Method Article

Budowa plazmidów CRISPR i wykrywanie skuteczności nokautu w komórkach ssaków za pomocą systemu Dual Luciferaza Reporterowa

DOI:

10.3791/59639

⸱

December 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący uproszczoną metodę efektywnego generowania plazmidów wyrażających zarówno enzym CRISPR, jak i związane z nim pojedyncze przewodnikowe RNA (sgRNA). Kotransfekcja komórek ssaków za pomocą tego wektora sgRNA/CRISPR i wektora reporterowego podwójnej lucyferazy, który bada naprawę pęknięć dwuniciowych, umożliwia ocenę skuteczności nokautu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż wysoce efektywna, modyfikacja miejsca genomowego przez enzym CRISPR wymaga wcześniejszego wygenerowania sgRNA unikalnego dla docelowego miejsca (miejsc). W pracy opisano kluczowe kroki prowadzące do budowy wydajnych wektorów sgRNA przy użyciu strategii, która pozwala na skuteczne wykrywanie dodatnich kolonii za pomocą PCR przed sekwencjonowaniem DNA. Ponieważ wydajna edycja genomu przy użyciu systemu CRISPR wymaga wysoce wydajnego sgRNA, konieczna jest wstępna selekcja potencjalnych celów sgRNA, aby zaoszczędzić czas i wysiłek. System podwójnej lucyferazy reporterowej został opracowany w celu oceny skuteczności nokautu poprzez badanie naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez wyżarzanie pojedynczej nici. Tutaj używamy tego systemu reporterowego, aby wybrać preferowany cel xCas9 / sgRNA z kandydatów na wektory sgRNA do określonej edycji genów. Przedstawiony protokół zapewni preferowany wektor enzymatyczny sgRNA/CRISPR w ciągu 10 dni (zaczynając od odpowiednio zaprojektowanych oligonukleotydów).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SgRNA CRISPR składają się z 20-nukleotydowej sekwencji (protospacer), która jest komplementarna do genomowej sekwencji docelowej1,2. Chociaż system CRISPR/Cas jest bardzo wydajny, zdolność systemu CRISPR/Cas do modyfikowania danego miejsca genomowego wymaga wygenerowania wektora przenoszącego wydajne sgRNA unikalne dla miejsca docelowego (miejsc docelowych)2. W tym artykule opisano kluczowe etapy generowania tego wektora sgRNA.

Dla udanej edycji genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas, kluczowym warunkiem wstępnym jest użycie wysoce wydajnych sgRNA3,4,5. Ponieważ zmodyfikowane nukleazy używane do edycji genomu wykazują różną wydajność w różnych docelowych loci1, wstępna selekcja potencjalnych celów sgRNA jest konieczna, aby zaoszczędzić czas i wysiłek6,7,8,9. System podwójnej lucyferazy reporterowej został opracowany w celu oceny skuteczności nokautu poprzez badanie naprawy pęknięć dwuniciowych za pomocą wyżarzania pojedynczej nici3,10. Tutaj używamy tego systemu reporterowego, aby wybrać preferowany cel CRISPR sgRNA spośród różnych potencjalnych wektorów sgRNA przeznaczonych do określonej edycji genów. Przedstawiony tutaj protokół był wdrażany w naszej grupie i współpracujących laboratoriach przez ostatnie kilka lat w celu generowania i oceny sgRNA CRISPR.

Poniższy protokół podsumowuje, jak zaprojektować odpowiednie sgRNA za pomocą oprogramowania sieciowego. Po wybraniu odpowiednich sgRNA opisujemy różne etapy uzyskiwania wymaganych oligonukleotydów, a także podejście do wprowadzania sparowanych oligonukleotydów do wektora ekspresyjnego pX330-xCas9. Przedstawiamy również metodę składania wektorów reporterowych z ekspresją sgRNA i podwójnej lucyferazy opartej na ligacji tych sekwencji do wstępnie strawionego wektora ekspresji (kroki 2-10, Rysunek 1A). Na koniec opisujemy, jak analizować skuteczność cięcia DNA dla każdego z sgRNA (kroki 11-12).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. projekt oligonukleotydu sgRNA

  1. Projektuj sgRNA za pomocą narzędzi online, takich jak narzędzie online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Sekwencja PAM jest ważna w oparciu o używany Cas9. W przypadku xCas9 odpowiednimi sekwencjami PAM są NG, a poprzednie narzędzie online Cas-Designer może generować sgRNA istotne dla xCas9.
    1. Korzystaj z narzędzi do projektowania sgRNA, które obejmują algorytmy przewidywania na i poza celem (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. Preferowany jest wynik 0,2 lub wyższy.
  2. Wybierz do 3 celów edycji genów w celu optymalnego badania przesiewowego (np. T1, T2 i T3 zostały zaprojektowane dla genu DKK2 eksonu 1 owiec [Tabela 1]).

2. Modyfikacja oligonukleotydów

  1. Aby zmodyfikować oligonukleotyd sgRNA, należy usunąć motyw sąsiadujący z protospacerem 3'-NG (PAM), zachowując sekwencję protospacer (np. sekwencję początkową dla T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
  2. Dodaj pentanukleotyd CACCG do końca 5' oligo.
    UWAGA: Po podwiązaniu do szkieletu pX330-xCas9, sekwencja ta będzie zawierać koniec 3' promotora U6 motywującego transkrypcję sgRNA. Tablica "CACC" gwarantuje, że oligo pasuje do zwisów plazmidu pX330-xCas9 trawionego przez BbsI. Zasada "G" jest warunkiem wstępnym promotorów polimerazy III RNA i gwarantuje skuteczne uruchomienie transkrypcji sgRNA (np. dołączenie macierzy 5'-CACCG do protospacery T1, osiągnięcie T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). Wydajność rozszczepienia 21 nt gRNA znacznie różni się od wydajności 20 nt gRNA1,12,13,14. Generalnie zaleca się stosowanie 20 nt z 5'-G poprzez wygenerowanie krótszego protospaceranta, jeśli nie jest to możliwe, można użyć 21 nt z dodatkowym 5'-G.
  3. Utwórz odwrotne dopełnienie (rc) sekwencji protospacer.
    UWAGA: Na przykład rc protospaceru T1 to GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
  4. Dołącz AAAC do końca 5' sekwencji protospacerowej rc. Dołącz dodatkowe C do końca 3' rc protospacer.
    UWAGA: Sekwencja "AAAC" zapewnia, że oligonukleotyd nadaje się do klonowania do trawionego przez BbsI plazmidu pX330-xCas9. Dodatkowe "C" na końcu 3' jest niezbędne do wyżarzania z inicjującym "G" dla opisanej powyżej transkrypcji sgRNA (np. AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] jest końcową sekwencją oligonukleotydową dla protospaceru T1 rc).
  5. Zamów oligonukleotydy.

3. Wyżarzanie oligonukleotydowe

  1. Rozcieńczyć liofilizowane oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 μM w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).
  2. Wymieszaj oligonukleotydy do przodu i do tyłu w cienkościennej probówce PCR, zachowując stosunek 1:1 (np. 20 μl każdy) bez dodawania dodatkowego buforu.
  3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie zmniejszać temperaturę do 72 °C przez 10 minut. Następnie następuje okres chłodzenia w temperaturze pokojowej (RT), polegający po prostu na wyjęciu próbki z maszyny do PCR i umieszczeniu jej w temperaturze RT.
    UWAGA: Nie jest konieczne fosforylowanie mieszanin oligonukleotydów w celu ułatwienia ligacji.

4. trawienie wektorowe sgRNA/CRISPR

  1. Trawić 1 μg wybranego wektora pX330-xCas9 za pomocą BbsI (10 jednostek enzymu na 1 μg plazmidu) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (Rysunek 2). Przeprowadzić trawienie wektora ekspresyjnego sgRNA pX330-xCas9 w całkowitej objętości 50 μl, zawierającej 5 μl 10-krotnego buforu wytrawiającego i wody destylowanej, aby osiągnąć ostateczną objętość.
  2. Oczyść strawiony wektor przez ekstrakcję pasmową z 2% żelu agarozowego poniżej 10 V/cm, a następnie oczyść za pomocą kolumny krzemionkowej przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.

5. Ligacja wyżarzonych oligonukleotydów sgRNA do wektora ekspresji

  1. Wymieszać wyżarzone oligonukleotydy sgRNA (5 μl mieszaniny z kroku 4) z trawionym przez BbsI wektorem pX330-xCas9 (oczyszczonym, 100 ng).
  2. Dodać 1 μl ligazy i 1 μl 10x buforu ligazy.
  3. Dodać wodę destylowaną o odpowiedniej objętości, do 10 μL.
  4. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

6. Właściwa transformacja komórek

  1. Wyjąć komórki E. coli DH5α z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.
  2. Dodać 5 μl mieszanki do podwiązania do 50 μl kompetentnej E. coli DH5α i trzymać mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
  3. Szok cieplny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s.
  4. Odstaw go na lodzie na 2 minuty.
  5. Odzyskać kulturę na wytrząsarce obrotowej w 500 μl pożywki LB przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  6. Umieścić 200 μl kultury na płytce z agarozą LB odpornej na ampicylinę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

7. Identyfikacja prawidłowych rekombinowanych plazmidów metodą PCR

  1. Wybierz od 5 do 10 kolonii bakteryjnych z płytki LB i użyj każdej z nich do zaszczepienia jednej 1,5 ml probówki zawierającej 1 ml pożywki LB z ampicyliną 60 mg/ml.
  2. Inkubować probówki na wytrząsarce obrotowej przez 2-3 godziny.
  3. Przeprowadzić detekcję prawidłowych rekombinowanych plazmidów przy użyciu specyficznych par starterów dla oligonukleotydów sgRNA [np. starter do przodu dla konstrukcji wektora ekspresji T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, starter odwrotny (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, wytwarzając amplikon 287 bp (Rysunek 3)].
    1. Przygotować mieszaninę do PCR (tabela 2).
    2. Stosować następujące warunki cykliczne PCR: 95 °C przez 5 minut w przypadku denaturacji wstępnej; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s w przypadku denaturacji, 60 °C przez 30 s w przypadku wyżarzania i 72 °C przez 30 s w przypadku przedłużenia. Po zakończeniu 30 cykli wykonać ostatni etap przedłużania, ogrzewając przez 5 minut w temperaturze 72 °C.
    3. Uruchom produkt PCR na 2% żelu agarozowym poniżej 10 V/cm. Pasma o odpowiedniej wielkości [np. 287 pz] jest uważana za pozytywną.

8. Sprawdź poprawność sekwencji plazmidu ekspresji sgRNA

  1. Sprawdź sekwencję kolonii dodatnich metodą PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera15 przy użyciu odwrotnego startera BbsI-R (patrz krok 7.3). Ten starter wyżarza się w miejscu za wkładem oligo sgRNA. Skonstruowano sekwencję pX330-xCas9-T1 z ekspresją sgRNA zawierającą protospacer TGCCTGCTCCTACTGGGGGCGG i xCas9.
  2. Użyj startera T1-F, aby zsekwencjonować dodatnie kolonie. Do przodu nie można było podać pełnych informacji o sekwencji dla miejsca otaczającego miejsce insercji oligonugokształtu sgRNA, ponieważ nie można było dokładnie odczytać fragmentu 30-50 pz następującego po starterze sekwencjonowania.

9. Budowa wektora reporterowego podwójnej lucyferazy

  1. Zsyntetyzuj fragmenty DNA o długości 300-500 pz zawierające cele sgRNA i sklonuj je do podwójnego wektora reporterowego lucyferazy poprzez podwójne trawienie [np. Subklonuj fragment eksonu DKK2 owiec o długości 440 pz do plazmidu pSSA-Dual16,17 przy użyciu podwójnego trawienia z AscI i SalI, w wyniku czego powstaje pSSA-Dual-DKK2].
  2. Zsyntetyzuj fragmenty DNA o długości 300-500 pz zawierające cele sgRNA. Należy pamiętać, że sekwencje fragmentów DNA muszą być częściami sekwencji genomowych, które można uzyskać ze strony internetowej NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub powiązanych odniesień.
  3. Wybierz odpowiedni wektor reporterowy podwójnej lucyferazy, taki jak pSSA-Dual16,17 (lub dwa wektory wyrażające odpowiednio lucyferazy świetlika i lucyferazy renilli), a następnie trawią ten wektor i fragmenty DNA wymienione powyżej za pomocą dwóch endonukleaz, takich jak AscI i SalI.
  4. Na koniec podwiązaj te dwa fragmenty za pomocą ligazy DNA T4, w wyniku czego powstaje pSSA-Dual-Target. Szczegółowe informacje dotyczące podwójnego trawienia i podwiązania przedstawiono odpowiednio w Tabeli 3 i Tabeli 4. Warto wspomnieć, że wektor reporterowy powinien być amplifikowany w stabilnych szczepach bakterii (takich jak Top10), które zaleca się hodować z mniejszą prędkością obrotową (zwykle nie większą niż 200 obr./min), w celu uniknięcia rekombinacji DNA.

10. Transfekcja komórek

  1. Wyodrębnij plazmidy wolne od endotoksyn dla wektorów wymienionych powyżej. Oceń czystość i stężenie plazmidów za pomocą odpowiednich instrumentów. Dla tych plazmidów zaleca się stężenie końcowe nie mniejsze niż 500 ng/μl i stosunek czystości 1,7-1,9 przy absorbancji 260/280 nm (A260/A280).
  2. Współtransfekować odpowiednią linię komórkową, taką jak PIEC18 z plazmidami w równych proporcjach (np. pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, plazmid 0,5 μg dla każdej duplikacji przy użyciu płytki 24-dołkowej). Użyj pustego wektora, takiego jak pX330-xCas9, jako kontroli ujemnej.
    1. Na dzień przed transfekcją umieścić komórki w 24-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 2 x 105 komórek/basenik. Komórki będą gotowe do transfekcji, gdy osiągną konfluencję 60-80%.
    2. Przed punktem czasowym transfekcji usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe i delikatnie dodać 0,5 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.
    3. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w pożywce DMEM w stosunku 1:25 i dobrze wymieszać.
    4. Przygotować wzorcową mieszaninę DNA, rozcieńczając 0,5 μg DNA w 25 μl pożywki DMEM, a następnie dodać 1 μl odczynnika P3000.
    5. Dodaj rozcieńczone DNA do każdej probówki rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (stosunek 1:1).
    6. Inkubować przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Dodaj 50 μl kompleksu DNA-lipid do komórek.
    8. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przeanalizuj transfekowane komórki, jak w kroku 11.

11. Wykrywanie podwójnej lucyferazy

  1. Przygotuj wystarczającą ilość 1x pasywnego buforu do lizy (PLB), dodając 1 objętość 5x PLB do 4 objętości wody destylowanej i dobrze wymieszaj.
  2. Bierna liza komórek hodowanych na 24-dołkowych płytkach hodowlanych.
    1. Usunąć pożywkę wzrostową z hodowanych komórek i delikatnie nałożyć wystarczającą ilość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby umyć powierzchnię naczynia hodowlanego. Krótko zamieszaj naczynie, aby usunąć oderwane komórki i resztki pożywki wzrostowej. Całkowicie usuń roztwór płuczący przed nałożeniem odczynnika PLB.
    2. Dozuj 100 μl 1x PLB do każdej studzienki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórkową. Pozostaw płytki hodowlane na 20 minut.
    3. Przenieść lizat do probówki lub fiolki w celu dalszego obchodzenia się lub przechowywania.
  3. Przygotować odczynnik do oznaczania lucyferazy (LAR) poprzez ponowne zawieszenie dostarczonego liofilizowanego substratu do oznaczania lucyferazy w 10 ml dostarczonego buforu do oznaczania lucyferazy.
  4. Przygotować odpowiednią objętość do wykonania żądanej liczby testów reporterowych podwójnej lucyferazy (100 μl odczynnika na test). Dodaj 1 objętość 50-krotnego substratu do 50 objętości buforu zatrzymującego w szklanej lub silikonowanej probówce polipropylenowej.
  5. Test reporterowy z podwójną lucyferazy (DLR)
    1. Zaprogramuj luminometry tak, aby zapewniały 2-sekundowe opóźnienie wstępnego odczytu, po którym następuje 10-sekundowy okres pomiaru.
    2. Wstępnie dozuj 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do odpowiedniej liczby probówek luminometru, aby ukończyć żądaną liczbę testów DLR.
    3. Ostrożnie przenieść do 20 μl lizatu komórkowego do probówki luminometru zawierającej LAR; wymieszać pipetując 2 lub 3 razy. Umieść rurkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
    4. Wyjąć probówkę z próbką z luminometru, dodać 100 μl odczynnika zatrzymującego i krótko odmieszać, aby wymieszać. Wymień próbkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
    5. Zapisz aktywność lucyferazy renilla znormalizowaną do aktywności lucyferazy świetlika, a mianowicie odwrotność stosunku wyświetlanego na ekranie.
    6. Wyrzuć probówkę reakcyjną i przejdź do następnego testu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane w tym protokole służą do budowy wektorów ekspresyjnych sgRNA i xCas9, a następnie do optymalizacji badań przesiewowych oligonukleotydów sgRNA o stosunkowo wyższej skuteczności celowania w geny. Tutaj wyświetlamy reprezentatywny przykład 3 celów sgRNA dla owiec DKK2 ekson 1. Wektory eksprymujące SgRNA i xCas9 można zbudować poprzez wstępne trawienie szkieletu wektora (Rysunek 2), a następnie ligowanie go w serii krótkich dwuniciowych fragmentów DNA przez wyżarzanie par oligo. Do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane przez nas procedury klonowania wektorów sgRNA ułatwiają wydajną produkcję sgRNA, przy czym większość kosztów wynika z porządkowania oligonukleotydów i sekwencjonowania wektorów. Podczas gdy opisana metoda została zaprojektowana, aby umożliwić użytkownikom generowanie sgRNA do użytku z CRISPR/Cas9, protokół można łatwo dostosować do użytku z ortologiami Cas9 lub innymi endonukleazami kierowanymi przez RNA, takimi jak Cpf1, wprowadzając drobne modyfikacje do szkieletu wektora i sekwencji zwisających oligonukleotydó...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany przez First Class Grassland Science Discipline Program of Shandong Province (Chiny), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Special Fund for Agro-Science Research in the Public Interest (201403071), National risk assessment major special project of milk product quality and safety (GJFP201800804) oraz Projects of Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nowa generacja pełnodotykowego gradientowego instrumentu PCRLongGeneA200Amplifikacja genu docelowego
Enzymy restrykcyjne AscINew England BiolabsR0558VCięcie wektorów docelowych
Enzym restrykcyjny BbsINew England BiolabsR0539SCięcie wektorów docelowych
Czysty stół warsztatowyAIRTECHSW-CJ-2FD/VS-1300L-UUrządzenie do częściowego oczyszczania w postaci pionowego przepływu laminarnego, które tworzy lokalne środowisko o wysokim poziomie czystości powietrza
DH5α Kompetentne komórkiTaKaRaK613Transformacja wektora plazmidowego
System testów reporterowych Dual-LucyferasPromegaE1910Test reporterowy z podwójnymi lucyferami
Elektryczna termostatyczna łaźnia wodnaSanfa Scientific InstrumentsDK-S24Odczynnik grzewczy o stałej temperaturze w łaźni wodnej
ElektroforezaBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6CNapięcie sterujące, prąd itp.
Eppendorf Reference 2Eppendorf Chiny Sp. z o.o.Odniesienie 2Dokładnie narysuj i przenieś ślady analizatora obrazowania płynnego
żeluBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.WD-9413BDo analizy obrazów żelu do elektroforezy
Luminometr GloMax 20/20PromegaE5311Wykrywanie podwójnej aktywności lucyferazy
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkościBMHsigma 3K15Ekstrakcja i oczyszczanie kwasów nukleinowych
Inteligentny inkubator biochemicznySanfa Scientific InstrumentsSHP-160Zapewnij odpowiednie środowisko temperaturowe do eksperymentu z trawieniem enzymatycznym
LB Broth AgarSangon BiotechA507003-0250Do hodowli E.coli
Lipofectamine 3000 Zestaw odczynników do transfekcjiThermo FisherL3000015Transfekcja DNA
Enzymy restrykcyjne SalINew England BiolabsR3138VCięcie wektorów docelowych
Żel DNA w kolumnie SanPrep Zestaw do ekstrakcjiSangon BiotechB518131-0050Recykling fragmentów DNA
SanPrep Kolumna Plasmid Mini-Preps KitSangon BiotechB518191-0100Ekstrakcja plazmidu DNA
Ligaza DNAT4 New England BiolabsM0202VLink Fragment DNA
TaKaRa MiniBEST Zestaw do oczyszczania fragmentów DNA Ver.4.0TaKaRa9761Oczyszczanie DNA
Pionowy ciśnieniowy sterylizator parowyJIBIMEDLS-50LDWysoka temperatura i autoklaw do zabijania bakterii, grzybów i innych mikroorganizmów w sprzęcie laboratoryjnym
Termostat do kąpieli wodnejChangzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.SHZ-82Niech bakterie nadal się trzęsą, co jest dobre w kontakcie z powietrzem.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  3. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  4. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  5. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  6. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  7. Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
  8. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  9. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  10. Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646(2010).
  11. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  12. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).
  13. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  14. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  15. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  16. Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253(2015).
  17. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , 201210509946.1 (2012).
  18. Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
  19. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , 201510398717.0 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR PlasmidssgRNA ConstructionDual Luciferase ReporterKnockout EfficiencyMammalian CellsxCas9 VectorBbs1 DigestionColony PCR ScreeningLuciferase AssayT7EI Assay

Related Articles