Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka aorty od miniaturowych świń

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59673

⸱

14 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana jest skuteczna metoda enzymatyczna do izolacji pierwotnych komórek śródbłonka aorty świńskiej (pAEC) od miniaturowych świń. Wyizolowane pierwotne pAEC mogą być wykorzystane do zbadania odpowiedzi immunologicznej i krzepnięcia w ksenotransplantacji.

Streszczenie

Ksenotransplantacja jest obiecującym sposobem na rozwiązanie problemu niedoboru ludzkich organów dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością narządów, a świnia jest uważana za odpowiednie źródło narządów. Odrzucenie immunologiczne i krzepnięcie to dwie główne przeszkody dla powodzenia ksenotransplantacji. Uszkodzenia i dysfunkcje komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) są ważne dla rozwoju odpowiedzi zapalnej i krzepnięcia w ksenotransplantacji. W związku z tym izolacja komórek śródbłonka aorty świń (pAEC) jest niezbędna do zbadania odpowiedzi na odrzucenie immunologiczne i krzepnięcie. W tym miejscu opracowaliśmy proste podejście enzymatyczne do izolacji, charakterystyki i ekspansji wysoko oczyszczonych pAEC od miniaturowych świń. Najpierw miniaturowa świnia została znieczulona ketaminą i wycięto odcinek aorty. Po drugie, śródbłonkową powierzchnię aorty wystawiono na działanie 0,005% roztworu trawiennego kolagenazy dożylnej przez 15 minut. Po trzecie, powierzchnia śródbłonka aorty została zeskrobana tylko w jednym kierunku za pomocą skrobaka do komórek (<10 razy) i nie została ściśnięta podczas procesu skrobania. Wreszcie, izolowane pAEC dnia 3 oraz po pasażu 1 i pasażu 2 zidentyfikowano za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałem anty-CD31. Odsetek komórek CD31-dodatnich wynosił odpowiednio 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% i 92,4% ± 1,7% (średnia ± SD). Stężenie kolagenazy IV, czas trawienia, kierunek oraz częstotliwość i intensywność skrobania mają kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia fibroblastami i uzyskania wysokiej czystości i dużej liczby EC. Podsumowując, nasza metoda enzymatyczna jest wysoce skuteczną metodą izolowania EC z miniaturowej aorty świni, a komórki mogą być namnażane in vitro w celu zbadania odpowiedzi immunologicznych i krzepnięcia w ksenotransplantacji.

Wprowadzenie

Niedobór dostępnych organów do przeszczepów jest nierozwiązanym problemem na całym świecie1. Według Chińskiego Towarzystwa Czerwonego Krzyża tylko niewielka liczba pacjentów ze schyłkową niewydolnością narządów otrzymała odpowiedni narząd w Chinach w 2018 roku.

Ksenotransplantacja jest obiecującym sposobem na rozwiązanie problemu niedoboru narządów. Narządy świni są uważane za najbardziej odpowiednie narządy dla ludzi ze względu na podobieństwa anatomiczne i fizjologiczne2,3. Niepowodzenie ksenoprzeszczepu świni jest w dużej mierze związane z reakcją naczelnych na odrzucenie układu immunologicznego i krzepnięcie. Komórki śródbłonka świń (EC) mają kluczowe znaczenie, ponieważ komórki te jako pierwsze wchodzą w interakcję z układem odpornościowym naczelnych, który obejmuje przeciwciała, dopełniacz, cytokiny i komórki odpornościowe (np. Limfocyty T, limfocyty B i makrofagi)4,5. EC świń odgrywają istotną rolę w ksenotransplantacji narządów świń i wysp trzustkowych6,7. W związku z tym EC są ważnymi komórkami do badania reakcji odrzucenia i krzepnięcia przeszczepu świni. Do badań nad ksenotransplantacją wymagana jest izolacja wysokiej jakości EC świń

.

W próbach izolacji EC z różnych narządów (np. serca, nerek, wątroby i aorty), zgłoszono kilka protokołów w warunkach ksenotransplantacji8,9,10,11,12. Jednak utrzymanie ultraczystej hodowli wyizolowanych EC jest nierozwiązanym problemem w standardowych protokołach. Zwiększone stężenie strawionego roztworu, niewłaściwy czas trawienia i intensywność skrobania mogą przyczyniać się do zwiększonego zanieczyszczenia fibroblastami w obecnych badaniach8,10,13. Poza tym metoda izolowania pAEC od miniaturowych świń jest mniej zbadana. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę enzymatyczną izolowania wysoko oczyszczonych pAEC od miniaturowych świń (Wuzhishan lub Bama). W protokole zaprojektowano kilka etapów w celu zmniejszenia zanieczyszczenia fibroblastami i uzyskania EC o wysokiej czystości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen, zgodnie z zasadami dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie zwierząt, podłoża i

  1. Przygotuj miniaturową świnkę.
    UWAGA: Wszystkie miniaturowe świnki były chińskimi świniami Wuzhishan lub Bama (samcami). Wiek i masa ciała świń wynosiły odpowiednio 100 dni ± 8 dni i 5,7 kg ± 1,0 kg (średnia ± SD, n = 3).
  2. Przygotować pożywkę: pożywkę z komórek śródbłonka (ECM) uzupełnioną 10% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (P/S) i 1% (v/v) suplementem wzrostu komórek śródbłonka (ECGS).
  3. Przygotować bufor do przemywania : 1x roztwór PBS (pH 7,4) z 1% (v/v) P/S.
  4. Przygotuj 0,005% roztwór trawienny kolagenazy dożylnie: 1 mg proszku kolagenazy dożylnej w 20 ml roztworu PBS. Przed trawieniem podgrzej roztwór trawienny kolagenazy w temperaturze 37 °C.
  5. Przygotuj bufor zatrzymujący: zmodyfikowane podłoże Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% P/S.

2. Chirurgia i przygotowanie do izolacji komórek śródbłonka aorty świń

  1. Dezynfekcja sali operacyjnej światłem UV przez 1 h oraz płynem do dezynfekcji medycznej 84 (dostępna zawartość chloru to 4,0% - 5,0%, Tabela Materiałów) przed wykonaniem zabiegu.
  2. Po tym, jak miniaturowa świnia otrzymała wstrzyknięcie domięśniowe składające się z 15 mg/kg ketaminy, 15 mg/kg chlorowodorku ksylazyny i 0,05 mg/kg chlorowodorku fenacetyny (Objętości: 100 μL/kg, Tabela materiałów) (Rysunek 1A), potwierdź stan znieczulenia zwierzęcia, sprawdzając bolesny bodziec świń (np. szczypanie jednego ucha lub potrząsanie jedną kończyną przednią) i wskaźnik fizjologiczny (np. ciśnienie krwi, tętno i częstość oddechów).
    UWAGA: Kolejne pół dawki wstrzyknięcia można podać świni, jeśli wykazuje oznaki przebudzenia.
  3. Przeciąć brzuch skalpelem, odsłonić żyłę główną dolną i w konsekwencji wstrzyknąć heparynę sodową (5000 j., tabela materiałów) do żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml.
  4. Pięć minut później włóż cewnik do aorty brzusznej do krwi, przetnij skórę klatki piersiowej i nacinaj przeponę skalpelem, a następnie odetnij lewą komorę.
    UWAGA: Upewnij się, że świnia została poddana eutanazji, sprawdzając puls aorty po przekrwieniu i przecięciu serca.
  5. Żebra należy wyciąć kleszczami do kości (tabela materiałów) i odsłonić serce i płuca. Znajdź aortę za sercem i płucami i zaciśnij oba końce. Przemyj aortę raz wstępnie schłodzonym buforem do płukania (Rysunek 1B,C).
  6. Wytnij aortę nożyczkami i trzymaj aortę zaciśniętą na każdym końcu. Wytnij nadmiar tkanki wokół aorty za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek. Umieść aortę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, przemyj aortę wstępnie schłodzonym buforem myjącym 3x (30 ml na płukanie) i przenieś aortę do laboratorium (Rysunek 1D).

3. Izolacja komórek śródbłonka aorty świń

  1. W warunkach aseptycznych wyjmij aortę świni z bufora do płukania i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 150 mm (Rysunek 2A).
  2. Delikatnie odetnij dwa końce aorty i ponownie wytnij nadmiar tkanki wokół aorty za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek (Rysunek 2B). Przemyć zewnętrzną i wewnętrzną stronę aorty (nad naczyniem hodowlanym w temperaturze pokojowej) za pomocą 20−50 ml buforu do mycia.
    UWAGA: Staraj się ciąć tylko obszar, w którym umieszczono zaciski podczas operacji, ponieważ niektóre EC zostały uszkodzone w tym obszarze, i usuń nadmiar tkanek i bocznych gałęzi tętnic.
  3. Przeprowadź szew chirurgiczny przez aortę, a następnie zawiąż jeden koniec aorty za pomocą szwu chirurgicznego (5-0, 90 cm, tabela materiałów). Utrzymuj szew chirurgiczny po wewnętrznej stronie aorty (Rysunek 2C,D).
  4. Delikatnie przymocuj aortę w pobliżu zawiązanego końca za pomocą kleszczy, a następnie powoli pociągnij szew chirurgiczny, aby odwrócić aortę, aż powierzchnia śródbłonka aorty zostanie odsłonięta (Rysunek 2E-G).
    UWAGA: Upewnij się, że aorta jest zamocowana w pobliżu zawiązanego końca i nie mocuj aorty mocno, w przeciwnym razie aorty nie można odwrócić, pociągając za szew chirurgiczny.
  5. Przemyj powierzchnię śródbłonka aorty buforem do przemywania 3x (10 ml na płukanie), a następnie wyrzuć ten roztwór. Umieść aortę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przykryj aortę 10 ml 0,005% roztworu trawiennego kolagenazy dożylnej w probówce (Rysunek 2H).
    UWAGA: Przed strawieniem podgrzej 0,005% roztwór trawienny kolagenazy dożylnie w temperaturze 37 °C.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Umieścić strawioną aortę i roztwór trawienny w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i zatrzymać działanie 0,005% kolagenazy dożylnie, dodając 10−15 ml wstępnie schłodzonego buforu zatrzymującego.
    UWAGA: Zalecany czas trawienia wynosi od 10 do 20 minut. Upewnij się, że powierzchnia śródbłonka aorty jest pokryta buforem zatrzymującym.
  7. Delikatnie zeskrob pAEC z wewnętrznej powierzchni aorty za pomocą skrobaka komórkowego (Rysunek 2I). Przemyj zeskrobaną aortę 3x buforem do przemywania (5 ml na raz). Umieść roztwór z naczynia hodowlanego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj dno naczynia hodowlanego 2x buforem myjącym (5 ml na raz) i ponownie umieść roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Delikatnie zeskrobać w jednym kierunku i nie ściskać. Nie dotykaj chusteczki w pobliżu krawędzi i otworów. Zaleca się skrobanie 5−8x.
  8. Odwirować probówkę o stężeniu 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić 10 ml roztworu na dnie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 20 ml buforu myjącego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić granulki. Na tym etapie unikaj bąbelków.
  9. Wirować przy 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Powoli wyrzucić supernatant. Zawiesić osady komórkowe w 1 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać.
    UWAGA: Uzyskana średnia liczba EC na cm aorty wynosi 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (średnia ± SD, n = 3).
  10. Policz komórki za pomocą licznika komórek. Płytkie i hodowla komórek w naczyniu bez powlekania jakimikolwiek materiałami zgodnie z numerem komórki. Jeśli liczba komórek jest mniejsza lub równa 1,0 x 106, hodować komórkiw kolbie o średnicy 25 cm2. Jeśli liczba komórek jest większa niż 1,0 x 106, hoduj komórki w kilku kolbach o długości25 cm 2 (1,0 x 106 komórek na kolbę). Umieścić kolbę w inkubatorze (bez wstrząsania) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wymieniać pożywkę co 2-3 dni.
    UWAGA: Niektóre ogniwa są uszkodzone przez skrobak do komórek. Test żywotności komórek wykazał, że odsetek żywych komórek wynosi 95,7% ± 1,7% (średnia ± SD, n = 3). Czas podwajania izolowanych komórek wynosi około 1−2 dni.

4. Pozyskiwanie i charakterystyka czystych komórek śródbłonka

  1. Pozostaw komórki na około 4-5 dni. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji (Rysunek 3A), trawią komórki 0,25% trypsyny i przechodzą przez komórki. Następnie zbierz niektóre z wyizolowanych komórek (Dzień 3, Pasaż 1 i Fragment 2) i Zidentyfikuj za pomocą cytometrii przepływowej (z przeciwciałem anty-CD31).
  2. Wyznakowane izolowane pAEC (numer komórki: 1 x 105) (dzień 3, pasaż 1 i pasaż 2) za pomocą przeciwciała sprzężonego z izotiocyjanianem CD31-fluoresceiny (FITC) przeciwko świniom (10 μl przeciwciała na 100 μl komórek, barwione przez 30 minut w temperaturze 4 °C) do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  3. Bramka całkowita populacji żywych komórek z poletkiem rozproszonym do przodu, niebarwiona próbka jako kontrola ujemna. Następnie przedstaw komórki CD31-dodatnie komórek bramkowanych z histogramem.
    UWAGA: Skuteczność komórek CD31-dodatnich wynosi odpowiednio 97,4% ± 1,2% (dzień 3), 94,4% ± 1,1% (P1) i 92,4% ± 1,7% (P2) (średnia ± SD) (Figura 3B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasza metoda ma na celu zapewnienie skutecznego sposobu izolacji wysokiej czystości komórek śródbłonka (ECs) z aorty minipigów. Proces operacji aorty przedstawiono na Ryc. 1. Pierwszym krokiem jest wycięcie całej aorty ze świni. Bardzo ważne jest zapobieganie kontaminacji innymi komórkami lub bakteriami. W związku z tym należy unikać uszkadzania innych organów lub tkanek, aby nie doprowadzić do zanieczyszczenia aorty niepożądanymi komórkami lub bakteriami, a następnie przemyć aortę trzy razy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki śródbłonka są powszechnie wykorzystywane w badaniach nad dysfunkcją naczyń krwionośnych, cukrzycą, regeneracją tkanek, transplantacją i nowotworami 14,15,16,17,18. Aby zrozumieć i scharakteryzować biologię i funkcję EC w tych chorobach, opisano liczne metody izolowania EC różnych chorych narządów lub tkanek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong, numer grantu/nagrody: 2016A030313028; Fundacja Medycznych Badań Naukowych Prowincji Guangdong, numer grantu/nagrody: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, numer grantu/nagrody: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 i JCYJ20160428142040945; Fundacja Nauki i Technologii Dystryktu Shenzhen Longhua, numer grantu/nagrody: 2017013; Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin, numer grantu/nagrody: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine w Shenzhen, numer grantu/nagrody: SZSM201412020; Specjalne fundusze na budowę szpitali wysokiego szczebla w prowincji Guangdong (2019 r.); Fundusz na rzecz Budowy Dyscypliny Medycznej Wysokiego Szczebla w Shenzhen, numer grantu/nagrody: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, numer grantu/nagrody: SZXJ2017021 i SZXJ2018059. Dziękujemy Hancheng Zhang i Zhicheng Zou z Uniwersytetu w Shenzhen za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD FACSAria IIBD Bioscience
BoneforcepsPekin HeLi KeChuang Technology Development CO., Ltd. ChinyHL-YGQ   
Jednorazowa strzykawka BOON (10 ml)Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. Chiny
przeciwciałoBio-RadMCA1746F
Skrobak do komórekCorning 3010#
Kolagenaza IVSigma-AldrichC5138#-1G
Związek ketaminy do wstrzykiwań Weterynaryjna fabryka farmaceutyczna w Shenyang, ChinyChlorowodorek ketaminy?0,3 g / 2 ml, chlorowodorek ksylazyny: 0,3 g / 2 ml, chlorowodorek fenacetyny?1 mg / 2 ml
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Life TechnologiesD1306#
DMEMLife Technologies11965118#
ECMSciencell1001#
ECGSSciencell1052#
Eppendorf Mikroprobówka zatrzaskowa (1.5 ml) AXYGENMCT-150-C#
Falcon 100mm Naczynie do hodowli komórkowychCorning353003#
Surowica bydlęcapłodu GIBCO10270-106#
Kleszcze Flowjo v10.0
 Instrumenty medyczne ShangHai Co., Ltd. Chiny
Heparyna sodowaJiangsu WanBang biopharmaceutical Co., Ltd. Chiny
Nalewka jodowaGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd. Chiny
Miniaturowa świnia (Bama lub Wuzhishan)Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, Chiny
Mikroskop Mshot Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.M152
Szalki Petriego (150 x 15 mm)Biologixgroup66-1515#
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15070063#
Prostokątna kolba do hodowli komórek z szyjką skośną z nasadką odpowietrzającą ? Zobacz materiał T25?Corning 3289#
NożyczkiInstrumenty medyczne ShangHai Co., Ltd. Chiny
Serologiczne pipety transferowe (10 ml)JET BiofilGSP010010# 
Sterylna pipeta PasteuraGeneBrickGY0025#
Sterylny filtr strzykawkowy (0,22 i mikro; m)MilliporeSLGV033RS#
Skalpel chirurgicznyShangHai medical instruments Co., Ltd.China22#
Szew chirurgicznyShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd5-0#
Strzykawka?5mL?Shengguang Medical Instrument Co., Ltd. Chiny
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGIBCO25200056#
75% Alkohol medycznyGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
20 x roztwór PBS (pH 7,4, bez nukleaz)Sangon BiotechB540627#
Medyczny środek dezynfekujący 84 płynProwincja Syczuan Yijieshi Medical Technology Co., Ltd450 ml / butelkę
CD31-FITC

Bibliografia

  1. Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
  2. Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
  3. Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
  4. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
  5. McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
  6. Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
  7. Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
  8. Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
  9. Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953(2015).
  10. Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024(2017).
  11. Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
  12. Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
  13. Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
  14. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  15. Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
  16. Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
  17. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  18. Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
  19. Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412(2013).
  20. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  21. Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
  22. Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400(2018).
  23. Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
  24. Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
  25. Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
  26. Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287(2016).
  27. Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
  28. Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
  29. French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
  30. Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
  31. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aorta minipig wtrawienie kolagenaz IVizolacja kom rek r db onkaanaliza cytometrycznabarwienie przeciwcia ami anty CD31technika skrobania kom rekbadania nad ksenotransplantacjnaczyniowe kom rki r db onkaekspansja kultur kom rkowych
Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka aorty od miniaturowych świń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.