Artykuł metodologiczny

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

DOI:

10.3791/59658

⸱

20 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technologii sekwencjonowania sprawiły, że zestawy danych całego genomu i całego egzomu stały się bardziej dostępne zarówno dla diagnozy klinicznej, jak i najnowocześniejszych badań nad genetyką człowieka. Chociaż opracowano szereg algorytmów in silico w celu przewidywania patogenności wariantów zidentyfikowanych w tych zestawach danych, badania funkcjonalne mają kluczowe znaczenie dla określenia, w jaki sposób określone warianty genomowe wpływają na funkcję białek, zwłaszcza w przypadku wariantów missense. W Sieci Chorób Niezdiagnozowanych (UDN) i innych konsorcjach badawczych zajmujących się chorobami rzadkimi, organizmy modelowe (MO), w tym Drosophila, C. elegans, danio pręgowany i myszy, są aktywnie wykorzystywane do oceny funkcji przypuszczalnych wariantów powodujących chorobę u ludzi. Protokół ten opisuje metodę oceny funkcjonalnej rzadkich wariantów ludzkich stosowaną w Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych Drosophila Core UDN. Przepływ pracy rozpoczyna się od zebrania informacji o ludziach i MO z wielu publicznych baz danych, wykorzystania zasobów internetowych MARRVEL do oceny, czy wariant może przyczynić się do stanu pacjenta, a także do zaprojektowania skutecznych eksperymentów w oparciu o dostępną wiedzę i zasoby. Następnie generowane są narzędzia genetyczne (np. linie T2A-GAL4 i UAS-ludzkie cDNA) do oceny funkcji interesujących wariantów u Drosophila. Po opracowaniu tych odczynników można przeprowadzić dwutorowe testy funkcjonalne oparte na eksperymentach ratunkowych i nadekspresji w celu oceny funkcji wariantu. W gałęzi ratowniczej endogenne geny much są "humanizowane" poprzez zastąpienie ortologicznego genu Drosophila referencyjnymi lub wariantowymi ludzkimi transgenami. W gałęzi nadekspresji białka referencyjne i wariantowe ludzkie są egzogennie napędzane w różnych tkankach. W obu przypadkach każdy możliwy do oceny fenotyp (np. śmiertelność, morfologia oka, elektrofizjologia) może być użyty jako odczyt, niezależnie od choroby będącej przedmiotem zainteresowania. Różnice zaobserwowane między allelami referencyjnymi i wariantowymi sugerują efekt specyficzny dla wariantu, a tym samym prawdopodobną chorobotwórczości. Protokół ten umożliwia szybką ocenę in vivo przypuszczalnych wariantów genów powodujących chorobę u ludzi o znanych i nieznanych funkcjach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pacjenci z rzadkimi chorobami często przechodzą żmudną podróż zwaną "odyseją diagnostyczną", aby uzyskać dokładną diagnozę1. Uważa się, że większość chorób rzadkich ma silne podłoże genetyczne, co sprawia, że analizy genetyczne/genomiczne są krytycznymi elementami badań klinicznych. Oprócz sekwencjonowania panelu genów kandydujących i analizy zmienności liczby kopii w oparciu o mikromacierze chromosomowe, technologie sekwencjonowania całego eksomu (WES) i całego genomu (WGS) stały się w ciągu ostatniej dekady coraz cenniejszymi narzędziami2,3. Obecnie wskaźnik diagnostyczny identyfikacji znanego wariantu patogennego w WES i WGS wynosi ~25% (wyższy w przypadkach pediatrycznych)4,5. W większości przypadków, które pozostają niezdiagnozowane po klinicznym WES/WGS, częstym problemem jest to, że istnieje wiele genów kandydujących i wariantów. Sekwencjonowanie nowej generacji często identyfikuje nowe lub ultrarzadkie warianty wielu genów, a interpretacja, czy te warianty przyczyniają się do fenotypów choroby, jest wyzwaniem. Na przykład, chociaż uważa się, że większość nonsensownych lub przesuniętych mutacji w genach to allele utraty funkcji (LOF) z powodu rozpadu kodowanego transkryptu, mutacje skracające znalezione w ostatnich eksonach unikają tego procesu i mogą funkcjonować jako allele łagodne lub allele wzmocnienia funkcji (GOF)6.

Ponadto, przewidywanie skutków allelu missense jest trudnym zadaniem, ponieważ może prowadzić do wielu różnych scenariuszy genetycznych, jak po raz pierwszy opisane przez Hermana Mullera w latach 30. (tj. amorf, hipomorf, hipermorf, antymorf, neomorf lub izomorf)7. Opracowano liczne programy i metodologie in silico w celu przewidywania patogenności wariantów missense w oparciu o zachowanie ewolucyjne, rodzaj zmiany aminokwasów, pozycję w domenie funkcjonalnej, częstość alleli w populacji ogólnej i inne parametry8. Programy te nie są jednak kompleksowym rozwiązaniem skomplikowanego problemu interpretacji wariantów. Co ciekawe, niedawne badanie wykazało, że pięć szeroko stosowanych algorytmów przewidywania patogenności wariantów (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) zgadzają się co do patogenności ~80% czasu8. Warto zauważyć, że nawet jeśli wszystkie algorytmy są zgodne, zwracają nieprawidłową prognozę chorobotwórczości w 11% przypadków. Prowadzi to nie tylko do błędnej interpretacji klinicznej, ale także może zniechęcić badaczy do śledzenia nowych wariantów poprzez fałszywe umieszczanie ich jako łagodnych. Jednym ze sposobów uzupełnienia obecnych ograniczeń modelowania in silico jest dostarczenie danych eksperymentalnych, które pokazują wpływ funkcji wariantowej in vitro, ex vivo (np. hodowane komórki, organoidy) lub in vivo.

Badania funkcjonalne in vivo wariantów związanych z rzadkimi chorobami w MO mają unikalne mocne strony13 i zostały przyjęte przez wiele inicjatyw badawczych dotyczących chorób rzadkich na całym świecie, w tym Sieć Chorób Niezdiagnozowanych (UDN) w Stanach Zjednoczonych oraz Sieci Modeli i Mechanizmów Chorób Rzadkich (RDMM) w Kanadzie, Japonii, Europie i Australii14. Oprócz tych skoordynowanych wysiłków mających na celu włączenie badaczy MO do procesu diagnozowania chorób rzadkich i badań mechanistycznych na skalę krajową, szereg indywidualnych badań zespołowych między badaczami klinicznymi i MO doprowadziło do odkrycia i scharakteryzowania wielu nowych genów i wariantów powodujących choroby u ludzi82,83,84.

W UDN, scentralizowane Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych (MOSC) otrzymuje zgłoszenia genów i wariantów kandydujących wraz z opisem stanu pacjenta i ocenia, czy wariant może być patogenny, korzystając z narzędzi informatycznych i eksperymentów in vivo. W fazie I (2015-2018) UDN MOSC składał się z Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] i Zebrafish Core (University of Oregon), które współpracowały w celu oceny przypadków. Wykorzystując analizę informatyczną i szereg różnych strategii eksperymentalnych u Drosophila i danio pręgowanego, MOSC przyczyniło się do tej pory do diagnozy 132 pacjentów, identyfikacji 31 nowych syndromów55, odkrycia kilku nowych genów chorób ludzkich (np. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) i fenotypowa ekspansja znanych genów chorobowych (np. CACNA1A21, ACOX122).

Oprócz projektów w ramach UDN, badacze MOSC Drosophila Core przyczynili się do odkrycia nowych genów chorobowych we współpracy z Centers for Mendlian Genomics i innymi inicjatywami (np. ANKLE223, TM2D324, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) przy użyciu tego samego zestawu strategii informatycznych i genetycznych opracowanych dla UDN. Biorąc pod uwagę znaczenie badań MO dotyczących diagnozowania chorób rzadkich, MOSC został rozszerzony o rdzeń C. elegans i drugi rdzeń danio pręgowanego (oba na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis) dla fazy II (2018-2022) UDN.

Ten manuskrypt opisuje protokół badania funkcjonalnego in vivo, który jest aktywnie wykorzystywany w UDN MOSC Drosophila Core do określenia, czy warianty missense mają funkcjonalne konsekwencje dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu transgenicznych muszek, które wyrażają ludzkie białka. Celem tego protokołu jest pomoc badaczom MO we współpracy z klinicznymi grupami badawczymi w celu dostarczenia eksperymentalnych dowodów na to, że wariant kandydujący w genie będącym przedmiotem zainteresowania ma konsekwencje funkcjonalne, ułatwiając w ten sposób diagnozę kliniczną. Protokół ten jest najbardziej przydatny w scenariuszu, w którym badacz Drosophila kontaktuje się z badaczem klinicznym, który ma pacjenta z rzadką chorobą z określonym wariantem kandydującym w genie będącym przedmiotem zainteresowania.

Ten protokół można podzielić na trzy elementy: (1) zbieranie informacji w celu oceny prawdopodobieństwa, że interesujący wariant jest odpowiedzialny za fenotyp pacjenta i wykonalność badania funkcjonalnego na Drosophila, (2) gromadzenie istniejących narzędzi genetycznych i ustalanie nowych, oraz (3) przeprowadzanie badań funkcjonalnych in vivo. Trzeci element można dalej podzielić na dwa podelementy w zależności od tego, jak można ocenić funkcję wariantu będącego przedmiotem zainteresowania (eksperyment ratunkowy lub strategie oparte na nadekspresji). Ważne jest, aby pamiętać, że protokół ten może być dostosowany i zoptymalizowany do wielu scenariuszy poza badaniami nad rzadkimi chorobami monogenowymi (np. powszechne choroby, interakcje gen-środowisko oraz farmakologiczne/genetyczne badania przesiewowe w celu identyfikacji celów terapeutycznych). Możliwość określenia funkcjonalności i patogenności wariantów nie tylko przyniesie korzyści pacjentowi, który jest przedmiotem zainteresowania, zapewniając dokładną diagnozę molekularną, ale będzie miała również szerszy wpływ zarówno na translacyjne, jak i podstawowe badania naukowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie informacji o ludziach i MO do oceny: prawdopodobieństwo tego, że interesujący wariant jest odpowiedzialny za fenotypy choroby i wykonalność badań funkcjonalnych u Drosophila

  1. Przeprowadź szeroko zakrojone przeszukiwanie baz danych i literatury, aby ustalić, czy konkretne geny i warianty będące przedmiotem zainteresowania są dobrymi kandydatami do wyjaśnienia fenotypu pacjenta będącego przedmiotem zainteresowania. W szczególności zbierz następujące informacje.
    1. Oceń, czy gen będący przedmiotem zainteresowania był wcześniej związany z innymi zaburzeniami genetycznymi (ekspansja fenotypowa genu znanej choroby), czy też jest to zupełnie nowy gen kandydujący na chorobę [wariant genu o niepewnym znaczeniu (GVUS)].
    2. Oceń częstość występowania alleli wariantu będącego przedmiotem zainteresowania w bazach danych choroby lub populacji kontrolnej.
    3. Oceń, czy istnieją warianty liczby kopii (CNV), które zawierają ten gen w bazach danych choroby lub populacji kontrolnej.
    4. Oceń, jakie są geny ortologiczne u różnych gatunków MO, w tym myszy, danio pręgowanego, Drosophila, C. elegans i drożdży, a następnie kontynuuj badania znanych funkcji i wzorców ekspresji tych ortologicznych genów.
    5. Oceń, czy wariant będący przedmiotem zainteresowania jest obecny w funkcjonalnej domenie białka i czy interesujący go aminokwas jest ewolucyjnie konserwatywny.
      UWAGA: Odpowiedzi na te pięć pytań (kroki 1.1.1-1.1.5) można uzyskać, uzyskując dostęp do wielu baz danych użytkowników i MO indywidualnie lub korzystając z zasobu internetowego MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (patrz Tabela 1 dla zasobów online)30, który jest szczegółowo opisany w dołączonym artykule31. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z konkretnymi przykładami. Przydatne informacje można znaleźć również na stronie internetowej Monarch Initiative32 i Gene2Function33.
  2. Zbierz dodatkowe informacje, aby dokładniej ocenić, czy wariant jest dobrym kandydatem na chorobę z punktu widzenia funkcji i struktury białka.
    1. Oceń, czy przewiduje się, że wariant będący przedmiotem zainteresowania będzie szkodliwy na podstawie algorytmów przewidywania in silico.
      UWAGA: Algorytmy patogeniczności wariantów zostały opracowane przez wiele grup badawczych w ciągu ostatnich ~15 lat, a niektóre z nich są również wyświetlane w wynikach wyszukiwania MARRVEL. Nowsze programy, w tym dwa wymienione poniżej, łączą algorytmy redykcji patogenności wielu wariantów i podejścia uczenia maszynowego w celu wygenerowania oceny patogenności. Aby uzyskać więcej informacji na temat algorytmów przewidywania wariantów i ich wydajności, zapoznaj się z Ghosh, et al.8. (i) CADD (combined annotation-dependent depletion): integracyjne narzędzie do adnotacji zbudowane z ponad 60 cech genomowych, które zapewnia wyniki dla ludzkich SNV, a także krótkich insercji i delecji11. (ii) REVEL (rare exome variant ensemble learner): łączy algorytmy patogeniczności wielu wariantów (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP i phastCons), aby zapewnić zintegrowany wynik dla wszystkich możliwych wariantów ludzkiego błędnego sensu34.
    2. Określ, czy wykazano, że ludzki gen/białko będące przedmiotem zainteresowania lub jego ortologi MO wchodzą w genetyczną lub fizyczną interakcję z genami/białkami wcześniej powiązanymi z chorobami genetycznymi. Jeśli tak, oceń, czy pacjent będący przedmiotem zainteresowania wykazuje pokrywające się fenotypy z tymi zaburzeniami.
      UWAGA: Opracowano kilka narzędzi do analizy interakcji genetycznych i białko-białko w oparciu o publikacje MO, a także proteomikę na dużą skalę z badań przesiewowych wielu gatunków. STRING (narzędzie do wyszukiwania powtarzających się wystąpień sąsiednich genów)35: baza danych dla znanych i przewidywanych interakcji białko-białko. Integruje zestawy danych dotyczących interakcji genetycznych i koekspresji, a także narzędzia do eksploracji tekstu w celu identyfikacji genów i białek, które mogą funkcjonować razem w różnych organizmach. MIST (narzędzie do wyszukiwania interakcji molekularnych)36: baza danych, która integruje dane genetyczne i interakcje białko-białko z podstawowych genetycznych MO (drożdże, C. elegans, Drosophila, danio pręgowany, żaba, szczur, mysz) i ludzi. Wyświetlane są również przewidywania interakcji wywnioskowanych z ortologicznych genów/białek (interlogów).
    3. Określ, czy struktura 3D białka będącego przedmiotem zainteresowania została rozwiązana lub wymodelowana. Jeśli tak, określ, gdzie wariant zainteresowania jest mapowany względem kluczowych domen funkcjonalnych.
      UWAGA: Struktury białkowe rozwiązane za pomocą krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i mikroskopii krioelektronowej można znaleźć w publicznych bazach danych, w tym PDB (bank danych o białkach) i EMDatabank37. Chociaż nie ma jednej bazy danych dla przewidywanych/modelowanych struktur białkowych, użytkownicy mają do dyspozycji szereg algorytmów (np. SWISS-MODEL38, Modeller39 i Phyre240) do modelowania białek.
  3. Komunikuj się ze współpracownikami klinicznymi w celu omówienia informacji zebranych z analiz informatycznych w sekcjach 1.1-1.2. Jeśli współpracownicy kliniczni również uważają, że wariant i gen będący przedmiotem zainteresowania są dobrymi kandydatami do wyjaśnienia fenotypów obserwowanych u pacjenta, przejdź do sekcji 2. Jeśli pojawią się konkretne pytania dotyczące genotypu i fenotypu pacjenta, omów je ze współpracownikami klinicznymi przed podjęciem dalszych kroków.
    UWAGA: Jeśli uważa się, że wariant będący przedmiotem zainteresowania prawdopodobnie nie wyjaśni fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania (np. identyczny wariant występujący z dużą częstością w populacji kontrolnej), należy omówić to ze współpracownikami klinicznymi, aby ustalić, czy wariant jest dobrym kandydatem, ponieważ może nie być odpowiedniej wiedzy specjalistycznej do interpretacji fenotypów klinicznych.

2. Gromadzenie istniejących narzędzi genetycznych i tworzenie nowych odczynników do badania konkretnego wariantu zainteresowania

UWAGA: Po ustaleniu interesującego wariantu dobrym kandydatem do przeprowadzenia eksperymentalnego zbierz lub wygeneruj odczynniki do przeprowadzenia badań funkcjonalnych in vivo. Do badań funkcjonalnych opisanych w tym protokole potrzebne są niektóre kluczowe odczynniki Drosophila melanogaster: 1) transgeniczne szczepy cDNA regulowane sekwencją aktywacji przed sekwencją, które przenoszą sekwencję referencyjną lub wariantową, 2) allel utraty funkcji interesującego genu muchy oraz 3) linia GAL4, którą można wykorzystać do eksperymentów ratunkowych.

  1. Generowanie konstruktów cDNA UAS i ludzi oraz muchy transgeniczne
    1. Zidentyfikuj i uzyskaj odpowiednie ludzkie konstrukty cDNA. Wiele klonów jest dostępnych w MGC (kolekcja genów ssaków)43 i można je kupić u wybranych sprzedawców. W przypadku genów, które są alternatywnie splicingowane, sprawdź, która izoforma cDNA odpowiada użyciu Ensembl lub RefSeq.
      UWAGA: Wiele cDNA jest dostępnych w odczynnikach kompatybilnych z systemem klonowania za pośrednictwem rekombinazy44, co upraszcza etap subklonowania. cDNA mogą występować w formacie "otwarty (bez kodonu stop)" lub "zamknięty (z endogennym lub sztucznym kodonem stop)". Podczas gdy otwarte klony umożliwiają znakowanie C 'białek, które są przydatne w testach biochemicznych (np. Western blot) i biologicznych komórek (np. barwienie immunologiczne) w celu monitorowania ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, w niektórych przypadkach może to zakłócać funkcję białka.
    2. Subklonuj referencyjne i wariantowe cDNA do wektora transgenicznego Drosophila. Użyj systemu transgenezy, w którym pośredniczy φC31, ponieważ pozwala to na integrację referencyjnych i wariantowych cDNA w tym samym miejscu w genomie45. W tym projekcie MOSC Drosophila Core rutynowo korzysta z pGW-HA.attB vector46.
      UWAGA: Jeśli ludzkie cDNA znajduje się w wektorach kompatybilnych z systemem klonowania za pośrednictwem rekombinazy (np. pDONR221, pENTR221), przejdź do sekcji 2.1.4, która wyjaśnia reakcje LR polegające na subklonacji cDNA do pGW-HA.attB.
      1. Jeśli ludzkie cDNA nie znajduje się w plazmidzie zgodnym z systemem klonowania za pośrednictwem rekombinazy, należy sklonować ludzkie cDNA do wektora wejściowego Gateway przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej (przykład takiego protokołu jest udokumentowany poniżej).
        1. Wykonaj PCR z przewieszeniem, aby wprowadzić ramiona attB1 i attB2. Starter do przodu powinien mieć sekwencję attB1 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3', po której następują pierwsze 22 nukleotydy docelowego cDNA. Odwrotny starter powinien mieć sekwencję attB2 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3', po której następuje odwrotny dopełniacz ostatnich 25 nukleotydów interesującego nas cDNA. Wyklucz kodon stop cDNA, a następnie dodaj znacznik C', jeśli chcesz "otworzyć" klon, lub dodaj kodon stop, aby "zamknąć" klon.
        2. Przygotować 100 μl mieszaniny PCR o wysokiej wierności, składającej się z 50 μl głównej mieszanki PCR o wysokiej wierności, 36 μl wody destylowanej, 5 μl każdego startera do przodu i do tyłu wymienionego w kroku 2.1.2.1.1 rozcieńczonego do 10 μM i 4 μl docelowego cDNA (150 ng/μL).
        3. Wykonaj PCR przy użyciu standardowego protokołu mutagenezy, aby dodać ramiona attB1 i attB2 do interesującego cDNA. Warunki będą się różnić w zależności od konstrukcji i wariantów będących przedmiotem zainteresowania.
        4. Wyizoluj docelowe cDNA z dodanymi ramionami homologicznymi za pomocą elektroforezy żelowej i ekstrakcji żelu. Stwórz 1% żel agarozowy i wykonaj elektroforezę standardowymi metodami. Wytnij prążek, który odpowiada rozmiarowi cDNA oraz dodatkową długość ramion homologii. Wyekstrahuj DNA z żelu za pomocą standardowych metod95. Komercyjne zestawy do ekstrakcji żelu są dostępne w kilku firmach.
        5. Przeprowadź reakcję rekombinazy in vitro w oparciu o protokół klonowania za pośrednictwem rekombinazy, zgodnie z używanym systemem.
        6. Przekształć mieszaninę reakcyjną BP w chemicznie kompetentne komórki E. coli. Kompetentne ogniwa mogą być wykonane we własnym zakresie lub zakupione od komercyjnych dostawców. Hodować przekształcone komórki przez noc na płytce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki do selekcji kolonii. Następnego dnia wybierz kilka rodzin i hoduj je w niezależnych płynnych kulturach przez noc.
        7. Wyizoluj DNA z nocnych kultur za pomocą miniprepu. Sanger sekwencjonuje dodatnie klony, aby upewnić się, że cDNA ma prawidłową sekwencję96. Komórki z kultur, które są dodatnie dla pożądanej sekwencji, należy utrzymywać w 25% glicerolu przechowywanym w temperaturze -80 °C.
    3. Przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, aby wprowadzić interesujący wariant do plazmidu Gateway z odniesieniem do ludzkiego cDNA97. Szczegółowy protokół dla tej metody można znaleźć na stronie internetowej dostawcy48,49. Zweryfikuj obecność wariantu w zmutowanym plazmidzie za pomocą sekwencjonowania Sangera całej otwartej ramki odczytu (ORF), aby upewnić się, że nie ma żadnych dodatkowych wariantów wprowadzonych na tym etapie mutagenezy.
    4. Subklonować referencyjne i wariantowe ludzkie cDNA w plazmidzie dawcy (plazmidy bramkowe z miejscami attL1 i attL2) do plazmidu transgenicznego (np. pGW-HA.attB z miejscami attR1 i attR2) poprzez reakcję klonazy LR.
      UWAGA: Istnieją wektory UAS φC31 przeznaczone do konwencjonalnego subklonowania opartego na enzymach restrykcyjnych (np. pUAST.attB50), jeśli preferowane jest subklonowanie ludzkich cDNA za pomocą metod enzymów restrykcyjnych.
    5. Wybierz miejsca dokowania φC31, w których chcesz zintegrować transgeny cDNA UAS-człowieka. Kilka miejsc dokowania zostało wygenerowanych przez kilka laboratoriów i jest publicznie dostępnych w centrach magazynowych50,52,53.
      UWAGA: Ponieważ wygodnie jest umieścić ludzki transgen na chromosomie, który nie zawiera ortologa muchy genu będącego przedmiotem zainteresowania, zaleca się użycie drugiego miejsca dokowania chromosomu [VK37 (BDSC stock #24872], gdy ortolog muchy znajduje się na chromosomie X, trzecim lub czwartym, i użycie trzeciego miejsca dokowania chromosomu [VK33 (BDSC stock #24871], gdy ortolog muchy znajduje się na drugim chromosomie.
    6. Wstrzyknąć UAS-ludzkie konstrukty cDNA muszkom eksprymującym integrazę φC31 w swojej linii zarodkowej (np. vas-φC31, nos-φC31).
      UWAGA: Mikroiniekcja może być wykonywana we własnym zakresie lub wysyłana do głównych placówek lub podmiotów komercyjnych w celu transgenezy. Szczegółowy protokół generowania much transgenicznych można znaleźć w cytowanym rozdziale książki51.
    7. Ustalić stabilne szczepy transgeniczne z wstrzykniętych zarodków. Wstrzyknij ~100-200 zarodków na konstrukt94. Reprezentatywny schemat krzyżowania dla insercji transgenu do drugiego miejsca dokowania chromosomu (VK37) jest przedstawiony w Rysunek 1A. Zapoznaj się z cytowanymi książkami54,55 aby uzyskać podstawowe informacje o genetyce Drosophila.
  2. Uzyskaj lub wygeneruj linię T2A-GAL4, która ułatwia testy funkcjonalne oparte na ratownictwie (patrz Rysunek 2 i sekcja 3.1).
    UWAGA: Ta linia będzie służyć dwóm celom. Po pierwsze, większość badanych linii T2A-GAL4 zachowuje się jak silne allele LUM, działając jako allel pułapki genowej. Po drugie, linie T2A-GAL4 funkcjonują jako sterownik GAL4, który umożliwia ekspresję konstruktów UAS (np. UAS-GFP, UAS-human cDNAs) pod endogennymi elementami regulacyjnymi genu będącego przedmiotem zainteresowania56,57 (Rysunek 2A-C).
    1. Przeszukaj publiczne kolekcje papierów wartościowych pod kątem dostępnych linii T2A-GAL4, w tym Drosophila Gene Disruption Project (GDP)58, w których wygenerowano ~1,000 linii T2A-GAL459. Szczepy te są obecnie dostępne w Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) i można je przeszukiwać zarówno na stronach internetowych GDP, jak i BDSC.
    2. Jeśli linia T2A-GAL4 dla interesującego nas genu muchy nie jest dostępna, sprawdź, czy dostępna jest odpowiednia kodująca linia introniczna MiMIC (kaseta integracyjna za pośrednictwem Minos) do konwersji na linię T2A-GAL4 przy użyciu wymiany kasety za pośrednictwem rekombinazy (RMCE)60 (Rysunek 2A).
      UWAGA: RMCE umożliwia przekształcenie elementów intronowych MiMIC, które znajdują się pomiędzy dwoma eksonami kodującymi, w linię T2A-GAL4 poprzez mikroiniekcję konstruktu dawcy (przykład schematu krzyżowania jest pokazany w Rysunek 1B) lub serii krzyżówek, jak opisano szczegółowo57,59.
    3. Jeśli linia T2A-GAL4 nie jest dostępna, a odpowiedni kodujący introniczny MiMIC nie istnieje, zbadaj możliwość wygenerowania linii T2A-GAL4 za pomocą systemu CRIMIC (kaseta integracyjna za pośrednictwem CRISPR)59.
      UWAGA: Metodologia ta wykorzystuje rozszczepienie DNA za pośrednictwem CRISPR i naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) w celu zintegrowania kasety podobnej do MiMIC z intronem kodującym w genie będącym przedmiotem zainteresowania.
    4. Jeśli interesujący gen nie ma dużego intronu (>150 pz) lub nie ma intronów, spróbuj wprowadzić transgen GAL4 do genu muchy za pomocą systemu CRISPR/Cas9 przy użyciu HDR zgodnie z opisem20,61,62.
      >UWAGA: Jeśli generowanie allelu knock-in T2A-GAL4 lub GAL4 jest trudne, spróbuj przeprowadzić eksperymenty ratunkowe przy użyciu tych wcześniej istniejących alleli lub linii RNAi oraz wszechobecnych lub specyficznych tkankowo sterowników GAL4 zgodnie z opisem92 (REF).

3. Przeprowadzanie analizy funkcjonalnej interesującego człowieka wariantu in vivo u Drosophila

UWAGA: Przeprowadź analizę opartą na ratowaniu (sekcja 3.1) oraz badania nadekspresji (sekcja 3.2) za pomocą narzędzi zebranych lub wygenerowanych w sekcji 2, aby ocenić konsekwencje interesującego wariantu in vivo u Drosophila. Rozważ użycie obu podejść, ponieważ są one komplementarne.

  1. Przeprowadzanie analizy funkcjonalnej za pomocą eksperymentów opartych na ratownictwie
    UWAGA: Heterologiczne eksperymenty ratunkowe u Drosophila z wykorzystaniem ludzkich białek określają, czy funkcja molekularna dwóch ortologicznych genów została zachowana przez ~ 500 milionów lat ewolucji. Oceniają również funkcję wariantu w kontekście ludzkiego białka63. Chociaż nie doniesiono o systematycznej analizie setek par genów, kilkadziesiąt genów ludzi i ssaków (np. myszy) jest w stanie zastąpić funkcję genów Drosophila13.
    1. W podejściu opartym na ratownictwie należy najpierw ustalić, czy w mutantach LOF w ortologu muchy występują oczywiste, możliwe do odtworzenia i powtarzalne fenotypy, zanim ocenisz funkcje wariantów.
      UWAGA: Wcześniejsza literatura na temat genu muchy jest dobrym miejscem do eksploracji danych w pierwszej kolejności i można ją znaleźć za pomocą baz danych, w tym FlyBase i PubMed. Dodatkowe bazy danych, takie jak MARRVEL, Monarch Initiative i Gene2Funcion są również przydatne w gromadzeniu tych informacji.
    2. Przeprowadzenie globalnego badania fenotypów podatnych na stwierdzenie u homozygoty i hemizygotyki (allel T2A-GAL4 nad molekularnie zdefiniowanymi zwierzętami z niedoborem chromosomów, zwłaszcza jeśli allel T2A-GAL4 jest pierwszą mutacją, która zostanie scharakteryzowana dla określonego genu. Oceń fenotypy, takie jak śmiertelność, bezpłodność, długowieczność, morfologia (np. wielkość i morfologia oka) i zachowanie (np. zaloty, lot, wspinaczka i wady wrażliwości na huk).
      UWAGA: Jeśli nie ma głównych fenotypów zidentyfikowanych na podstawie tego pierwotnego badania, można użyć bardziej subtelnych fenotypów, takich jak wady neurologiczne mierzone za pomocą zapisów elektrofizjologicznych, jeśli są one wysoce powtarzalne i specyficzne. Na przykład badania czynnościowe z wykorzystaniem elektroretinogramu (ERG) opisano w kroku 3.2.3. Jeśli nie wykryjesz żadnego możliwego do wykrycia fenotypu, przejdź do sekcji 3.2 i przeprowadź badanie funkcjonalne oparte na nadekspresji.
    3. Po zidentyfikowaniu możliwego do zidentyfikowania fenotypu w mutancie LOF muchy, sprawdź, czy referencyjne ludzkie cDNA może zastąpić funkcję ortologa muchy, próbując użyć ludzkiego cDNA do uratowania zmutowanej linii much. Test fenotypowy, który należy tutaj przeprowadzić, zależy od wyników z kroku 3.1.2 i będzie specyficzny dla badanego genu.
      UWAGA: Jeśli "humanizacja" genu muchy zakończy się sukcesem, istnieje teraz platforma do porównania skuteczności ratowania wariantu będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu z referencyjnym odpowiednikiem. Ratunek widziany z odniesieniem do ludzkiego cDNA nie musi być idealny. Częściowe uratowanie fenotypu zmutowanego muchy przy użyciu ludzkiego cDNA nadal stanowi punkt odniesienia do przeprowadzenia badań porównawczych z wykorzystaniem wariantu ludzkiego szczepu cDNA.
    4. Korzystając z systemu testowego wybranego w kroku 3.1.2, porównaj uratowanie zaobserwowane z referencyjnym ludzkim cDNA z ratunkiem zaobserwowanym dla wariantu ludzkiego cDNA, aby określić, czy wariant będący przedmiotem zainteresowania ma wpływ na gen będący przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Jeśli wariant ludzkiego cDNA działa gorzej niż allel referencyjny, sugeruje to, że wariant będący przedmiotem zainteresowania jest szkodliwy dla funkcji białka. Jeśli wariantu i odniesienia nie można funkcjonalnie odróżnić, to 1) allel może być izomorfem (wariantem, który nie wpływa na funkcję białka) lub 2) test nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć subtelne różnice.
    5. Jeśli okaże się, że wariant jest szkodliwym allelem, należy dalej oceniać ekspresję i wewnątrzkomórkową lokalizację białek referencyjnych i wariantowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo za pomocą western blot, barwienia immunofluorescencyjnego lub innych metod93.
      UWAGA: Jeśli ludzkie cDNA UAS jest generowane z otwartego klonu w wektorze pGW-HA.attB, użyj przeciwciała anty-HA do przeprowadzenia tych testów biochemicznych i komórkowych. Jeśli oryginalny klon jest zamkniętym klonem, należy sprawdzić, czy w tych testach można zastosować komercyjne przeciwciała przeciwko ludzkim białkom. Różnica w poziomach ekspresji i lokalizacji wewnątrzkomórkowej może ujawnić, w jaki sposób wariant będący przedmiotem zainteresowania wpływa na funkcję białka.
  2. Przeprowadzanie analizy funkcjonalnej poprzez badania nadekspresji
    UWAGA: Wszechobecna lub specyficzna tkankowo nadekspresja ludzkiego cDNA u much typu dzikiego może dostarczyć informacji, które są komplementarne do eksperymentów opartych na ratownictwie omówionych w sekcji 3.1. Podczas gdy testy oparte na ratownictwie są przeznaczone przede wszystkim do wykrywania wariantów LOF (amorficznych, hipomoficznych), testy oparte na nadekspresji mogą również ujawnić warianty wzmocnienia funkcji (GOF), które są trudniejsze do oceny (hipermorficzne, antymorficzne, neomorficzne).
    1. Wybierz zestaw sterowników GAL4, aby uzyskać nadekspresję interesujących nas ludzkich cDNA. W publicznych centrach magazynowych (np. BDSC) dostępnych jest wiele wszechobecnych i specyficznych dla tkanki/etapów sterowników GAL4, z których niektóre są częściej używane niż inne. Najpierw skup się na wszechobecnych czynnikach i łatwych do zidentyfikowania fenotypach (śmiertelność, bezpłodność, fenotypy morfologiczne), a następnie przejdź do czynników specyficznych dla tkanek i bardziej szczegółowych fenotypów.
      UWAGA: Zweryfikuj ekspresję sterowników GAL4 za pomocą linii reporterowej (np. UAS-GFP), aby potwierdzić wzorce ekspresji przed użyciem w eksperymentach.
    2. Wyrazić referencyjne i wariantowe ludzkie cDNA przy użyciu tego samego czynnika w tych samych warunkach (np. temperaturze), krzyżując 3-5 dziewiczych samic z linii GAL4 (np. ey-GAL4 dla ekspresji wyobrażonej krążka wzrokowego) z 3-5 samcami much z linii UAS [np. UAS-TBX2(+) lub UAS-TBX2(p.R305H) dla przykładu pokazanego w sekcji 4.2] w jednej fiolce.
      1. Przenoś krzyżówki co 2-3 dni, aby wiele zwierząt wyszło z jednej krzyżówki.
    3. Zbadaj potomstwo i wykryj wszelkie różnice między szczepami referencyjnymi i wariantowymi (np. morfologią oka) pod mikroskopem preparacyjnym. Zobrazuj muchy za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu preparacyjnego, aby udokumentować fenotyp.
      UWAGA: Jeśli fenotyp jest widoczny tylko w referencji, ale nie w linii wariantu, to wariant może być allelem amorficznym lub silnym hipomorficznym. Jeśli fenotyp jest widoczny w obu genotypach, ale odniesienie powoduje silniejszy defekt, wówczas wariant może być łagodnym lub słabym allelem hipomorficznym. Jeśli odniesienie nie pokazuje fenotypu lub wykazuje tylko słaby fenotyp, ale wariant wykazuje silną wadę, to wariant może być allelem GOF.
    4. Jeśli fenotyp nie jest obserwowany w standardowych warunkach hodowli (RT lub w temperaturze 25 °C), należy ustawić krzyżówki w różnych temperaturach w zakresie 18-29 °C, ponieważ wiadomo, że system UAS/GAL4 jest wrażliwy na temperaturę64,65). Zazwyczaj ekspresja transgenów UAS jest wyższa w wyższych temperaturach.
  3. Wykonaj dodatkowe badania funkcjonalne związane z genami i białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Oprócz badania wad ogólnych, można wybrać system testowy do badania funkcji molekularnych genu i wariantu. W jednym z przykładów omówionych w reprezentatywnych wynikach (przypadek TBX2) zapisy ERG wykorzystano do określenia wpływu wariantu na funkcję fotoreceptora, ponieważ gen muchy będący przedmiotem zainteresowania (rozszczep) był szeroko badany w kontekście rozwoju układu wzrokowego. Szczegółowe protokoły dla ERG u Drosophila można znaleźć zgodnie z wcześniejszymi publikacjami66,67,68.
    1. Generuj muchy, aby przetestować wady funkcjonalne w układzie wzrokowym. Skrzyżowanie dziewiczych samic z linii rodopsyny 1 (Rh1)-GAL4 z samcami z referencyjnymi lub wariantowymi transgenami UAS-ludzkie cDNA w celu ekspresji ludzkich białek będących przedmiotem zainteresowania w fotoreceptorach R1-R6.
      UWAGA: Skrzyżuj 3-5 dziewiczych samic z 3-5 samcami much w jednej fiolce i przenoś krzyżówki co 2-3 dni, aby uzyskać wiele zwierząt z jednej krzyżówki. Wszystkie krzyżówki muszą być trzymane w inkubatorze ustawionym na temperaturę doświadczalną w celu uzyskania spójnych wyników.
    2. Gdy muchy zaczną się zamykać (w temperaturze 25 °C, ~ 10 dni po zawiązaniu początkowej krzyżówki), zbierz potomstwo (Rh1-GAL4/+; UAS-ludzkie cDNA/+) do świeżych fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze ustawionym w temperaturze doświadczalnej na dodatkowe 3 dni, aby układ wzrokowy osiągnął dojrzałość.
      UWAGA: Chociaż ERG można wykonać na 1-2 dniowych muchach, nowo zamknięte muchy mogą mieć duże wahania sygnału ERG. Jeśli pożądane jest zbadanie fenotypu zależnego od wieku, muchy te mogą być starzone przez kilka tygodni, o ile są regularnie (np. co ~5 dni) przenoszone do nowej fiolki, aby uniknąć utonięcia w mokrej karmie.
    3. Przygotuj muchy do rejestracji ERG, najpierw znieczulając muchy za pomocą CO2 lub umieszczając je w fiolce na lodzie. Delikatnie przyklej jedną stronę rozporka do szklanego szkiełka mikroskopowego, aby je unieruchomić.
      UWAGA: Do jednego slajdu można przykleić wiele much referencyjnych i wariantowych. Umieść wszystkie muchy w mniej więcej tej samej orientacji, tak aby jedno oko było dostępne dla elektrody rejestrującej. Uważaj, aby nie dostać kleju na oko i pozostawić trąbkę wolną.
    4. Przygotuj elektrody rejestrujące i referencyjne. Umieść szklaną kapilarnę o średnicy 1,2 mm w ściągaczu igieł i aktywuj. Przerwij rurkę kapilarną, aby uzyskać dwie ostre, stożkowe elektrody. Powstałe elektrody powinny być puste w środku i mieć końcowe średnice <0,5 mm.
    5. Napełnij naczynia włosowate roztworem soli fizjologicznej (100 mM NaCl), upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Nasuń szklane kapilary na elektrody z drutu srebrnego (zarówno elektrodę rejestrującą, jak i elektrodę odniesienia, patrz Rysunek 4) i zabezpiecz kapilary na miejscu.
    6. Skonfiguruj stymulator i wzmacniacz. Szczegółową konfigurację można znaleźć w Lauwers, et al.67. Zestaw UDN Drosophila MOSC składa się z wyposażenia wymienionego w sekcji materiałowej.
      1. Ustaw amplifier na filtr górnoprzepustowy 0.1 Hz, filtr dolnoprzepustowy 300 Hz i wzmocnienie 100.
      2. Ustaw stymulator na okres 1 s, szerokość impulsu 500 ms, opóźnienie impulsu 500 ms, tryb pracy i 7 Amp.
      3. Przygotuj źródło światła do fotostymulacji. Użyj halogenowego źródła światła, aby aktywować fotoreceptory much.
      4. Przygotuj oprogramowanie do nagrywania na komputerze podłączonym do konfiguracji ERG. Stwórz protokół stymulacji z modelem akwizycji "zdarzenia o stałej długości" i czasie trwania 20 s.
    7. Przyzwyczaj muchy do całkowitej ciemności przed rozpoczęciem nagrań ERG. Umieść muchy w całkowitej ciemności na co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
      UWAGA: Ponieważ muchy nie mogą wykryć czerwonego światła, w okresie przyzwyczajenia do ciemności należy używać czerwonego źródła światła.
    8. Umieścić szkiełko z muchami na urządzeniu rejestrującym i przesunąć mikromanipulatory przenoszące elektrody odniesienia i rejestrujące do punktu znajdującego się w pobliżu interesującej nas muchy na szkiełku. Obserwuj końcówkę elektrody i ostrożnie umieść elektrodę odniesienia w klatce piersiowej muchy (wbij się w naskórek). Po stabilnym włożeniu elektrody referencyjnej umieść elektrodę rejestrującą na powierzchni oka.
      UWAGA: Dokładne położenie tej elektrody referencyjnej nie ma większego wpływu na sygnał ERG. Elektroda rejestrująca powinna być umieszczona na powierzchni oka, ponieważ ERG jest zapisem potencjału polowego, a nie wewnątrzkomórkowym. Odpowiednia siła nacisku przyłożona do elektrody rejestrującej powoduje powstanie niewielkiego wgłębienia bez penetracji oka.
    9. Wyłącz wszystkie światła na kolejne 3 minuty, aby zaaklimatyzować muchy w ciemnym otoczeniu.
    10. Zainstaluj oprogramowanie do nagrywania i rozpocznij nagrywanie sygnału. W przypadku korzystania z halogenowego źródła światła z ręczną migawką, włącz źródło światła przy zamkniętej przesłonie. Rozpocznij nagrywanie sygnału.
    11. Wystaw oczy muchy na działanie światła, otwierając i zamykając migawkę co 1 s przez 20 s podczas jednego przebiegu.
      UWAGA: Włączanie/wyłączanie halogenowego źródła światła może być sterowane ręcznie lub zaprogramowane tak, aby stało się zautomatyzowane za pomocą białego źródła światła LED. Bardziej wytrzymałe i niezawodne ERG można uzyskać, stosując halogenowe źródło światła w porównaniu z białą diodą LED, prawdopodobnie ze względu na szersze spektrum światła emitowane przez halogenowe źródło światła.
    12. Rejestruj ERG wszystkich much, które są zamontowane na szklanym szkiełku. Wykonaj ERG od 15 much na genotyp na warunek.
      UWAGA: Niektóre parametry, które można zmienić, aby znaleźć stan, który wykazuje silne różnice między referencyjnymi a wariantowymi cDNA, mogą obejmować temperaturę, wiek lub warunki środowiskowe (np. wychowanie w cyklu światło-ciemność lub stałe światło/ciemność).
    13. Wykonaj analizę danych: porównaj ERG z odniesienia, wariantu i kontroli, aby określić, czy występują różnice. Oceń dane ERG pod kątem zmian w stanach nieustalonych, depoloryzacji, stanach nieustalonych i repolaryzacji69 (Rysunek 4B).
      UWAGA: Depolaryzacja i repolaryzacja odzwierciedlają aktywację i inaktywację kaskady fototransdukcji w fotoreceptorach, podczas gdy stany przejściowe i nieustające są miarami aktywności komórek postsynaptycznych, które odbierają sygnały z fotoreceptorów. Zmniejszona amplituda i zmieniona kinetyka repolaryzacji są często związane z defektami funkcji fotoreceptorów i zdrowia, podczas gdy defekty w on- i off-transjentach występują u mutantów z wadliwym rozwojem, funkcją lub utrzymaniem synaps70.
    14. Po zidentyfikowaniu różnic w fenotypach ERG z nadekspresją referencyjnych i wariantowych ludzkich cDNA, określ, czy ten elektrofizjologiczny fenotyp jest związany z defektami strukturalnymi i ultrastrukturalnymi w fotoreceptorach i ich synapsach, wykonując analizę histologiczną i transmisyjną mikroskopię elektronową.
      UWAGA: Dalsza dyskusja na temat interpretacji wad ERG i analizy strukturalnej/ultrastrukturalnej została wcześniej opisana69.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalne badanie wariantu missense de novo w EBF3 powiązanego z fenotypami neurorozwojowymi
U 7-letniego chłopca z fenotypami neurorozwojowymi, w tym hipotonią, ataksją, globalnym opóźnieniem rozwoju i zaburzeniami mowy ekspresyjnej, lekarze i genetycy z National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) zidentyfikowali wariant missense de novo (p.R163Q) w EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, gen kodujący czynnik transkrypcyjny z rodziny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania eksperymentalne z wykorzystaniem Drosophila melanogaster zapewniają solidny system testowy do oceny konsekwencji wariantów ludzkich związanych z chorobą. Wynika to z obszernego zasobu wiedzy i różnorodnych narzędzi genetycznych, które zostały wygenerowane przez wielu badaczy w dziedzinie much w ciągu ostatniego stulecia89 . Jednak, podobnie jak w przypadku każdego innego systemu eksperymentalnego, ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z istniejących zastrzeżeń i ograniczeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jose Salazarowi, Julii Wang i dr Karen Schulze za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy doktorom Ning Liu i Xi Luo za funkcjonalną charakterystykę omawianych tutaj wariantów TBX2. Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych Sieci Chorób Niezdiagnozowanych było wspierane przez Wspólny Fundusz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. był dodatkowo wspierany przez NIH [CNCDP-K12 i NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (grant Neuroscience Research), Burroughs Wellcome Fund (Nagroda za karierę dla naukowców medycznych), Towarzystwo Neurologii Dziecięcej i Fundację Neurologii Dziecięcej (grant PERF Elterman) oraz NIH Director's Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. był dodatkowo wspierany przez Fundację Simonsa (Nagroda SFARI: 368479). S. Y. był dodatkowo wspierany przez NIH (R01 DC014932), Fundację Simonsa (nagroda SFARI: 368479), Stowarzyszenie Alzheimera (grant na badania dla nowych badaczy: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research oraz Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine. Mikroskopia konfokalna w BCM jest częściowo wspierana przez grant NIH U54HD083092 do Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową (IDDRC) Neurovisualization Core.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drosophila Zapasy do transgenezy UAS-ludzkiego cDNA
Szczepy iniekcyjne do transgenezy (D. melanogaster)BDSC#24871Specyficzny odczynnik: VK33 (3. chromosom) Linia iniekcyjna
Szczepy iniekcyjne do transgenezy (D. melanogaster)BDSC#24872Specyficzny odczynnik: VK37 (2. chromosom) Linia iniekcyjna
Plasmid DNA< / strong>
Wektor klonowaniaThermo Fisher#12536-017Specyficzny odczynnik: pDONR221
Drosophila wektor transgenezyPrezent od dr Johannesa Bischofa i Konrada Baslera (Bischof i wsp., 2013 PNAS)Specyficzny odczynnik: pGW-HA.attB
Zestawy i odczynniki do biologii molekularnej
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Odczynnik specyficzny: Agaroza (klasa biologii molekularnej)
Chemicznie kompetentne komórki (E. coli)Thermo Fisher#18265017Specyficzny odczynnik: DH5 i alfa;
Zestaw do ekstrakcji żelu DNAThermo Fisher#K210012Specyficzny odczynnik: Zestaw do ekstrakcji żelu PureLink Zestaw
do izolacji i oczyszczania DNAQiagen#27104Specyficzny odczynnik: QIAprep Spin Miniprep
Kit Polimeraza o wysokiej wierności Specyficznydla NEB#M0491Odczynnik: Q5 Zestaw polimerazy
klonowania za pośrednictwem rekombinazyThermo Fisher#11789020Specyficzny odczynnik: Zestaw klonazy Gateway BP System
klonowania za pośrednictwem rekombinazyThermo Fisher#11791100Specyficzny odczynnik: Zestaw enzymów Gateway LR Clonase II
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsceAgilent# 200523Specyficzny odczynnik: Quick Change II Zestaw do mutagenezy
Electroretinogram Sprzęt związany z rigiem
ERG AnalizaUrządzenia molekularneNie dotyczySpecyficzny odczynnik: Pakiet oprogramowania do transmisji danych Axon pCLAMP 10 Gromadzenie
danych ERGOdczynnik specyficzny dla LabX#R150358: ISO-DAM Izolowany wzmacniacz
biologiczny Stymulator ERGAstro-Med#S48Specyficzny odczynnik: Stymulator impulsów kwadratowych
System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870(2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880(2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225(2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688(2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041(2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905(2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327(2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135(2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189(2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62(2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21(2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097(2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743(2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143(2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test funkcjonalny Drosophilaanaliza wariant w ludzkicheksperymenty z nadekspresj ratunkowrejestracja elektroretinogramugenerowanie narz dzi genetycznychzas b sieciowy MARRVELocena in vivobadania nad chorobami rzadkimiprzesiewanie organizm w modelowychanaliza fenotypowa

Powiązane artykuły