Artykuł metodologiczny

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

DOI:

10.3791/59666

⸱

7 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak skóry jest dobrze znany jako najbardziej agresywny rak skóry. Chociaż czynniki ryzyka i poważne zmiany genetyczne są nadal dokumentowane z coraz większą głębią, częstość występowania czerniaka skóry wykazała szybki i ciągły wzrost w ostatnich dziesięcioleciach. Aby znaleźć skuteczne metody zapobiegawcze, ważne jest zrozumienie wczesnych etapów inicjacji czerniaka w skórze. Wcześniejsze dane wykazały, że komórki macierzyste melanocytów pęcherzykowych (MCSC) w dorosłych tkankach skóry mogą działać jako komórki czerniaka w przypadku ekspresji mutacji onkogennych i zmian genetycznych. Nowotworzenie wynikające z MCSC podatnych na czerniaka może być indukowane, gdy MCSC przechodzą ze stanu spoczynku do stanu aktywnego. To przejście w MCSC podatnych na czerniaka może być promowane przez modulację stanu aktywności komórek macierzystych mieszków włosowych lub przez zewnętrzne czynniki środowiskowe, takie jak ultrafiolet B (UV-B). Czynniki te mogą być sztucznie manipulowane w laboratorium poprzez depilację chemiczną, która powoduje przejście komórek macierzystych mieszków włosowych i MCSC ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, oraz poprzez ekspozycję na promieniowanie UV-B przy użyciu światła laboratoryjnego. Metody te zapewniają skuteczną kontrolę przestrzenną i czasową inicjacji czerniaka skóry w mysiej skórze grzbietowej. W związku z tym te systemy modelowe in vivo będą cenne dla zdefiniowania wczesnych etapów inicjacji czerniaka skóry i mogą być wykorzystane do testowania potencjalnych metod zapobiegania nowotworom.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak, złośliwa forma guzów melanocytowych, jest najbardziej agresywnym nowotworem skóry, a czerniak skóry jest odpowiedzialny za większość zgonów z powodu raka skóry1. W Stanach Zjednoczonych czerniak jest powszechnie diagnozowany; Przewiduje się, że będzie to 5. do 6. najczęściej występujący typ raka wśród szacowanych nowych przypadków raka w 2018 r. 2. Ponadto, podczas gdy ogólna zachorowalność na raka wykazywała tendencję do stopniowego zmniejszania się w ostatnich dziesięcioleciach, wskaźniki zachorowalności na czerniaka skóry w ciągu ostatnich kilku dekad wykazują ciągły i szybki wzrost u obu płci2.

Aby skuteczniej zwalczać czerniaka skóry, ważne jest jasne zrozumienie wczesnych etapów rozwoju czerniaka na podstawie komórek ich pochodzenia, aby lepiej zidentyfikować klinicznie skuteczne metody prewencji. Obecnie wiadomo, że dorosłe komórki macierzyste mogą znacząco przyczyniać się do powstawania nowotworów jako komórkowe pochodzenie nowotworów w wielu różnych typach narządów, w tym w tkankach skóry3,4,5. Podobnie, dorosłe komórki macierzyste melanocytów (MCSC) w mysiej skórze grzbietowej mogą działać jako komórki czerniaka pochodzenia po nieprawidłowej aktywacji szlaków Ras/Raf i Akt6. Jednak same te onkogenne mutacje nie są w stanie skutecznie indukować powstawania guza ze spoczynkowych MCSC. Guzy melanocytowe ostatecznie rozwijają się, gdy MCSC stają się aktywne podczas naturalnego cyklu włosowego. Jednak w tym protokole opiszemy metody sztucznego wywoływania aktywacji komórkowej MCSC podatnych na nowotwory, ułatwiając w ten sposób precyzyjną kontrolę inicjacji czerniaka6,7.

Dzięki opisanym tutaj metodom, przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka skóry z podatnych na nowotwory MCSC wykazujących ekspresję onkogennego BrafV600E wraz z utratą ekspresji Pten może być pomyślnie przeprowadzona, jak już wcześniej informowaliśmy6. Metoda ta uwzględnia wcześniejsze odkrycia, które pokazują aktywację komórek macierzystych mieszków włosowych poprzez depilację, a także to, w jaki sposób ekspozycja mysiej skóry na promieniowanie UV-B może ułatwić aktywację MCSC rezydujących w mieszku włosowym i translokację tej subpopulacji komórkowej do naskórka międzymieszkowego6,8,9,10. Te systemy modelowe in vivo mogą dostarczyć cennych informacji na temat tego, w jaki sposób zmiany fizjologiczne i środowiskowe mogą zmieniać status komórkowy MCSC podatnych na czerniaka, co z kolei może wywołać znaczną inicjację czerniaka w skórze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach są wykonywane zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornell (IACUC).

1. Przygotowanie

  1. Zebrać klipsy ogonowe od myszy 12 dni po urodzeniu i trawić w 400 μl 0,05 N NaOH w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. Zwirować i dodać 32 μl 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp myszy zgodnie z protokołami PCR dostarczonymi przez Jackson Laboratory i identyfikuj myszy z genotypem będącym przedmiotem zainteresowania6.
    - Tyr-CreER – hemizygotyczny (+/CreER)
    - LSL-BrafV600E – heterozygotyczny (+/LSL-V600E)
    - Pten – flox homozygotyczny (flox/flox)
    - LSL-tdPomidor – półmizygotyczny (+/LSL-tdTomato)
    nuta: Sekwencje podkładowe znajdują się w tabeli materiałów.
  2. Użyj maszynki do strzyżenia włosów (trymera elektrycznego), aby ogolić skórę grzbietową 2 do 3 dni przed wszystkimi eksperymentami opisanymi poniżej oraz gdy myszy mają około 7 tygodni. Uważaj, aby nie uszkodzić cienkiej skóry myszy za pomocą trymera elektrycznego, ponieważ każdy uraz może wywołać reakcję gojenia się rany, która aktywuje komórki macierzyste mieszków włosowych, w tym MCSC.
  3. Określ, czy cykl włosa jest w telogenie i czy skóra jest zraniona w okresie oczekiwania. Jeśli skóra wykazuje jakiekolwiek oznaki urazu, mysz nie powinna być używana do tych zabiegów.
    nuta: Chociaż cykl włosa może się nieznacznie różnić w zależności od podłoża genetycznego, w tym wieku cykl włosa w skórze grzbietowej jest zwykle w stanie telogenu11. Transgen Tyr-CreER będzie ukierunkowany na MCSC w skórze telogenowej, a późniejsze zmiany genetyczne ulegną trwałej ekspresji we wszystkich liniach MCSC, w tym w zróżnicowanych melanocytach i guzach melanocytowych.

2. Leczenie tamoksyfenem w rekombinacji genetycznej Cre-Lox

  1. Przygotowanie tamoksyfenu do wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) lub do podania miejscowego w celu ogólnoustrojowej lub miejscowej rekombinacji genetycznej
    nuta: Aby tamoksyfen indukował rekombinację, musi najpierw zostać zmetabolizowany przez wątrobę do 4-hydroksytamoksyfenu (4-OHT), który może wiązać się i aktywować CreER. Miejscowe stosowanie tamoksyfenu nie będzie metabolizowane w ten sposób i 4-OHT musi być stosowany bezpośrednio. Do wystarczającej rekombinacji wymagana jest tylko jedna metoda podawania tamoksyfenu.
    1. Tamoksyfen: Przygotować tamoksyfen w stężeniu 10 mg mL-1 rozpuszczony w oleju kukurydzianym. Aby pomóc w rozpuszczeniu leku w roztworze, dodaj do 10% całkowitej objętości 100% etanolu klasy cząsteczkowej do leku w postaci proszku, wiruj przez 3 minuty, a następnie dodaj pozostałą objętość oleju kukurydzianego. Kontynuuj wirowanie, aż materiał krystaliczny przestanie być widoczny w roztworze. Roztwór tamoksyfenu można sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,2 μm. Przejdź do kroku 2.2.1 dotyczącego leczenia.
    2. 4-OHT: Przygotować roztwór podstawowy hydroksytamoksyfenu do 3 mg mL-1 w 100% etanolu. Następnie roztwór roboczy można nałożyć tyle, ile potrzeba, aby pokryć obszar skóry (zwykle jednorazowa aplikacja).
      nuta: Roztwór podstawowy hydroksytamoksyfenu można rozpuścić w 100% etanolu do końcowego stężenia 5 mM. Następnie, aby przygotować roztwór roboczy, 5 μl roztworu podstawowego 4OH-tamoksyfenu można rozcieńczyć na 15 μl 100% etanolu. W przypadku obszaru 4mm2 można stosować miejscowo od 1 do 3 μl roztworu roboczego.
  2. Leczenie myszy tamoksyfenem ogólnoustrojowo lub miejscowo
    1. W leczeniu ogólnoustrojowym należy podawać 2 mg tamoksyfenu we wstrzyknięciu IP raz na dobę przez 3 dni za pomocą igły 26 G.
      nuta: Korzystając z tego modelu, około 93% ± 4% spokojnych MCSC jest oznaczonych tagiem tdTomato6.
    2. W celu aktywacji regionalnej należy wykonać jeden zabieg miejscowy z użyciem 4-OHT. Przykryj obszar skóry interesujący Cię roztworem roboczym. Ilość roztworu roboczego można określić na podstawie wielkości obszaru zainteresowania, jak opisano w kroku 2.1.2.
  3. Po 48 godzinach od podania ostatniej dawki tamoksyfenu należy przejść do etapu 3 w przypadku inicjacji guza wywołanej depilacją chemiczną lub do etapu 4 w przypadku inicjacji guza wywołanej promieniowaniem UV-B

3. Depilacja chemiczna

  1. Wyposaż gabinet zabiegowy na myszach zawierający system izofluranu w następujące wymagane materiały: krem do depilacji, waciki, ściereczkę papierową i wodę.
  2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulenie 3,5 do 4,5% izofluranem i 1 l/min tlenu.
  3. Gdy częstość oddechów się ustabilizuje, upewnij się, że mysz znajduje się we właściwej płaszczyźnie znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i przenieś mysz do głównej rurki, utrzymując znieczulenie za pomocą 1 do 1,5% izofluranu i 1 l / min tlenu. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu pod narkozą.
  4. Użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć cienką warstwę kremu do depilacji na ogolony obszar skóry myszy.
  5. Po równomiernym nałożeniu kremu użyj czystych bawełnianych wacików, aby rozpocząć usuwanie. Łączny czas kontaktu kremu ze skórą nie powinien przekraczać 1 minuty.
  6. Delikatnie przetrzyj skórę wilgotną papierową szmatką i upewnij się, że wszelkie resztki kremu zostały usunięte.
    nuta: Krem do depilacji może powodować podrażnienie skóry, jeśli nie zostanie całkowicie usunięty. Niektóre myszy, takie jak te na tle C57BL/6, mogą być podatne na rozwój zapalenia skóry12. Chociaż rzadko, u niektórych zwierząt zapalenie skóry rozwija się w ciągu 24 godzin po nałożeniu kremu do depilacji lub depilacji mechanicznej. Pamiętaj, aby sprawdzić myszy dzień po zabiegu, aby poszukać oznak regionalnego podrażnienia skóry.
  7. Wyrzuć usunięte łodygi włosów i wszelkie użyte materiały do kosza na zagrożenia biologiczne.
  8. Umieść mysz w pustej, czystej klatce dla myszy, aż znieczulenie ustąpi.
  9. Wróć myszy do ich klatek.

4. Naświetlanie UV-B

  1. Wyposaż gabinet zabiegowy na myszy zawierający system izofluranu w następujące wymagane materiały: system światła UV-B, światłomierz UV-B, pokrowiec ochronny dla myszy, dodatkowe środki ochrony osobistej UV-B dla badacza oraz timer.
  2. Myszy należy naświetlać dawką UV-B będącą przedmiotem zainteresowania (tj. 0-180 mJ/cm2). Użyj światłomierza UV-B, aby określić odpowiedni czas naświetlania myszy.
    UWAGA: mW/cm2 x czas = dawka
  3. Znieczulij mysz izofluranem. W komorze indukcyjnej należy użyć od 3,5 do 4,5% izofluranu i 1 l/min tlenu.
  4. Po ustabilizowaniu myszy potwierdź efekty znieczulenia szczyptą palca u nogi i przenieś mysz do głównej rurki anestezjologicznej znajdującej się w komorze UV. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu pod narkozą. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1 do 1,5% izofluranu i 1 l/min tlenu.
  5. Przykryj skórę grzbietową materiałem ochronnym UV-B, tak aby odsłonięty był tylko żądany obszar.
    nuta: W tym czasie należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Czas potrzebny do naświetlania myszy zależy od intensywności użytej żarówki, ale znieczulenie może wymagać monitorowania, jeśli wymagany czas przekracza 30 s.
  6. Przykryj komorę UV pokrywką odporną na promieniowanie UV lub innymi odpowiednimi materiałami.
  7. Włącz lampę UV-B i naświetlaj mysz przez czas określony przez badaczy dla konkretnego celu.
  8. Wyłącz system UV i izofluran, a następnie umieść mysz w pustej klatce dla myszy, aż znieczulenie ustąpi.
  9. Wróć myszy do ich klatek.

5. Przetwarzanie tkanek

  1. Izolacja skóry
    1. Przed rozpoczęciem należy zaopatrzyć się w następujące materiały: narzędzia do sekcji zwłok, bibułę filtracyjną i ręczniki papierowe.
    2. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami i potwierdź śmierć przed kontynuacją.
    3. Za pomocą maszynki do strzyżenia włosów zgol włosy z grzbietowej części skóry. Delikatnie przeczesz obszar niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar.
    4. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona.
    5. Włóż duże nożyczki do nacięcia i oddziel podskórne tkanki łączne.
    6. Ostrożnie odizoluj obszar skóry, który Cię interesuje, przecinając ostrymi nożyczkami wzdłuż krawędzi tkanki.
    7. Umieść tkankę skórną na czystym ręczniku papierowym i za pomocą kleszczy rozciągnij skórę, aby przylegała do ręcznika i była nauczona. Ten krok służy zapewnieniu dodatkowego wsparcia dla tkanki, aby można było nią manipulować i przetwarzać przy zachowaniu jej kształtu.
      nuta: Należy uważać, aby dotykać tylko zewnętrznych obszarów tkanki skórnej, ponieważ kleszcze mogą spowodować uszkodzenie skóry, które można zobaczyć histologicznie.
  2. Utrwalanie tkanek
    1. Złóż kawałek bibuły filtracyjnej na pół i odpowiednio oznacz. Umieść skórę wraz z podkładem ręcznika papierowego w złożonym papierze bezpośrednio przylegającym do zagięcia, upewniając się, że próbka jest gładka i nie jest pofałdowana ani pognieciona. Uszczelnij bibułę filtracyjną, zszywając otwarte boki, a następnie przytnij, aby pozostała bibuła mogła być wykorzystana do przyszłych próbek.
      nuta: Ten krok jest wykonywany tak, aby skóra zachowała swój kształt podczas utrwalania.
    2. Całkowicie zanurzyć próbkę tkanki w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 3 do 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Po utrwaleniu wyjmij próbki z formaliny, umyj w wodzie dejonizowanej (2x, 5 min każda) i przystąp do wykonywania bloków tkankowych. Ostrożnie usuń wszelkie resztki materiału z tkanki skórnej (tj. resztki papieru).
  3. Tworzenie zamrożonych bloków tkanek (Rysunek 1)
    1. Przytnij krawędzie próbki skóry tak, aby nie były postrzępione, a następnie wykonaj 3 strzałkowe nacięcia. Szerokość tych pasków nie powinna być większa niż wysokość kriomoldu (5 mm). Następnie należy wykonać nacięcia poprzeczne, aby uzyskać kawałki skóry, które nie są dłuższe niż szerokość kriomoldu (20 mm) i mogą być osadzone. Powtórz z pozostałą połową skóry grzbietowej lub zachowaj tkankę do innych zastosowań (alternatywnie, zachowaj połowę przed utrwaleniem).
      nuta: Ważne jest, aby utrzymać kawałki skóry we właściwej orientacji.
    2. Ustaw kriomold (25 x 20 x 5 mm3) w orientacji pionowej i umieść 4 do 5 kawałków skóry na wierzchu OCT. Gdy wszystkie elementy znajdą się na swoim miejscu, użyj 2 par cienkich kleszczy, aby przyłożyć długą krawędź skóry do dna krioformy. Skóra powinna teraz stać w OCT prostopadle do podstawy formy. Na tym etapie należy zwrócić uwagę, aby zminimalizować tworzenie się kieszeni powietrznych w OCT (Rysunek 1).
    3. Napełnij formę OCT do drugiej wargi i umieść na płaskiej powierzchni suchego lodu. Użyj kleszczy, aby dostosować wszelkie kawałki skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać. Po zestaleniu się dolnej warstwy manipulacja tkankami będzie niemożliwa.
    4. Wytnij szkiełka o grubości 8-10 μm do analizy.
  4. Wytwarzanie bloków tkankowych zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)
    1. Umieść 2 kawałki utrwalonej skóry w oznakowanej kasecie i odwodnij w rosnących stężeniach etanolu (75% etanolu przez 30 min, 85% przez 30 min, 90% przez 30 min, 95% przez 30 min, 100% przez 2x 30 min, ksylen lub substytut ksylenu przez 2x 30 min). Inkubować z parafiną w temperaturze 58-60°, najpierw przez 30 minut, a następnie przez noc.
    2. Zanurzyć tkankę w formie do tkanek ze stali nierdzewnej o wymiarach 24 x 24mm2 z ciekłą parafiną i zestalić w temperaturze -5 °C. Orientacja tkanki powinna być podobna do orientacji zamrożonych bloków tkankowych, tak aby można było uwidocznić podłużne odcinki w poprzek wielu mieszków włosowych (Rysunek 1).
    3. Gdy parafina zastygnie, wyjmij formę i pokrój na odcinki 5-10 μm do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inicjacja czerniaka skóry wywołana depilacją chemiczną

Procedura depilacji chemicznej jest przedstawiona w Rysunek 2. Kiedy myszy są 7 tygodni po porodzie, ich skóra grzbietowa jest w telogenie. Podczas telogenu wiadomo, że komórki macierzyste mieszków włosowych i MCSC są w stanie spoczynku. Skóra po goleniu nie powinna wykazywać znacznego wzrostu włosów. Z drugiej strony, depilacja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyczne zmiany genetyczne często występujące w nowotworach czerniaka skóry zostały dobrze opisane13. Najbardziej dominującą mutacją jest BrafV600E, a genetycznie zmodyfikowany mysi model czerniaka za pośrednictwem BrafV600E został wygenerowany przez grupęBosenberga 14 i zdeponowany w Jackson Laboratory. Korzystając z tego modelu mysiego, nasze ostatnie badanie wykazało wymóg aktywacji komórkowej MCSC podatnych na nowotwór w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia, poprzez Peer Reviewed Cancer Research Program pod nagrodą W81XWH-16-1-0272. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autorów i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Praca ta została również wsparta grantem zalążkowym z Cornell Stem Cell Program dla A.C. White'a. H. Moon był wspierany przez Cornell Center for Vertebrate Genomics Scholar Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TamoksyfenSigmaT5648-1GDo wstrzykiwań ogólnoustrojowych
TamoksyfenCayman Chemical13258Do wstrzykiwań ogólnoustrojowych
Olej kukurydzianySigma45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoksyfenSigmaH7904-25MGDo leczenia miejscowego
26 G 1/2igły różneklasy weterynaryjnej
Strzykawka 1 mlróżne
Maszynka do strzyżenia włosów zwierzątWahl09990-502
Krem do depilacjiNairn/aDostępne w większości aptek
Waciki bawełnianeróżne
Żarówka ultrafioletowaUVP95-0042-08model XX-15M średniej klasy lampa UV
200 proof etanolróżneczysty etanol
Histoplast PEFisher Scientific22900700pelety parafinowe
Neutralna buforowana formalina, 10%SigmaHT501128-4L
Clear-Rite 3Thermo Scientific6901substytut ksylenu
O.C.T. CompoundThermo23730571
Kaseta na tkankiSakura89199-430do Przetwarzanie FFPE
CryomoldsSakura455725 x 20 mm
Metalowa forma FFPELeica380308224 mm x 24 mm
IsofluranróżneWeterynaryjny
system inhalacyjny do znieczuleniaróżneKlasa weterynaryjna
Drobne nożyczkiFST14085-09Proste, ostre/ostre
Cienkie nożyczkiFST14558-09Prosty, ostry/ostry
MetzenbaumFST14018-13Prosty,/
KleszczFST11252-00Dumont #5
KleszczFST11018-12Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/fJackson Labs13590
LSL-tdTomatoJackson Labs007914ai14
Cre-1n/aGCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2n/aGAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1n/aTGAGTATTTTTGGCAACTGC
Biustonosz V600E-2n/aCTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1n/aAGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2n/aCCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1n/aACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2n/aAATCTAGGGTCTCTTGTGCC
Pten-3n/aGCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1n/aAAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2n/aCCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3n/aGGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4n/aCTGTTCCTGTACGGCATGG
" weterynaryjnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
  4. Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
  5. Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
  6. Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  7. Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864(2018).
  8. Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
  9. Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
  10. Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
  11. Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
  12. Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
  13. Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), 706-706.e1 (2013).
  14. Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  15. Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

depilacja chemicznanapromieniowanie UV Baktywacja mieszk w w osowychizolacja tkanki sk ryzatapianie w OCTprzygotowanie formy do kriotomiimodele zapobiegania nowotworomsk ra grzbietowa myszy

Powiązane artykuły