Artykuł metodologiczny

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59674

⸱

15 lipca 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Streszczenie

Prezentujemy tutaj użycie mikroskopii sił atomowych do wcinania tkanek roślinnych i odzyskiwania ich właściwości mechanicznych. Używając dwóch różnych mikroskopów w trybie wgłębień, pokazujemy, jak zmierzyć moduł sprężystości i wykorzystać go do oceny właściwości mechanicznych ściany komórkowej. Ponadto wyjaśniamy również, jak ocenić ciśnienie turgoru. Głównymi zaletami mikroskopii sił atomowych jest to, że jest nieinwazyjna, stosunkowo szybka (5 ~ 20 min) oraz że praktycznie każdy rodzaj żywej tkanki roślinnej, która jest powierzchownie płaska, może być analizowany bez konieczności leczenia. Rozdzielczość może być bardzo dobra, w zależności od rozmiaru końcówki i liczby pomiarów na jednostkę powierzchni. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że daje ona bezpośredni dostęp tylko do powierzchownej warstwy komórek.

Wprowadzenie

Mikroskopia sił atomowych (AFM) należy do rodziny mikroskopii z sondą skanującą (SPM), gdzie końcówka o promieniu zwykle kilku nanometrów skanuje powierzchnię próbki. Wykrywanie powierzchni nie odbywa się za pomocą metod optycznych lub opartych na elektronach, ale za pomocą sił oddziaływania między końcówką a powierzchnią próbki. Technika ta nie ogranicza się więc do topograficznej charakterystyki powierzchni próbki (rozdzielczość 3D, która może spaść do kilku nanometrów), ale pozwala również na pomiar dowolnego rodzaju sił oddziaływania, takich jak elektrostatyczne, van der Waalsa czy siły kontaktowe. Ponadto końcówka może być używana do przykładania sił na powierzchni próbki biologicznej i pomiaru powstałego odkształcenia, tzw. "wgłębienia", w celu określenia jej właściwości mechanicznych (np. modułu Younga, właściwości lepkosprężyste).

Właściwości mechaniczne ścian komórkowych roślin są niezbędne do uwzględnienia przy próbie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw procesów rozwojowych1,2,3. Rzeczywiście, właściwości te są ściśle kontrolowane podczas rozwoju, w szczególności dlatego, że zmiękczenie ściany komórkowej jest wymagane, aby umożliwić komórkom wzrost. AFM może być używany do pomiaru tych właściwości i badania sposobu, w jaki zmieniają się one między narządami, tkankami lub etapami rozwoju.

W tym artykule opisujemy, jak używamy AFM do pomiaru zarówno właściwości mechanicznych ściany komórkowej, jak i ciśnienia turgoru. Te dwa zastosowania zostały zademonstrowane na dwóch różnych mikroskopach AFM i zostały szczegółowo opisane poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1.Pomiar właściwości mechanicznych ściany komórkowej

UWAGA: Przedstawiono przykład rozwijającego się gynoecjum Arabidopsis.

  1. Przygotowanie próbek biologicznych
    1. Należy zebrać zamknięty pączek kwiatowy w stadium 9 lub 10 (o długości około 0,5 mm), zgodnie z opublikowaną metodą określania stadiów rozwoju Arabidopsis.4Pod binokularem, używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie otwórz pąk, aby sprawdzić etap rozwoju i pobrać gynoecjum znajdujące się w centrum kwiatu.
    2. Umieść gynoceum na dwustronnej taśmie klejącej przyklejonej do środka pokrywy małej szalki Petriego (o średnicy 5 cm).
      UWAGA: Alternatywnie, w celu bardziej wydajnej immobilizacji próbki podczas wgniatania, można zastosować klej biokompatybilny.
    3. Szybko dolej wodę, aż próbka zostanie całkowicie przykryta. Zapobiega to odwodnieniu i zmniejsza przyleganie końcówki do próbki. Alternatywnie można zanurzyć próbkę w medium ciekłym, np. w pożywce do hodowli wierzchołkowej Arabidopsis.5.
  2. Kalibracja AFM
    1. Wyznacz stałą sprężystości wspornika k wystarczająco wysoka, aby umożliwić odkształcenie powierzchni próbki do pożądanej głębokości wcięcia, lecz nie na tyle wysoka, aby uniknąć utraty czułości.
      UWAGA: Przyjmując ogólną zasadę, jeżeli znany jest moduł Younga próbki, rząd wielkości stałej sprężystości można dobrać jako k≈E * δgdzie δ jest pożądanym wcięciem.
    2. Użyj an R = końcówka o przekroju sferycznym o promieniu 40 nm z 15 µm odległość końcówka-dźwignia
      UWAGA: Promień końcówki jest bezpośrednio powiązany z rozdzielczością boczną. Ogólnie, w przypadku indentacji materiałów biologicznych, należy wybierać końcówki zaokrąglone (R (powyżej 10–20 nm) lub sondy koloidalne. Małe sondy koloidalne mogą być trudne w użyciu ze względu na niewielką odległość między końcówką a ramieniem (cantileverem), która może prowadzić do kontaktu z powierzchnią próbki.
    3. Włącz oprogramowanie i ustaw głowicę poziomo co najmniej 2–3 h przed eksperymentem: pozwoli to głowicy na termalizację i zapobiegnie termicznie indukowanym ruchom względnym między wspornikiem a laserem. Jeśli mikroskop jest wyposażony w moduł CellHesion (rozszerzający dostępny zakres piezoelektryka w osi Z do 100 µm zamiast 15 µm), najpierw włącz sterownik, a następnie podczas uruchamiania oprogramowania wybierz tryb CellHesion.
    4. Zamocuj wspornik na szklanym bloku, a następnie zamocuj blok na głowicy. Na końcówkę nanieś kroplę kilku mikrolitrów wody ultraczystej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas zanurzania końcówki w wodzie.
    5. Umieść twardą próbkę (oczyszczone szkiełko przedmiotowe lub szafir) i dodaj 30-50 µL wody ultrapure.
      UWAGA: Opisana tutaj procedura kalibracji jest czasami nazywana kalibracją kontaktową. W pierwszej kolejności wykonuje się krzywą siły na sztywnej i płaskiej powierzchni, a następnie rejestruje widmo oscylacji wzbudzonego termicznie wspornika w celu obliczenia stałej sprężystości. Istnieją inne protokoły kalibracji, które zostaną krótko omówione w akapicie dyskusyjnym.
    6. Umieść głowicę na stoliku (pamiętając o odpowiednio wysokim podniesieniu silników osi Z). Korzystając z obrazu optycznego, wstępnie ustaw laser na ramieniu wspornika.
      1. Przesuń laser wzdłuż głównej osi wspornika, monitorując sygnał sumaryczny na fotodiodzie.
        UWAGA: W przypadku zastosowania standardowych wsporników należy uzyskać sumę większą niż 0,5 V.
      2. Przesuń laser w przeciwnym kierunku i zmaksymalizuj sygnał sumaryczny, aby ustawić laser w centrum wspornika. Pozwoli to zminimalizować przesłuchy między ugięciem bocznym a pionowym.
    7. Pomiar czułości ugięcia
      UWAGA: Fotodioda odczytuje przemieszczenie lasera i generuje sygnał wyrażony woltach. Aby móc mierzyć odgięcie w jednostkach metrycznych, należy wyznaczyć czułość odgięcia.
      1. Ustaw instrument w Kontakt → Spektroskopia siłUstaw a Względna wartość zadana do 2 V, długość Z Proszę podać tekst do przetłumaczenia. 0.5 µmoraz Zwiększenie prędkości Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. 2 µm/s (Częstotliwość próbkowania do 10 0 Hz) i wybrać Pętla zamknięta.
      2. Otwórz Menedżer kalibracji następnie należy wybrać odcinek kontaktu na krzywej siły (który powinien być liniowy), aby wykonać dopasowanie liniowe: odwrotność nachylenia prostej pozwala wyznaczyć czułość ugięcia. W ten sposób odczyt fotodiody zostaje skalibrowany w jednostkach metrycznych.
    8. Wyznaczanie stałej sprężystościW Menedżer kalibracjiwybierz Stała sprężystości w celu przeprowadzenia akwizycji widma termicznego. Aby uśrednić sygnał przez dłuższy czas, należy wybrać symbol ∞. Widmo mocy termicznie wzbudzonego wspornika może wykazywać kilka pików; należy zaznaczyć obszar wokół piku o najniższej częstotliwości, aby go dopasować.
      UWAGA: Jeśli strojenie termiczne zostanie wykonane w cieczy, peak rezonansowy będzie szerszy, a jego częstotliwość niższa w porównaniu z częstotliwością nominalną.
  3. Konfiguracja eksperymentu i akwizycja danych w spektroskopii sił
    1. Umieść próbkę na stoliku AFM i ustaw głowicę nad próbką.
      UWAGA: Należy upewnić się, że głowica została wystarczająco wycofana, aby uniknąć twardego kontaktu końcówki z powierzchnią próbki.
    2. Pozostawć wspornik do termalizacji przez kilka minut.
    3. W QI tryb, podejście z Wartość zadana siła 50 nN.
    4. Ustaw długość Z na 4 µm oraz obszar skanowania do 80 x 80 µm2 z liczbą pikseli wynoszącą 40 x 40. W Zaawansowane ustawienia obrazowania panel, ustaw tryb na stałą prędkość. Ustaw prędkość wysuwania i wsuwania na 200 µm/s i Częstotliwości próbkowania do 25 kHz.
    5. Rozpocznij skanowanie, wykorzystując ten szybki tryb skanowania z niską siłą nacisku, aby sprawdzić, czy próbka się nie przemieszcza. Upewnij się, że skanowany obszar jest wolny od zanieczyszczeń lub odchylonych komórek, a następnie zlokalizuj jak najbardziej płaski obszar zainteresowania w celu przeprowadzenia pomiarów.
      UWAGA: Aby ocenić rzeczywiste nachylenie próbki, niwelację linii należy ustawić na WYŁ. lub do StałaZbyt duży kąt nachylenia osi wgłębienia względem powierzchni wpłynie na zmierzoną wartość modułu Younga.5.
    6. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania należy wybrać region o rozmiarze od 40 x 40 do 60 x 60 µm2 wokół niego i zwiększyć liczbę pikseli do poziomu 2 pikseli/µmZwiększyć Wartość zadana do 50 nm, aby uzyskać wgłębienie o głębokości 10–20 nm. Jeśli to konieczne, dostosuj tę wartość na początku eksperymentu. Zmniejsz długość Z do 2 µmZmniejszyć prędkość wysuwania i chowania do 100 µm/s i zwiększyć Częstotliwość próbkowania do 50 kHz.
    7. Rozpocznij skanowanie i zapisz wynik (zazwyczaj składający się z obrazu i pliku danych).
    8. Na koniec dnia pomiarowego należy wyjąć uchwyt końcówek i delikatnie opłukać go wodą ultrapurystyczną oraz 70% EtOH.
    9. Osuszyć i wyjąć wspornik. W przypadku dalszych eksperymentów z użyciem tej samej końcówki należy rozważyć jej oczyszczenie zgodnie z protokołem czyszczenia na mokro, a jeśli to możliwe, dodatkowo za pomocą plazmy O2.2 obróbki. Nie dopuszczaj do wyschnięcia wody na wsporniku i/lub uchwycie końcówki, aby uniknąć krystalizacji soli.
  4. Analiza danych (dla oprogramowania Data Processing w wersji 6.x)
    1. Otwórz oprogramowanie Data Processing i załaduj plik Data.
    2. Kliknij w Użyj tej mapy do przetwarzania wsadowego przycisk, aby zastosować te same parametry analizy do wszystkich krzywych na mapie.
    3. W Załaduj zdefiniowany proceswybierz dopasowanie Hertzowe.
    4. Użyj pierwszej karty, aby zweryfikować lub zmienić parametry kalibracji.
    5. W drugiej zakładce usuń przesunięcie (lub przesunięcie wraz z nachyleniem) z linii bazowej, aby ustawić jej wartość średnią na 0.
    6. W trzeciej zakładce należy oszacować położenie punktu kontaktu (POC), przyjmując go za pierwszy punkt, w którym siła przecina wartość 0 podczas schodzenia z wartości zadanej wzdłuż krzywej wysuwania.
    7. Karta Pozycja pionowa końcówki oblicza ruch końcówki poprzez odjęcie ugięcia wspornika od zmierzonej wysokości. Na tym etapie należy użyć Wysokość niewygładzona (surowe dane) dla następującego dopasowania, zaznaczając odpowiednie pole wyboru.
    8. W Dopasowanie sprężystości zakładka, należy wybrać odpowiedni model dopasowania. Jeśli na krzywych wycofania nie obserwuje się adhezji lub jest ona słaba (odpowiada mniej niż 10% wartości zadanej siły lub maksymalnej średniej sile na wybranej głębokości wgniatania), to Typ modelu należy ustawić na Hertz/Sneddon i zastosować funkcję extend curve. W przypadku silniejszej adhezji należy preferować model DMT (Derjaguin-Muller-Toporov), a dopasowanie powinno być przeprowadzone na krzywych wycofania (szczegóły dotyczące dostępnych modeli kontaktu i powiązanych z nimi wzorów znajdują się w instrukcji).
      1. Ustaw parametry geometryczne końcówki w oparciu o jej nominalny kształt. W tym przypadku: Kształt końcówki jest sferą i Promień końcówki wynosi 40 nm.
      2. Ustawić Współczynnik Poissona do 0,5, zgodnie z przyjętą konwencją dla materiałów biologicznych (co odpowiada materiałowi nieściśliwemu).
    9. Dopasowanie do konkretnego wcięciaDomyślnie dopasowanie jest wykonywane dla całej krzywej. Jeśli dopasowanie musi zostać przeprowadzone do konkretnego wcięcia, należy najpierw sprawdzić Krzywa przesunięcia pole wyboru; spowoduje to przesunięcie początku krzywej na podstawie nowo wyznaczonych wartości linii bazowej i POC.
      1. Dodaj drugą Dopasowanie sprężystości procedurę, klikając ikonę w głównym oknie.
      2. Ponownie ustaw wszystkie parametry dopasowania i określ w X min pożądanego wcięcia. Należy dodać tyle kroków, ile jest koniecznych (powinno wystarczyć od 2 do 3 kroków), aby doprecyzować wyznaczenie pozycji POC, a w konsekwencji obliczoną głębokość wcięcia. Na tym etapie proces można zapisać.
    10. Kliknij Zachować i zastosować do wszystkich aby powtórzyć poprzednie kroki dla wszystkich krzywych na mapie.
    11. Zapisz wyniki. Uzyskany zostanie obraz oraz pliki w formacie .tsv.

2. Pomiar ciśnienia turgorowego

UWAGA: Przedstawiono przykład merystemu kwiatostanu Arabidopsis traktowanego oryza lina.

  1. Przygotowanie próbki biologicznej
    1. Pobrać merystem kwiatostanu (IM) Arabidopsis traktowany oryzalną, lekiem depolimeryzującym mikrotubule, z rośliny in vitro hodowanej na pożywce zawierającej inhibitor polarnego transportu auksyny, kwas 1-N-naftylftalamowy (NPA), zgodnie z opublikowaną metodą.6.
    2. Montowanie próbki IM zgodnie z jedną z dwóch opcji
      1. Do monitoringu długoterminowego: umieść próbkę w szalce Petriego zawierającej pożywkę do hodowli wierzchołków Arabidopsis (ACM)7,8 oraz 0,1% roztworu konserwującego rośliny (PPM), aby zapobiec kontaminacji. Zawiesić końcówkę mikroelektrody (IM) nad powierzchnią medium ACM i ustabilizować podstawę mikroelektrody kroplą 2% agarozy.
      2. W przypadku pomiarów z szybką wymianą roztworów: umieść próbkę w szalce Petriego na małym kawałku masy klejącej, a następnie szybko uszczelnij szczelinę między masą a podstawą próbki za pomocą biokompatybilnego kleju. Odczekaj do utwardzenia się kleju (mniej niż 2 min), a następnie zanurz próbkę w ciekłym ACM zawierającym 0,1% PPM.
        UWAGA: Upewniając się podczas mocowania podstawy próbki, że powierzchnia próbki nie jest pokryta agarozą ani klejem. Pomiar turgoru za pomocą AFM wymaga stabilnego zamocowania próbki, a wcześniej opisane metody montażu zapewniają odpowiednią stabilność. W zależności od rodzaju próbki można zastosować inne metody mocowania, takie jak taśma dwustronna, poli-lizyna itp.
  2. Kalibracja AFM
    1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji AFM i wybierz PeakForce QNM (duża amplituda) tryb pomiaru
    2. Przeprowadź kalibrację zgodnie z zasadą opisaną w krokach od 2.1 do 2.6.
    3. W Sprawdź parametry okno, zestaw Wielkość skanu do 0. W Rampa okno, zestaw Rozmiar rampy między 20 nm a 50 nm, Próg wyzwalania od 2 V do 5 V i Liczba próbek do 2048 lub więcej.
    4. Ustaw końcówkę wspornika w linii z próbką kalibracyjną i kliknij Metoda.
    5. W razie kontaktu przejść do Rampa okno i kliknij przycisk Ciągła rampaW zakresie liniowym krzywej wyznacz nachylenie, klikając w Aktualizacja czułości przycisk. Powtórzyć pomiar czułości wychylenia kilka razy, a następnie ręcznie zaktualizować kalibrację, wprowadzając średnią z pomiarów po otwarciu karty Detektor z menu Kalibracja.
    6. Wycofać głowicę AFM i wyjąć próbkę kalibracyjną.
      UWAGA: Zaleca się całkowite wycofanie głowicy AFM poprzez wybranie odpowiedniej karty. Etap → Inicjalizacja aby zapobiec przypadkowemu twardemu kontaktowi podczas wymiany próbki.
  3. Konfiguracja eksperymentu i akwizycja danych w spektroskopii sił
    1. Jeśli próbka nie jest jeszcze zanurzona, należy ją zanurzyć w ciekłym ACM zawierającym PPM.
    2. W oprogramowaniu akwizycyjnym należy określić parametry pomiaru w następujący sposób:
      1. W Sprawdź parametr okno, zestaw Stała sprężystości do fabrycznej stałej sprężystości wspornika lub wyznaczonej stałej sprężystości zgodnie z krokiem 2.8. W niniejszym przykładzie ustawiono ją na 42 N/m.
      2. Zestaw Promień końcówki do 400 nm w tym przykładzie.
      3. Zestaw Próbka współczynnika Poissona do 0,5, ponieważ woda przyczynia się głównie do ciśnienia turgorowego.
      4. Zestaw Próbka/Linia do 128, aby zapewnić szybką akwizycję.
      5. Zestaw Szybkość skanowania do 0,2 Hz.
      6. Zestaw Rozmiar skanowania Proszę podać tekst do przetłumaczenia. 1 µm.
        UWAGA: Ustawienie niskiej prędkości skanowania oraz niewielkiego obszaru skanowania może skutecznie zapobiec uszkodzeniu próbki wywołanemu skanowaniem AFM. Zaleca się zmniejszenie tych dwóch parametrów przy każdej zmianie próbki.
      7. W Rampa okno, zestaw Wielkość rampy Proszę podać tekst źródłowy, który mam przetłumaczyć. 5 µm.
        UWAGA: Zaleca się ustawienie rozmiaru rampy większego niż zamierzona głębokość wgłębienia w celu lepszego pozyskania linii bazowej.
      8. Zestaw Próg wyzwalania do maksimum.
      9. Zestaw Liczba próbek do 4608.
      10. Opcjonalnie w Mikroskop → Parametry kontaktu zakładka, zmniejszyć następujące parametry, aby zapobiec silnym uszkodzeniom próbki wywołanym kontaktem. Ustawić Wartość zadana Peak Force Engage do 0,3 V (domyślnie 0,5 V). Ustawić Wzmocnienie wzmocnienia wewnętrznego do 0,5 (domyślnie 0,75). Ustaw Krok zazębiania SPM Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 4 µm Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiału na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej oraz naturalnego stylu protokołów naukowych. 15 µm).
    3. Umieść i wyrównaj próbkę pod głowicą AFM, a następnie zbliż ją, aż wspornik zostanie zanurzony, ale nie będzie stykał się z powierzchnią próbki.
      UWAGA: Podczas zbliżania należy delikatnie dmuchać na powierzchnię ciekłego ACM, aż do utworzenia się mostka cieczowego między belką a powierzchnią cieczy. Zapobiega to zazwyczaj twardemu kontaktowi.
    4. Ostrożnie zbliż sondę do próbki. Gdy sonda znajdzie się w niewielkiej odległości od powierzchni próbki, kliknij Metoda.
    5. Po nawiązaniu kontaktu stopniowo zwiększać Wielkość skanu i/lub Szybkość skanowania aż do uzyskania pożądanego stanu równowagi, nie uszkadzając próbki i/lub wspornika.
      UWAGA: Wielkość obszaru skanowania jest ograniczona przez krzywiznę i chropowatość powierzchni próbki. W przypadku IM poddanych działaniu oryzaliny, 50 x 50 µm2 Skanowanie obszaru można przeprowadzić przy częstotliwości skanowania wynoszącej 0,3 Hz.
    6. Podczas skanowania należy sprawdzić, czy obszar pomiarowy jest ustawiony prawidłowo. W razie potrzeby należy go zmienić. Po uzyskaniu satysfakcjonującego ustawienia należy kliknąć przycisk. Kieruj i fotografuj aby uruchomić okno point-and-shoot.
    7. Przed rozpoczęciem rejestracji skanu należy wybrać odpowiedni kanał obrazowania, który ułatwi wyraźną identyfikację konturów komórek. Często odpowiednie są kanały: Peak force error, DMT Modulus, LogDMT Modulus lub Dissipation. Należy określić katalog zapisu oraz nazwę pliku, a następnie kliknąć Rampa w następnym skanie aby rozpocząć nagrywanie.
      UWAGA: Po wybranej nazwie pliku zostanie automatycznie dodany ciąg składający się z kropki i trzech cyfr (np. .0). Numer ten zwiększa się automatycznie o 1 przy każdym powtórzeniu zapisanego skanu.
    8. Po zakończeniu skanowania interfejs oprogramowania zostanie automatycznie przekierowany do Rampa okno. Kliknij w zeskanowany obraz, aby określić miejsca do wykonania wcięć.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem rejestracji wgnieceń zaleca się wybranie kilku punktów orientacyjnych w celu wykonania kliknięciem wgnieceń próbnych. Wyłącznie rampa, w przypadku gdy wymagana jest zmiana parametrów (dla Rozmiar rampy, pozycja piezoelektryka, itp.). Głębokość wcięcia musi być większa niż grubość ściany komórkowej (idealnie określona oddzielnie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej).
    9. Wybierz co najmniej trzy miejsca wgniatania na komórkę w pobliżu jej barycentrum i powtórz wgniatanie trzykrotnie w każdym miejscu. Pozwoli to uzyskać co najmniej dziewięć krzywych siły na komórkę do dalszej analizy. Po ustaleniu rozmieszczenia miejsc wgniatania kliknij Rampa i przechwytywanieKrzywe siła-wgłębienie są automatycznie zapisywane w wyznaczonym katalogu.
    10. Po zakończeniu skanowania ramp należy przenieść się w inne miejsce w celu pomiaru kafelka lub wycofać głowicę skanującą i zmienić próbkę.
    11. Po zakończeniu należy oczyścić wspornik zgodnie z opisem w krokach 1.3.8 i 1.3.9.
  4. Analiza danych
    1. W oprogramowaniu analitycznym otwórz plik *.mca. Wyświetli on położenie każdej krzywej siły na obrazie skanowanym. W razie potrzeby dokonaj wstępnego wyboru krzywych siły do analizy.
    2. Otwórz jedną krzywą siły przeznaczoną do analizy, zazwyczaj w formacie x00y.0zgdzie x to określona nazwa pliku w katalogu zapisu, natomiast y i z to automatycznie rejestrowane numery oznaczające kolejność wcięcia oraz numer skanu.
    3. Kliknij Korekcja linii bazowej przycisk i przeciągaj niebieskie linie przerywane na krzywej siły, aż Rozszerzenie początkowej linii bazowej źródła i Wydłużenie linii bazowej źródła Stop wynoszą odpowiednio 0% i 80%. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
      UWAGA: Alternatywnie, Wydłużenie linii bazowej źródła Stop można ustawić na różne wartości, o ile nadal mieści się to w obrębie linii bazowej i nie wykracza poza punkt styku.
    4. Kliknij w Filtr prostokątny przycisk i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w celu wygładzenia krzywej siły.
    5. Kliknij Wcięcie przycisk
      1. W Proszę wprowadzić tekst do tłumaczenia. okno, ustawić Krzywa aktywna do Wydłużenie.
      2. Ustawić Metoda dopasowania do Model linearyzowany i Uwzględnij siłę adhezji Prześlij tekst źródłowy, który chcesz przetłumaczyć. Tak.
      3. Zestaw Maksymalna siła pasowania zaciskowego do 9% i Minimalna granica pasowania ciasnego do 75%.
      4. Zestaw Dopasowanie modelu Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Sztywność (Liniowy).
        UWAGA: Ta konfiguracja pozwoli na obliczenie sztywności pozornej k do wyznaczenia ciśnienia turgorowego. W tym przykładzie granice dopasowania odzwierciedlają dopasowanie sztywności na poziomie około 1.5 µm głębokość wciskania
    6. Krzywe siły można analizować seryjnie. Kliknij Historia uruchomień przycisk, określ katalog raportu i dodaj wszystkie pozostałe krzywe siły, które wymagają takiej samej obróbki. Po zakończeniu kliknij UruchomienieDomyślnie dopasowanie zostanie zapisane jako plik *.txt.
    7. Kiedy k czy partia jest dopasowana, kliknij Historia → 5 Wcięcia aby powrócić do okna wcięcia.
      1. Zmiana Maksymalna granica pasowania na wcisk do 10% i Minimalna granica pasowania ciasnego do 0%.
      2. Zestaw Dopasowanie modelu do Hercowski (Sferyczny).
        UWAGA: Operacja ta pozwoli obliczyć moduł Younga ściany komórkowej E do wyznaczenia ciśnienia turgorowego. W tym przykładzie granice dopasowania odzwierciedlają dopasowanie hercjanowskie (z użyciem sondy sferycznej) na poziomie około 0.4 µm głębokość wgniecenia
    8. Powtórz krok 2.4.6 dla dopasowania wsadowego (batch fit) dla E.
    9. Otwórz plik *.0z (gdzie z jest automatycznie zarejestrowanym numerem skanu), aby wyświetlić poszczególne kanały skanowania. W Wzrost okno kanału, kliknij Sekcja przycisk. Pozwoli to na pomiar krzywizny powierzchni próbki, co jest niezbędne do obliczenia ciśnienia turgorowego.
      1. Narysuj linię wzdłuż długiej osi jednej komórki, przesuń granice linii przerywanej do krawędzi komórki i zapisz Promień wartość r1Powtórz tę czynność dla osi krótkiej w celu wyznaczenia promienia. r2Obliczenie średniej krzywizny powierzchni komórki κM oraz krzywizna Gaussa κG stosując pomiar dwóch promieni w następujący sposób:
        równanie κM dla rezystorów szeregowych w fizyce; wyświetlanie wzoru dla analizy elektrycznej. i Równanie przewodności w gazie, wzór: kG=1/(r1*r2), istotne dla badań z zakresu fizyki. 
    10. Wyznaczanie ciśnienia turgorowego P przy użyciu opublikowanego modelu cienkiej powłoki9 w następujący sposób:
      Równanie równowagi statycznej: P=4Et²κᵢ²/3f; złożony wzór matematyczny; zastosowanie edukacyjne. 
      z
      Wzór matematyczny dla równowagi statycznej w układach mechanicznych, przedstawiający równanie stanu równowagi.
      gdzie t to grubość ściany komórkowej wyznaczona np. za pomocą mikroskopii elektronowej.
      UWAGA: Wyznaczanie ciśnienia turgorowego jest procesem dopasowującym, który wymaga wielokrotnych iteracji. Zazwyczaj cztery iteracje pozwalają na uzyskanie stabilnego wyniku, jednak można przeprowadzić ich więcej (na przykład 10 razy).
    11. Obliczyć średnią E, k i P na komórkę. Należy również odnotować zmienność wewnątrzkomórkową (np. odchylenie standardowe) w celach dokumentacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A oraz Rysunek 1B przedstawiają zrzut ekranu ilustrujący wynik kroków od 1.3.4 do 1.3.6 protokołu, służących do zlokalizowania obszaru zainteresowania, w którym zostanie uzyskana mapa QI. Warto wspomnieć, że obszar zainteresowania wybrano tak, aby nie znajdował się on na powierzchni nachylonej (tj. był jak najbardziej płaski). Rzeczywiście, jak zauważyli Routier i wsp.5, jeśli oś wciśnięcia nie je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powstawanie kształtów u roślin jest determinowane głównie przez skoordynowane tempo i kierunek wzrostu w czasie i przestrzeni. Komórki roślinne są zamknięte w sztywnej ścianie komórkowej zbudowanej z macierzy polisacharydowej, która spaja je ze sobą. W konsekwencji ekspansja komórki jest kontrolowana przez równowagę między ciśnieniem turgorowym oddziałującym na ścianę komórkową a sztywnością ściany komórkowej stawiającej opór temu ciśnieniu. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podłoża rozwoju, istotna jest możliwość pomiar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować zespołowi PLATIM za wsparcie techniczne, a także Arezki Boudaoud i członkom zespołu Biophysic w laboratorium RDP za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka wzrostowa
1,000x roztwór podstawowyużywany do produkcji ACM, skład patrz Stanislas i wsp., 2017. Dodać do ACM po autoklawowaniu, przed nalaniem .
Kwas 1-N-Naftyloftalamowy (NPA)Sigma-Aldrich/Merck132-66-1dodać do pożywki Arabidopsis, 10 μM. Dodać po autoklawowaniu, przed rozlaniem.
Agar-agarSigma-Aldrich/Merck9002-18-0dodać do pożywki Arabidopsis, 1% w/v.
AgarozaMerck Millipore9012-36-6służy do wytwarzania stałego ACM, 0,8% w/v.
Arabidopsis podłożeDuchefa BiochimieDU0742.0025Do hodowli rzodkiewnika in vitro, 11,82 g/L.
Czterowodny azotan wapniaSigma-Aldrich/Merck13477-34-4dodać do pożywki Arabidopsis, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025Mieszanka soli podstawowej, używana do produkcji ACM, 2,2 g/L.
N6-benzyladenina (BAP)Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7używana do produkcji ACM, 555 nM. Dodać do ACM po autoklawowaniu, przed nalaniem .
OryzalinSigma-Aldrich/Merck19044-88-3do leczenia oryzalinem, 10 μ g/ml.
Mieszanina do konserwacji roślin (PPM)komórek roślinnychstosowana do wytwarzania ACM, 0,1% v/v. Dodaj do ACM po autoklawowaniu, przed nalewaniem.
Wodorotlenek potasuDuchefa Biochimie1310-58-3używany do produkcji pożywki Arabidopsis i ACM, oba o pH 5,8.
SacharozaDuchefa Biochimie57-50-1używana do produkcji ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFMBrukerAFM używany do pomiaru ciśnienia turgoru w tym protokole.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)AFM służy do pomiaru właściwości mechanicznych.
PatafixUHUD1620
Referencyjna struktura elastycznaNanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135biokompatybilny klej.
Końcówki sferyczne AFMNanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10Końcówki służące do pomiaru właściwości mechanicznych.
wimatyny Technologia

Bibliografia

  1. Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
  4. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  5. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
  6. Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
  7. Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
  8. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
  9. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  10. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
  11. Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
  12. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  13. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
  14. Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152(2017).
  15. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
  16. Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
  17. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
  18. Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
  19. Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
  20. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mechanika kom rek ro linnychpomiar ci nienia turgorowegoanaliza modu u spr ysto citryb wciskaniaanaliza krzywej si yunieruchomienie pr bkiobrazowanie tkanek ro linnychmodel Hertza

Powiązane artykuły