyjnie ograniczone do peryferii wzoru (mapa gęstości Tbra+), gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa (zobacz niebieską mapę po lewej stronie Rysunek 5A). Ten wzorzec Tbra jest potwierdzony przez mapę średniej intensywności Tbra.

Te dane pokazują, że metoda może ujawniać informacje o sub-visualu. Rzeczywiście, z Rysunek 3, oględziny jednej kolonii nie są wystarczające do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej w wyrażeniu Tbra. Jest to w szczególności wyjaśnione przez ważną zmienność między koloniami, która jest określona ilościowo i pokazana w skrajnym prawym panelu Rysunek 5A.

Technika pokazuje również, że nie ma wykrywalnego wzorca dla Id1 (celu sygnalizacji BMP), co może wskazywać, że wzorzec T nie jest sterowany przez sygnalizację BMP w tym kontekście.

Mikrowzorzec umożliwia zmuszenie kolonii do przyjęcia niemal dowolnej geometrii. Jest to szczególnie przydatne do sprawdzenia, w jaki sposób system reaguje na różne geometrie. Na przykład, możemy wywnioskować, że jeśli gradient morfogenu gromadzi się w środku kolonii, utworzenie w kolonii zakłóciłoby ten gradient. Co ciekawe, nadal obserwujemy wzorzec na mikrowzorze pierścieniowym, choć w mniej solidny sposób (Rysunek 5B).

Rysunek 1: Omówienie metody. Diagram przedstawiający główne etapy metody. Dla każdego kroku pod nazwą zadania wskazany jest szacowany czas pracy, a cel procedury ilustruje schemat. Podano również odniesienie do odpowiedniego rysunku, jeżeli jest on dostępny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Pojawienie się kultury po 1 godzinie i 48 godzinach od wysiewu komórek na mikrowzorcach. Obrazy w jasnym polu mESC zasiane na mikrowzorcach. a) Przewidywana organizacja komórek 1 godzinę po wysiewie, wzorce powinny być wyraźnie identyfikowalne. b) Oczekiwany wynik po 48 godzinach posiewów. mESC rozpowszechniły się i nadal są ściśle ograniczone do kształtów wzorców. (c–d) Możliwe nieoptymalne wyniki: albo bardzo niewiele komórek przylega do plastiku, z wyjątkiem obrzeża szkiełka (c), albo komórki przylegają między wzorami (d). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z przewodnikiem rozwiązywania problemów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne obrazy konfokalne kolonii barwionych immunologicznie wyhodowanych na mikrowzorcach.
Reprezentatywne kolonie mESC po immunofluorescencji dla (A) Id1 i kompleksu porów jądrowych lub (B) Tbra i LaminB1. Dla każdego barwienia pokazana jest kolonia wyhodowana na mikrowzorze krążkowym i kolonia wyhodowana na mikrowzorze pierścieniowym. Poszczególne kanały są dostarczane jako obrazy w skali szarości. Zwróć uwagę na wyraźny sygnał autofluorescencji mikrowzoru (wzbudzenie laserem 405 nm). Podziałka skali reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Schemat blokowy procedury analizy obrazu. Lista obrazów konfokalnych 3D jest importowana do PickCells w celu analizy (1). Ten przykład pokazuje eksperyment z dwoma różnymi kształtami (dyski i pierścienie, jak w Rysunek 2). Konwencja nazewnictwa obrazów jest pokazana po lewej stronie, a interfejs PickCells po prawej. Następnie moduł Nessys służy do automatycznej segmentacji jąder (2). Na zrzucie ekranu każde pojedyncze jądro ma unikalny kolor wskazujący na dokładną segmentację. Autofluorescencja wzoru jest również segmentowana, tym razem za pomocą modułu "segmentacji podstawowej" (4). Tło pojawia się w kolorze niebieskim, a sygnał będzie zdefiniowany jako kształt wzoru. Segmentowane kształty są następnie sprawdzane wizualnie w celu zapewnienia dokładnej segmentacji i edytowane w razie potrzeby za pomocą modułu edytora segmentacji (3–5). Zrzuty ekranu pokazują kontur wykrytych kształtów. Różowe i żółte kształty zostały zmodyfikowane. Na koniec cechy obiektów są obliczane i eksportowane do pliku w celu późniejszego przetworzenia do R (6–7). Dostępny jest zrzut ekranu przedstawiający kolonię renderowaną jako widok 3D (6). W przypadku kroków od 2 do 6 ikony znajdujące się w interfejsie PickCells w momencie pisania tego artykułu są podane obok indeksu kroku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla dwóch różnych czynników transkrypcyjnych i kształtów mikrowzorów
Zbiorcza mapa przestrzenna dla mESC hodowanego przez 48 godzin na (A) mikrowzorcach w kształcie dysku lub (B) mikrowzorcach w kształcie pierścienia. Dla każdego kształtu mikrowzoru mapa gęstości komórek, niezależnie od fenotypu komórki, jest pokazana po lewej stronie z niebieską skalą kolorów. Następnie dla każdego znacznika (Tbra w górnym rzędzie i Id1 w dolnym rzędzie) dostarczane są trzy odrębne mapy, od lewej do prawej: mapa gęstości komórek tylko znacznika wyrażającego komórki (analiza oparta na progu), mapa średniej intensywności znacznika (log2) i mapa odchylenia standardowego intensywności znacznika. Intensywności są podawane jako dowolne jednostki fluorescencji. Dla każdej mapy kształt mikrowzoru jest podany jako biały kontur. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	Typ ECM	żelatyna	Fibronektyna	Matryca membrany podstawnej
Koncentracja	Stężenie ECM	1 mg/ml	20 μg/ml	200 μg/ml
	Koncentracja Poloxameru 407	500 μg/ml	400 μg/ml	1 mg/ml
Testowane z	Macierzy macierzyste	tak	tak	tak
	mEpiSC	Nie	tak	tak
	Pożywka wolna od surowicy	Nie	tak	tak

Tabela 1: Testowane stężenia poloksamu 407 i ECM. Poniższa tabela zawiera przegląd stężeń ECM i poloksamu 407, które przetestowaliśmy w naszym laboratorium. Dla każdej kombinacji ECM/poloksamu 407 pokazany jest typ komórki, dla której udało się uzyskać wzór, a także to, czy hodowla zawierała surowicę, czy nie. mESC = embrionalna komórka macierzysta myszy, mEpiSC = komórka macierzysta epiblastu myszy.

procedura	obserwacja	Możliwy problem	rozwiązanie
Mikrowzorce	Niski dodatek komórkowy	niewłaściwy stosunek stężeń ECM/poloksamu 307	Zwiększenie stosunku stężenia ECM/poloksamu 307
		Zbyt krótki czas mocowania ogniwa	Wydłuż czas inkubacji, aby dać komórkom wystarczająco dużo czasu na prawidłowe przyleganie do wzorców (krok 3.4). Aby zoptymalizować ten etap, sprawdzenie komórek pod mikroskopem może pomóc w wykryciu zmiany w morfologii komórek wskazujących na to, że komórki zaczęły przylegać.
		Pranie jest zbyt intensywne (krok 3.6)	Podczas wymiany pożywki należy unikać pipetowania medium bezpośrednio na wióry. Zamiast tego delikatnie odpipetuj pożywkę na ściankach studni
	Komórki przylegają między wzorcami	niewłaściwy stosunek stężeń ECM/poloksamu 307	Zmniejszyć stosunek stężeń ECM/poloksamu 407
		Zbyt długi czas mocowania ogniw	Skróć czas inkubacji (krok 3.4).
		Pierze się nieskutecznie (krok 3.6)	Energiczne potrząsanie płytką zwykle wystarcza, aby w nadmiarze oderwać komórki. W przypadku typów komórek, które mają tendencję do silnego przylegania do chipa, pipetowanie bezpośrednio na chip może poprawić wynik. Pomocne może być również zwiększenie liczby prań, w szczególności w celu zapewnienia, że po tym etapie żadna komórka nie pozostanie unosząca się w podłożu.
	Komórki nie są ściśle zgodne z kształtem wzorca	"Niezgodny" typ komórki i geometria wzoru	Zaplanuj/zaprojektuj wiele geometrii/rozmiarów, które mają zostać dodane do fotomaski, aby móc przetestować i zidentyfikować optymalny rozmiar wzoru dla danego kształtu wzoru i typu komórki. Zapoznaj się z sekcją "Ograniczenia" w dyskusji
		Nieoptymalne fotowzorce, można to zdiagnozować, obserwując ostrość sygnału autofluorescencji. Granice wzoru powinny wyglądać ostro, jak na rys. 2. Jeśli granice wzorów wydają się rozmyte, oznacza to, że etap tworzenia fotowzorów musi zostać poprawiony.	Rozmyte krawędzie wzoru wskazują, że plastikowy szkiełko nie znajdowało się wystarczająco blisko powierzchni maski podczas etapu oświetlenia. Upewnij się, że elementy mocujące szkiełka do fotomaski są równe i że podczas procedury oświetlenia na zespół wywierany jest stały i wystarczający nacisk.
Barwienie	Niejednorodne barwienie	zbyt krótki czas inkubacji przeciwciał	Wydłużenie czasu inkubacji przeciwciał (do 24 godzin w temperaturze pokojowej)
		Kolonie spłaszczone podczas procedury montażu	Zamontuj szkiełka mikrowzorcowe w komorze, takiej jak komora chamlidowa lub cytoo, aby przeprowadzić zarówno barwienie immunologiczne, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwoli to lepiej zachować strukturę 3D kolonii.
	Odłączanie kolonii podczas procedury barwienia	Odwilżanie wióra	Pozostaw wystarczającą ilość podłoża lub użyj 2 pipet, jednej do usunięcia pożywki, a drugiej do dodania świeżego roztworu
	Kolonie wydają się ścięte pod mikroskopem	Kolonie zostały ścięte podczas montażu chipa na szkiełku mikroskopowym	Bądź bardzo delikatny podczas montażu chipów. Alternatywnie, zamontuj szkiełka z mikrowzorami w komorze, takiej jak chamlide lub cytookomory, aby przeprowadzić zarówno barwienie immunologiczne, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwala to również zachować ultrastrukturę kolonii.

Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów. Poniższa tabela zawiera przegląd możliwych nieoptymalnych wyników. Wymienione są również potencjalne źródła problemów wraz z zalecanymi rozwiązaniami.

Discussion

W tym miejscu opisujemy metodę analizy pojawiających się wzorców w kulturach komórkowych. Do standaryzacji kształtu i wielkości kolonii komórkowych stosuje się uproszczone podejście do mikrowzorców, a my prezentujemy narzędzia do analizy obrazu i skrypty R, które umożliwiają wykrywanie i kwantyfikację wzorców w obrębie tych kolonii.

Proponowana przez nas metoda jest do pewnego stopnia podobna do wcześniej opublikowanej metody³¹ , w której autorzy koncentrują się na warunkach hodowli, wykorzystując komercyjnie dostępne mikrowzorce, w celu uzyskania powtarzalnego tworzenia listków zarodkowych w koloniach ESC do badania wczesnych zdarzeń gastrulacji in vitro. Nasz cel jest bardziej skoncentrowany na dostarczeniu uogólnionego potoku do odkrycia tworzenia wzorców in vitro, gdzie zbiorowa organizacja komórek może stać się widoczna dopiero po analizie statystycznej. Z tego powodu zapewniamy solidny proces analizy obrazu, który umożliwia dokładną identyfikację i analizę pozycji jądra w przestrzeni 3D nad wieloma koloniami (patrz również sekcja "Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców" w tym omówieniu). Zdecydowaliśmy się również na opracowanie prostego, wewnętrznego podejścia do mikrowzorów, które oferuje bardziej elastyczną i tańszą alternatywę dla komercyjnie dostępnych rozwiązań w dłuższej perspektywie, co mamy nadzieję będzie przydatne dla społeczności.

Na koniec zauważamy, że podczas rewizji tego manuskryptu wydano nowy pakiet do analizy wzorców in vitro podobny do naszych skryptów R³². Ten nowy pakiet akceptuje tabele cech komórek jako dane wejściowe, które można uzyskać z wysokoprzepustowych platform obrazowania. Uważamy, że tabela cech jąder wygenerowana w kroku 7 naszego protokołu mogłaby w zasadzie służyć jako dane wejściowe do tego nowego pakietu, chociaż sami nie testowaliśmy tej możliwości.

Możliwość dostosowania metody do innych typów komórek i geometrii kolonii

Podejście to prezentujemy w kontekście badania powstawania mezodermalnych czynników transkrypcyjnych w hodowlach komórek pluripotencjalnych w obecności surowicy. Metodę tę można jednak łatwo dostosować do innych typów komórek i hodowli bez surowicy, chociaż może być konieczna optymalizacja stężeń ECM/poloksamu 407 (patrz Tabela 1 dla badanych stężeń i Tabela 2 dla przewodnika rozwiązywania problemów). Metoda może być również dostosowana do większych lub mniejszych rozmiarów mikrowzorów oraz do szerokiej gamy kształtów w zależności od potrzeb użytkownika. Jednak podczas ustalania metody ważne jest, aby mieć świadomość, że nie wszystkie kombinacje kształtu/typu komórki są optymalne. Na przykład mESC wyraża wysokie poziomy E-kadheryny^{33, 34} umożliwiając tym komórkom tworzenie zbiorowych struktur obejmujących obszary pozbawione ECM. Komórki te nie są ściśle zgodne z geometriami o ostrych kątach lub z małymi otworami we wzorze. Zauważ na przykład, że na pierścieniu na rysunku 3B komórki są w trakcie kolonizacji obszaru centralnego. W naszych rękach mniejszy obszar centralny nie zmuszał mESC do tworzenia kolonii w kształcie pierścienia. Dlatego zdecydowanie zaleca się uwzględnienie różnorodności geometrii podczas projektowania fotomaski, aby móc przetestować i zidentyfikować optymalne rozmiary i krzywizny, które będą odpowiednie dla wybranego typu komórki.

Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest długość eksperymentu i tempo proliferacji komórek. W przypadku niektórych szybko proliferujących typów komórek (w tym komórek pluripotencjalnych) utrzymanie komórek na mikrowzorcach przez wiele dni może być trudne (w przypadku mESC trzy dni to maksimum). Również wysiewanie komórek na mikrowzorcach nie zawsze przebiega optymalnie dla każdej kolonii, dlatego wskazane jest wysiewanie nadmiaru kolonii, aby mieć zapasowe.

Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców

Szczególną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania "uśrednionych" wzorców poprzez łączenie wyników analizy obrazu z wielu powtórzonych kolonii (ryc. 5). Może to ujawnić wzorce zdarzeń, które nie są widoczne podczas inspekcji poszczególnych kolonii. Wadą tego podejścia "uśredniającego" jest to, że może ono pominąć pewne rodzaje powtarzających się wzorów, na przykład małe plamki lub wąskie paski. Jednak tego typu wzory mogą zostać ujawnione za pomocą kombinacji starannie dobranych rozmiarów^{wzorów 8}. Ponadto opisany tutaj potok analizy obrazu dostarcza danych ilościowych zarówno w rozdzielczości pojedynczej komórki, jak i kolonii, oferując możliwość zbadania poziomu zmienności między koloniami (ryc. 5) lub przeprowadzenia analizy sąsiadów w wielu skalach¹⁰.

Kolejną ważną zaletą metody uśredniania jest to, że daje ona możliwość mapowania preferencyjnej lokalizacji wielu markerów bez ograniczeń dostępnych fluoroforów kanałów detekcji. Rzeczywiście, chociaż w prezentowanej tu pracy posługujemy się tylko dwoma markerami różnicowania, zdolność do standaryzacji kolonii i wyodrębniania "uśrednionych" wzorców umożliwia porównanie map rozmieszczenia z różnych zestawów kolonii w celu ujawnienia uogólnionych relacji przestrzennych markerów względem siebie.

Ponadto, mimo że skupiliśmy się tutaj na badaniu markerów różnicowania, metoda analizy może zostać rozszerzona o badanie innych procesów biologicznych, dla których dostępne są markery jądrowe. Na przykład mikrowzorzec linii komórkowej zawierającej wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji^{fluorescencji 35} (FUCCI) umożliwiłby zbadanie, w jaki sposób geometria na poziomie kolonii może wpływać na zdarzenia cyklu komórkowego w grupie.

Kierunki na przyszłość

Metoda ta jest podatna na średnioprzepustową analizę obrazów, jednak pozyskiwanie obrazów nie jest obecnie w pełni zautomatyzowane i może stać się ograniczeniem w przypadku bardzo dużych eksperymentów. Regularne rozmieszczenie kolonii powinno umożliwić stworzenie w pełni zautomatyzowanych procedur akwizycji, podobnych do tych, które zostały opracowane dla średniej liczby pojedynczych komórek²⁰. Jednak ze względu na to, że rozmiar pola wymagany do zobrazowania kolonii jest duży, co może wymagać mozaikowania, a także dlatego, że kolonie są trójwymiarowe, wysoce pożądane jest zmniejszenie zarówno rozmiaru zestawu danych, jak i czasu akwizycji poprzez obrazowanie tylko odpowiednich kolonii. W związku z tym w przyszłości możliwe jest podjęcie działań mających na celu opracowanie "inteligentnego" mikroskopu zdolnego do identyfikacji odpowiednich kolonii i dostosowania współrzędnych obrazowania do każdej próbki. Pozwoli to nie tylko skrócić czas i wysiłek, ale także zapobiec potencjalnym uprzedzeniom operatora.

Potoki analizy mogą być również bardziej wydajne dzięki zmniejszeniu liczby kroków, które użytkownik musi wykonać. Mamy w planach zbudowanie mechanizmu budowania potoków i zintegrowanie R bezpośrednio z naszym oprogramowaniem (zobacz także problemy pickcells-api#3 i pickcells-rjava#1 w narzędziu do śledzenia problemów w naszych repozytoriach kodu [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Pełna automatyzacja procedury analizy zmniejszy czas i wysiłek oraz ograniczy potencjalne błędy użytkowników.

Na koniec zauważamy, że nasza metoda analizy nie oddaje jeszcze w pełni dynamicznej natury wzorców komórkowych. Niektóre ograniczone informacje dynamiczne można wyodrębnić, badając szeregi czasowe obrazów^{migawkowych 8,10,36}. Jednak możliwość rejestrowania historii populacji komórek jest wysoce pożądana, jeśli chcemy lepiej zrozumieć, w jaki sposób pojawiają się wzorce. Jednym z ograniczeń jest to, że dokładne śledzenie pojedynczych komórek w gęstej populacji komórek 3D pozostaje bardzo trudnym zadaniem³⁷. Nasza metoda wykrywania komórek wykorzystuje otoczkę jądrową i działa szczególnie dobrze w przypadku gęstych i nakładających się na siebie populacji komórek²⁸. Żywe reportery otoczki jądrowej są łatwo dostępne^28,38, a jedną z zalet techniki mikromodelowania jest to, że można ją wykorzystać do zapobiegania przemieszczaniu się komórek poza pole widzenia podczas długotrwałego obrazowania. Ogólnie rzecz biorąc, jesteśmy przekonani, że zautomatyzowane śledzenie komórek będzie możliwe do osiągnięcia przy użyciu kombinacji niedawno opracowanych narzędzi 28,39,40 i że powinno to przynieść nowe informacje na temat podstawowych zasad samoorganizacji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Gibco	31350-010	uchwyt w dygestoriach
1 i razy; Mistrzowska kwarcowa antyrefleksyjna chromowa maska	fotograficzna Toppan Photomask	Niestandardowy projekt
24-dołkowe płytki	Corning	3526
4-dołkowe płytki	Nunclon Delta	176740
5% Surowica osła	Sigma	D9663
Przeciwjądrowy kompleks porów	Abcam	ab24609	Mysz monoklonalna, użyj 1:1000
Anti-Id1	Biocheck	37-2	Królik poliklonalny, stosować 1:200
Anti-Lamin B1	Abcam	ab16048	Poliklonalny królik, stosować 1:1000
Anti-Tbra	R& D	AF2085	Kozioł ployklonal, stosować 1:400
Roztwór blokujący	NA	NA	0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 5% Surowica dla osła 0,003% Azek sodu W PBS
CGR8 mESC	NA		Odniesienie: Mountford i wsp. PNAS, 1994
Roztwór utrwalający	NA	NA	4% PFA rozcieńczony w roztworze myjącym
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10270-106	muszą zostać przetestowane w celu zapewnienia zgodności z konserwacją ESC
Żelatyna	Sigma	G1890
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma	G5154
Film laboratoryjny	VWR	291-1212
Oprogramowanie do edytora układu	LayoutEditor	NA	https://layouteditor.com/
Edytor układu Oprogramowanie	Klayout	NA	https://www.klayout.de/
L-glutamina	Gibco	25030-024
LIF	Millipore	ESG1107
MEM NEAA	Gibco	11140-035
mESC Pożywka	hodowlana NA		GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-merkaptoetanol 1 razy; aminokwasy endogenne kwasy, 2 mM L-glutamina 1 mM pirogronian sodu
NH4Cl 50mM	Sigma	9718
Paraformaldehyd	Sigma	158127	UWAGA: Toksyczny, należy obchodzić się z nierozcieńczonymi substancjami w dygestoriach i nosić sprzęt ochronny
PBS (barwienie immunologiczne)	Sigma	P4417	Rozcieńczyć w 200 ml ddH2O
PBS (hodowla tkankowa)	Gibco	11140-035
Prowadnice plastikowe	Ibidi	IB-10813
Poloxamer 407	Sigma	P2443
ProLong Gold Antifade Mountant	Sondy molekularne	P36930
Azydek sodu	Sigma	8591	UWAGA: Toksyczny, uchwyt w dygestoriach i noszenie sprzętu ochronnego
Pirogronian sodu	Gibco	11360070
TritonX-100	Sigma	T8532
Trypsin	Gibco	25200056
UVO cleaner	Jetlight, USA	42-220	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s Zalecenia bezpieczeństwa
Roztwór myjący	NA	NA	0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 W PBS