Artykuł metodologiczny

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

DOI:

10.3791/59677

⸱

14 maja 2019

 ,  ,  ,  , 
1Cancer Metastasis Laboratory, Department of Biomedicine, University of Basel and University Hospital Basel, 2SIB Swiss Institute of Bioinformatics

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty krwiopochodne odpowiadają za większość zgonów związanych z rakiem i obejmują krążące komórki nowotworowe (CTC), które skutecznie tworzą nowe guzy w odległych miejscach. CTC znajdują się w krwiobiegu pacjentów jako pojedyncze komórki (pojedyncze CTC) lub jako agregaty wielokomórkowe (klastry CTC i klastry CTC-białe krwinki), przy czym te ostatnie wykazują większą zdolność przerzutową. Poza wyliczeniem, analiza fenotypowa i molekularna jest niezwykle ważna dla analizy biologii CTC i identyfikacji podatnych na działania. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis przepływu pracy, który obejmuje barwienie immunologiczne i mikromanipulację CTC, hodowlę ex vivo w celu oceny zdolności proliferacyjnych i przeżywalności poszczególnych komórek oraz testy tworzenia przerzutów in vivo. Dodatkowo udostępniamy protokół umożliwiający dysocjację klastrów CTC na poszczególne komórki i badanie niejednorodności wewnątrz klastra. Dzięki tym podejściom, na przykład, precyzyjnie określamy ilościowo przeżywalność i potencjał proliferacyjny pojedynczych CTC i pojedynczych komórek w klastrach CTC, co prowadzi nas do obserwacji, że komórki w klastrach wykazują lepszą przeżywalność i proliferację w hodowlach ex vivo w porównaniu z pojedynczymi CTC. Ogólnie rzecz biorąc, nasz przepływ pracy oferuje platformę do analizy charakterystyki CTC na poziomie pojedynczej komórki. mające na celu identyfikację szlaków istotnych dla przerzutów i lepsze zrozumienie biologii CTC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kliniczna manifestacja przerzutów w odległych narządach reprezentuje końcowy etap progresji raka i odpowiada za ponad 90% zgonów związanych z rakiem1. Przejście od choroby zlokalizowanej do przerzutowej jest procesem wieloetapowym, w którym często pośredniczą krążące komórki nowotworowe (CTC)2,3,4. Komórki te są wydalane z guza pierwotnego do krążenia krwi i są transportowane do odległych narządów, gdzie mogą się wynaczynić i tworzyć zmiany przerzutowe5,6. Chociaż guzy lite mogą uwalniać stosunkowo dużą liczbę CTC, większość CTC jest skazana na śmierć z powodu dużych sił ścinających w krążeniu, śmierci komórek za pośrednictwem anoikis, ataku immunologicznego lub ograniczonych zdolności do przystosowania się do obcego mikrośrodowiska7. Dlatego tak ważne jest opracowanie narzędzi, które umożliwią analizę cech molekularnych tych CTC, które są wyposażone w zdolność do wysiewu przerzutów. Ostatnie badania przedkliniczne i kliniczne sugerują, że obecność i ilość pojedynczych CTC i klastrów CTC wiąże się z gorszym wynikiem u pacjentów z różnymi typami guzów litych8,9,10,11,12,13,14. Klastry CTC to grupy dwóch lub więcej CTC połączonych ze sobą podczas krążenia i są bardziej wydajne w tworzeniu przerzutów w porównaniu z pojedynczymi CTCs3,15,16. Komórki w klastrze utrzymują silną adhezję komórka-komórka poprzez połączenia desmosomów i adherenów, co może pomóc w przezwyciężeniu anoikis17,18. Ostatnio zaobserwowaliśmy, że grupowanie CTC jest związane z hipometylacją miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych związanych z macierzystą i proliferacją, co prowadzi do zwiększonej zdolności do skutecznego inicjowania przerzutów19. Dysocjacja klastrów CTC powoduje przebudowę kluczowych miejsc wiązania, a w konsekwencji zahamowanie ich potencjału przerzutowego19. Oprócz skupisk komórek nowotworowych, CTC mogą również łączyć się z białymi krwinkami (najczęściej neutrofilami) w celu utrzymania wysokiego poziomu proliferacji w krążeniu i zwiększenia ich zdolności do przerzutów20. Jednak biologia CTC jest zrozumiała tylko częściowo i kilka pytań pozostaje otwartych, w tym podstawowe cechy molekularne i podatności pojedynczych i zgrupowanych komórek.

W ostatnich latach ustalono kilka strategii, które wykorzystują wzorce ekspresji na powierzchni komórki, jak również właściwości fizyczne CTC do ich izolacji21,22,23,24,25. Metody izolacji zależnej od antygenu opierają się głównie na ekspresji cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych na powierzchni komórki (EpCAM)26. Najczęściej używaną i (obecnie) jedyną zatwierdzoną przez FDA platformą do liczenia CTC, jest system CellSearch, który opiera się na dwuetapowej procedurze izolacji CTCs21. W pierwszym etapie składniki osocza są usuwane przez wirowanie, podczas gdy CTC są wychwytywane za pomocą ferrofluidów magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami anty-EpCAM. W drugim etapie roztwór wzbogacony CTC jest barwiony pod kątem komórek jądrzastych (DAPI-dodatnich) eksprymujących cytokerynę (CK)8,18,19, podczas gdy białe krwinki (WBC) są identyfikowane za pomocą markera panleukocytów CD45. Na koniec wychwycone komórki umieszcza się na zintegrowanej platformie przesiewowej, a CTC identyfikuje się poprzez ekspresję EpCAM, CKs i DAPI, podczas gdy są ujemne dla CD45. Chociaż jest to uważane za złoty standard w liczeniu CTC, dalsza analiza molekularna jest wyzwaniem w przypadku tej technologii ze względu na nieodłączne ograniczenia w wyszukiwaniu CTC. Dodatkowo, biorąc pod uwagę procedurę izolacji, CellSearch może faworyzować wzbogacanie CTC o wyższe poziomy EpCAM w porównaniu z CTC o niższej ekspresji EpCAM, na przykład ze względu na heterogeniczność raka27 lub regulację w dół markerów nabłonkowych28,29. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, pojawiły się niezależne od antygenu technologie wzbogacania CTC. Na przykład CTC-iChip integruje hydrodynamiczną separację komórek jądrzastych, w tym CTC i WBC od pozostałych składników krwi, a następnie immunomagnetyczne zubożenie WBC znakowanych przeciwciałami, umożliwiając oczyszczanie nieoznakowanych i żywotnych CTC w solution25. Dodatkowo, fakt, że większość CTC jest nieco większa niż czerwone krwinki (RBC) lub WBC, doprowadził do opracowania technologii wzbogacania CTC opartych na rozmiarze23,30 (np. system Parsortix (ANGLE)), który wykorzystuje technologię opartą na mikroprzepływach, obejmującą zwężający się kanał w poprzek kasety separacyjnej, prowadzący komórki do końcowej przerwy 10, 8, 6,5 lub 4,5 μm (dostępne są różne rozmiary w zależności od oczekiwanej średnicy docelowych komórek nowotworowych). Większość komórek krwi przechodzi przez wąską szczelinę, podczas gdy CTC zostają uwięzione ze względu na swój rozmiar (ale także ze względu na mniejszą odkształcalność) i dlatego są zatrzymywane w kasecie. Odwrócenie kierunku przepływu umożliwia uwolnienie wychwyconych CTC, które są w stanie zdolnym do użycia i nadają się do dalszej analizy. Jednak niezależnie od wybranego protokołu izolacji CTC, typowe procedury po wzbogaceniu nadal dają CTC, które są mieszane ze stosunkowo niewielką liczbą krwinek czerwonych i krwinek czerwonych, co sprawia, że analiza czystych pojedynczych lub masowych CTC jest trudna. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy przepływ pracy, który umożliwia manipulację CTC bez potencjalnego odchylenia spowodowanego zanieczyszczeniami komórek krwi. Wcześniejsze dodanie barwienia immunologicznego ze zmiennymi kombinacjami przeciwciał odróżnia CTC od komórek krwi, a nawet pozwala zidentyfikować podgrupy CTC o różnych profilach ekspresji markerów powierzchniowych. Ta wysoce konfigurowalna procedura może być następnie dalej łączona z określonymi aplikacjami końcowymi.

Tutaj opisujemy przepływ pracy, który zaczyna się od produktu wzbogaconego CTC (uzyskanego za pomocą dowolnej technologii wzbogacania CTC) i łączy kilka podejść do uzyskania wglądu w biologię CTC w rozdzielczości pojedynczej komórki. Krótko mówiąc, nasz przepływ pracy umożliwia identyfikację pojedynczych CTC, klastrów CTC i klastrów CTC-WBC za pomocą barwienia immunologicznego na żywo, a następnie mikromanipulacji pojedynczymi komórkami i dalszej analizy przy użyciu protokołów hodowli ex vivo, sekwencjonowania pojedynczych komórek i testów przerzutów in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem próbek krwi od pacjentów były wykonywane za podpisaną świadomą zgodą uczestników. Procedury przeprowadzono zgodnie z protokołami EKNZ BASEC 2016-00067 i EK 321/10, zatwierdzonymi przez komisję ds. oceny etycznej i instytucjonalnej (Komisja ds. Etyki w północno-zachodniej/środkowej Szwajcarii [EKNZ]) oraz zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i kantonalnymi (zatwierdzony protokół mysi #2781, Kantonalny Urząd Weterynaryjny Bazylei).

1. Przygotowanie próbki pacjenta

  1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że pracujesz z roztworami i materiałami aseptycznymi, aby zachować sterylność podczas całej procedury.
  2. Pobrać 7,5 ml krwi obwodowej od pacjentki z rakiem piersi do probówki do pobierania krwi EDTA o pojemności 10 ml.
  3. Inkubować probówki zawierające krew przez krótki okres czasu (do 1 godziny) w temperaturze pokojowej (RT) na kołyszącym się wytrząsarce z prędkością 40 oscylacji na minutę (osc/min).
  4. Wzbogać dla pojedynczych CTC i klastrów CTC przy użyciu wybranej metody izolacji CTC21,22,23,25. Uwolnij CTC w 1x rozwiązaniu DPBS.
    UWAGA: W zależności od wybranej technologii wzbogacania CTC, mogą być obecne pozostałe białe krwinki i czerwone krwinki. Dostosuj ciśnienie zwalniania, aby zachować struktury klastrów CTC.
  5. Przejdź natychmiast do następnego kroku w sekcji 3.

2. Przygotowanie próbki myszy

  1. Przed rozpoczęciem należy przygotować strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml z igłą 25G, 5 ml roztworu z filtrem EDTA i probówkami do pobierania krwi EDTA o pojemności 2 ml.
  2. Upewnij się, że pracujesz z roztworami i materiałami aseptycznymi, aby zachować sterylność podczas całej procedury.
  3. Wstępnie umyć strzykawkę roztworem 5 mM EDTA.
  4. Naładować strzykawkę 100 μl 5 mM EDTA i usunąć pęcherzyki.
  5. Poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji gazowej 80% CO2 / 20% O2 i natychmiast przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Alternatywą dla metody inhalacji CO2 jest znieczulenie izofluranem (3% obj. izofluranu i tlen (gaz nośny) przy natężeniu przepływu 600 ml/min), po którym następuje zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie roztworu ketaminy/ksylazyny. Konkretna metoda eutanazji może się różnić w zależności od zatwierdzonego protokołu myszy.
  6. Potwierdź śmierć zwierzęcia poprzez brak aktywności oddechowej, brak odruchu rogówkowego i oddawanie moczu bez bodźców zewnętrznych.
  7. Wykonać nakłucie serca, ostrożnie wprowadzając igłę wstępnie załadowanej strzykawki EDTA pod kątem 30° do klatki piersiowej od mostka w kierunku serca.
    UWAGA: Dla niedoświadczonych eksperymentatorów zaleca się najpierw otwarcie jamy klatki piersiowej przed wykonaniem nakłucia serca, aby lepiej uwidocznić serce.
  8. Pobrać do 1 ml krwi. Nie zwalniając tłoka, wyciągnąć strzykawkę z klatki piersiowej zwierzęcia, bezpiecznie wyjąć igłę, otworzyć pokrywę probówki do pobierania krwi EDTA o pojemności 2 ml i wprowadzić krew bezpośrednio do środka. Zamknij pokrywę i odwróć rurkę 10x.
  9. Inkubować probówki zawierające krew przez krótki okres czasu (do 1 godziny) w temperaturze pokojowej na kołyszącym się wytrząsarce przy 40 osc/min.
    UWAGA: Igłę należy zutylizować w bezpiecznym miejscu utylizacji zagrożeń biologicznych.
    UWAGA: Możliwe jest wielokrotne nakłucie w celu zwiększenia całkowitej objętości krwi. Do różnych pobrań należy używać oddzielnych strzykawek wstępnie załadowanych EDTA, aby uniknąć zasysania zakrzepłej krwi obecnej w poprzedniej igle.
  10. Wzbogać dla pojedynczych CTC i klastrów CTC przy użyciu wybranej metody izolacji CTCs21,22,23,25. Uwolnij CTC w 1x rozwiązaniu DPBS.
    UWAGA: W zależności od wybranej technologii wzbogacania CTC, mogą być obecne pozostałe białe krwinki i czerwone krwinki. Dostosuj ciśnienie zwalniania, aby zachować struktury klastrów CTC.
  11. Przejdź natychmiast do następnego kroku w sekcji 3.
    UWAGA: Do wszystkich poniższych procedur należy upewnić się, że używana jest nieutrwalona i świeżo wyizolowana krew.

3. CTC na żywo barwienie immunologiczne

  1. Wirować zawiesinę komórek wzbogaconą w CTC o sile 72 x g przez 4 min.
    UWAGA: 72 x g odpowiada 800 obr./min, jeśli wirnik ma średnicę 100 mm. Przelicz liczbę g-force zgodnie z wirnikiem.
  2. Delikatnie zawiesić osad w 1% roztworze BSA w 1x DPBS i dodać 2 μg/ml przeciwciała anty-ludzkiego EpCAM-AF488 i 1 μg/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD45-BV605 lub 2 μg/ml mysiego przeciwciała CD45-BV605 w całkowitej objętości 500 μl.
    UWAGA: W przypadku CTC pochodzących od pacjentów z rakiem piersi, anty-ludzki EGFR-FITC i anty-ludzki HER2-AF488 mogą być dodawane dodatkowo do anty-EpCAM i anty-CD45. Pozwala to na lepszą identyfikację CTC, które wykazują niższy poziom EpCAM.
  3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
  4. Przemyć zawiesinę CTC za pomocą 1 ml 1% BSA w 1 roztworze DPBS i odwirować przy 72 x g przez 4 min. Powtórzyć to płukanie dwukrotnie.
  5. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 2 ml 1% BSA w 1x roztworze DPBS i przenieść całkowitą objętość do 1 dołka 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie.
  6. Inkubować płytkę przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, aby umożliwić sedymentację CTC i pozostałych komórek krwi.

4. Mikromanipulacja CTC i pobieranie pojedynczych komórek

UWAGA: Zanim zaczniesz, pamiętaj, że mikromanipulator potrzebuje do 45 minut na pełne przygotowanie. Po skonfigurowaniu procedura identyfikacji CTC i mikromanipulacji wymaga do 2 minut na komórkę (lub grupę).

  1. Upewnij się, że procedura pobierania CTC została zakończona w ciągu 2 godzin od zakończenia barwienia.
  2. Uruchom oprogramowanie mikromanipulatora i włącz mikromanipulator. Podłącz mikromanipulator do komputera i zainicjuj ramię robota oraz stolik mikroskopu, naciskając przycisk Połącz, a następnie urządzenie Int.
  3. Zamknij szafkę ochronną po każdej manipulacji maszyną, aby móc manewrować nią przez komputer.
  4. Oczyść powierzchnie z kurzu i rozlanych płynów, rozpylając etanol i wycierając wewnętrzne powierzchnie szafy. Czyste środowisko zapewni sterylność procesu.
  5. Zamontuj nową szklaną kapilarnę na ramieniu robota. Do pobierania jednokomórkowego należy użyć kapilary 20-30 μm, podczas gdy 30-50 μm jest preferowane do pobierania w klastrze CTC.
  6. Usuń wszystkie pęcherzyki znajdujące się w przewodach, dozując lub zasysając olej układowy.
    UWAGA: Szklana kapilara jest ostra i delikatna. Obchodź się ostrożnie.
  7. Napełnij zbiornik sterylizacyjny 1 70% etanolem, zbiornik sterylizacyjny 2 sterylnym H2O, a zbiornik buforowy sterylnym 1x DPBS.
    UWAGA: Nie zamykaj pokryw zbiorników, ponieważ podczas kolejnych kroków kapilara będzie musiała swobodnie uzyskać dostęp do zbiorników.
  8. Wysterylizuj kapilarę dwukrotnie 70% etanolem.
  9. Wymień zbiornik sterylizacyjny 1 na zbiornik 2 i umyj kapilar wH2Oco najmniej trzy razy, korzystając z funkcji sterylizacji.
  10. Korzystając z oprogramowania mikromanipulatora, rozpocznij nowy eksperyment i wybierz rodzaj eksperymentu pobierania między trybem wyboru automatycznego i ręcznego.
    UWAGA: Wybierz typ eksperymentu na podstawie punktu końcowego manipulacji. Tryb ręczny umożliwia manewrowanie ramieniem robota po wejściu kapilary w zawiesinę komórki. Ten krok jest niezbędny do dysocjacji klastrów CTC na poszczególne komórki. Istnieje możliwość zmiany rodzaju kompletacji w trakcie eksperymentu.
  11. Skonfiguruj tacę pokładową, określając położenie zbiornika sterylizacyjnego (ciecz 1), zbiornika buforowego (ciecz 2) i tacki depozytowej (cel 1 lub 2). Cel 1 pozwala na deponowanie na płytkach, cel 2 pozwala na wstawianie do probówek PCR lub płytek PCR.
  12. Ustaw temperaturę wybranych zbiorników na ciecz i tacki depozytowej na 4 °C.
    UWAGA: Proces kompletacji może być czasochłonny. Dlatego zaleca się chłodzenie zbiorników cieczy i tacy depozytowej
  13. Umieść bardzo niską płytkę mocującą zawierającą uwolniony roztwór CTC pod mikroskopem wewnątrz szafki mikromanipulatora. Zdejmij pokrywę z talerza i zamknij szafkę. Trzymaj płytkę w pozycji RT przez resztę konfiguracji i podczas procedury kompletacji.
  14. Ręcznie wybierz obiektyw mikroskopu do wyboru (10-20x) i czas ekspozycji wszystkich niezbędnych kanałów (kanały Brightfield, FITC i TRITC).
  15. Wybierz nawigator pokaż studnię z paska narzędzi, aby zwizualizować i wybrać typ płytki odbiorczej (płytka 6-dołkowa).
    UWAGA: Każdy format płyty lub studzienki może być zainstalowany wyłącznie przez producenta.
  16. Skalibrować pozycję odbioru w środku studzienki zawierającej roztwór CTC, ale bez komórek w środku pola widzenia. Kalibracja wykonywana na krawędziach studni może spowodować wadliwą kalibrację z powodu nierównej powierzchni studni.
  17. Za pomocą czujnika delikatnie dotknij kapilarną dolnej części płytki (prędkość 0,01 mm/krok i 1% prędkości).
  18. Ustaw pozycję pobierania 0,05 mm powyżej dolnej krawędzi płyty.
    UWAGA: Przed kontynuowaniem należy otworzyć i zdjąć pokrywy talerzy i zbiorników. Kapilara może pęknąć na zamkniętej lub niezdjętej pokrywie.
    UWAGA: Jeśli kapilara pęknie w kontakcie z pokrywkami, w otoczeniu lub w roztworach może znajdować się potłuczone szkło.
  19. Wybierz typ komórki i parametry pobrania. Parametr kompletacji można ustawić i wczytać przy każdym uruchomieniu. W przypadku pobierania jednokomórkowego wybierz tryb ręczny.
  20. W ustawieniach Przygotowanie pobrania:
    1. Ustawić objętość szczeliny powietrznej między olejem układowym a próbką na 1 μl
    2. Ustawić objętość cieczy buforowej do pobrania przed każdym pobraniem na 0,5 μL.
      UWAGA: Objętość płynu buforowego jest dostosowana do całkowitej maksymalnej objętości poboru. Małe objętości nie wpływają na wydajność kompletacji ani odkładania.
    3. Ustaw prędkość zasysania cieczy buforowej w zakresie 1-6%.
    4. Ustaw czas oczekiwania po zasysaniu bufora na 1 s.
      UWAGA: W razie potrzeby można skorzystać z opcji pobierania bufora ze studni docelowej zamiast zbiornika z cieczą buforową
    5. Zestaw do ponownego użycia szklanych naczyń włosowatych i brak sterylizacji między kilofami.
      UWAGA: W razie potrzeby sterylizację między pobraniami można przeprowadzić ręcznie. Wykonać wielokrotne mycie wH2Omiędzy kilofami lub dwie sterylizacje w etanolu, a następnie wielokrotne mycie wH2O.
  21. W ustawieniach pobrania:
    1. Zmień ustawienia aparatu podczas wybierania i czas ekspozycji pod mikroskopem na 7 500 μs.
    2. Wybierz stałą wysokość pobierania.
      UWAGA: Zamiast tego można wybrać czujnik narzędzia lub autofokus. Jednak drobne niedoskonałości płytki mogą zaburzyć czułość sensora lub autofokusa, co może spowodować uderzenie kapilary w płytkę.
    3. Ustaw prędkość zasysania kapilary wchodzącej do płytki źródłowej na 7-15%.
    4. Włącz interaktywne wybieranie.
    5. Ustaw objętość aspiracji w μl na 0-0,05.
    6. Ustaw szybkość aspiracji na 5%.
    7. Ustaw czas oczekiwania po aspiracji w s na 0-1.
    8. Ustaw liczbę pobranych cząstek na kapilarę na 1.
    9. Nie ustawiaj wielokrotnego pobierania w tej samej pozycji i nie używaj funkcji skrobania. Właściwości aspiracji muszą być ustawione zgodnie z typem eksperymentu (np. tryb automatycznego pobierania może wymagać większych objętości aspiracji).
  22. W ustawieniach wpłaty:
    UWAGA: Ustawienia aplikacji zależą ściśle od płyty/probówki do odkładania.
    1. W przypadku pobierania jednokomórkowego określ prędkość kapilary wchodzącej do płytki docelowej na 25%.
    2. Ustaw prędkość dozowania na 6%.
    3. Ustaw czas oczekiwania po dozowaniu w s na 0.
    4. Ustaw dobrze ilość szczeliny powietrznej dozowanej w tarczy na 100%.
    5. Nie należy spłukiwać po nałożeniu.
      UWAGA: Sterylizację można przeprowadzić po zdeponowaniu w celu oczyszczenia kapilary.
    6. Ustaw maksymalną ilość osadzających się cząstek na studzience i liczbę celów, które mają być rozprowadzane do 1.
    7. Skalibruj wysokość osadzania w pozycji A1 celu 1 dla płytek lub w pozycji A1 celu 2 dla probówek. Umieść otwartą probówkę lub płytkę bez pokrywki do kalibracji i delikatnie dotknij dołka do osadzania za pomocą czujnika (prędkość 0,01 mm/krok i prędkość 1%). Ustaw wysokość odkładania 1 mm nad spodem płyty.
  23. W ustawieniach:
    1. Ustaw prędkość etapu podczas pobierania na 5-10%.
      UWAGA: Szybkie ruchy płytki mogą powodować przemieszczanie się komórek w zawiesinie i trudności w pobieraniu wielu komórek z powodu nieprawidłowego umieszczenia.
    2. Ustaw właściwości sterylizacji za pomocą objętości płukania na 1 μl, 3 pętli płukania i 2 s czasu oczekiwania na rundę sterylizacji.
    3. Zastosuj zmiany przed zamknięciem.
  24. Poruszaj się po szklanej kapilarze za pomocą joysticka w studni i umieść ją na pojedynczej komórce, która Cię interesuje. Wybierz pozycje pobierania w bezpiecznej odległości od granicy studni (1 mm), ponieważ kapilara może pęknąć na krawędzi studni.
  25. Ręcznie dodawaj cząsteczki za pomocą przycisku joysticka lub ręcznie wybierając z menu.
  26. Wybierz opcję Wybierz aktywowane cząstki, aby rozpocząć zbieranie.
  27. Kapilara zatrzyma się 0,05 mm nad dnem płytki i na górze wybranej pozycji pobierania z powodu interaktywnego pobierania (tryb ręczny). Delikatnie obróć pokrętło joysticka zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ręcznie zassać cząstkę i otaczający ją roztwór DPBS. Maksymalna głośność nie jest stała, gdy włączony jest tryb ręczny. Jednak maksymalna dopuszczalna objętość w strzykawce wynosi 25 μl.
  28. Dozuj nadmiar roztworu DPBS lub niechciane cząstki, delikatnie obracając pokrętło joysticka w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Zbyt duże dozowanie spowoduje uwolnienie szczeliny powietrznej strzykawki, tworząc pęcherzyki w roztworze i pogarszając widoczność.
  29. Naciśnij przycisk Dalej, aby kontynuować wpłatę.
  30. Obserwuj, jak kapilara wchodzi do probówki do deponowania PCR lub płytki PCR, zwalniając objętość i wracając do pozycji wyjściowej z pustą kapilarną.
    UWAGA: Jeśli w kapilarze pozostała objętość, przystąp do sterylizacji. Następnie ponownie sprawdź ustawienia, poziom oleju i wysokość oleju przed wykonaniem nowego zbioru.
  31. Postępuj od punktu 26 sekcji 4, aby rozpocząć nowe pobieranie jednokomórkowe. Podczas zbioru może być konieczna wymiana kapilary. Po instalacji należy przeprowadzić ponowną kalibrację pozycji odbioru. Pod koniec kalibracji wybrać funkcję Zastosuj skalibrowane zmiany wysokości Z do wysokości złoża, aby skorygować wysokość złoża do nowej kalibracji kapilarnej i pominąć kalibrację wysokości złoża (rozdział 4.16).
    UWAGA: Kroki opisane w sekcjach 1-4 mają zastosowanie do większości metod wzbogacania i izolacji CTC. W tym miejscu podajemy opcjonalne kroki dla konkretnej analizy CTC.

5. Wybieranie i wysiewanie pojedynczych komórek do analizy przeżywalności i proliferacji

  1. Upewnij się, że pracujesz z roztworami i materiałami aseptycznymi, aby zachować sterylność podczas całej procedury.
  2. Przygotuj płytkę 384-dołkową, aby zawierała wybrane pojedyncze CTC do hodowli za pomocą 20 μl pożywki do hodowli CTC31. Upewnij się, że CTC są wysiewane w małych objętościach podłoża po manipulacji (np. 10-20 μl dla płytki 384-dołkowej).
  3. Zakręć roztwór na dno płytki. Umieścić płytkę 384 dołków w tarczy 1 i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  4. Wykonaj wszystkie czynności za pomocą mikromanipulatora opisane w rozdziale 4, aby skonfigurować mikromanipulator i rozpocząć nowe pobieranie.
    UWAGA: Wielokrotne zaznaczenie pojedynczych komórek spowoduje utworzenie listy pobrania. Cząstki zostaną pobrane i zdeponowane jedna po drugiej w kolejnych studzienkach (patrz sekcja 4.22.6). Jednak tryb interaktywny (tryb ręczny) zatrzyma kapilę tuż przed aspiracją, umożliwiając w ten sposób eksperymentatorowi kontrolowanie tego krytycznego kroku i zapewnienie udanego pobrania. Szybkie ruchy płytki mogą powodować przemieszczanie się komórek w zawiesinie i trudności w wielokrotnym pobieraniu komórek.
  5. Po złożeniu powtórz krok 4, aby rozpocząć nowy wybór.
  6. Pod koniec pobierania odwirować płytkę o masie 72 x g przez 4 minuty, aby upewnić się, że pobrane komórki są umieszczone na dnie studzienki.

6.CTC rozbijanie klastrów i wybieranie pojedynczych komórek do sekwencjonowania

  1. Upewnij się, że pracujesz z roztworami i materiałami aseptycznymi, aby zachować sterylność podczas całej procedury.
  2. Przygotować pojedyncze probówki do PCR lub płytkę do PCR, które będą zawierały pojedyncze komórki pękniętego klastra z całkowitym roztworem lizującym komórki o objętości 2,5 μl zawierającym 1 U/μl inhibitora RNA.
  3. Szybko odkręć roztwór na dno probówki. Umieścić pojemniki do deponowania w miejscu docelowym 2 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Wykonaj wszystkie czynności opisane w rozdziale 4 z mikromanipulatorem, aby skonfigurować mikromanipulator.
  5. Rozpocznij nową kompletację. Kapilara zatrzyma się 0,05 mm nad dnem płytki i na górze wybranego klastra CTC z powodu interaktywnego pobierania (tryb ręczny).
  6. Delikatnie obróć pokrętło joysticka zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ręcznie zassać zestaw wskaźników i otaczający go roztwór DPBS. Dozuj zasysaną objętość wraz z klastrem CTC, delikatnie obracając pokrętło joysticka w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
  7. Powtarzaj aspirację/usuwanie klastra CTC opisanego w kroku 6, aż pojedyncze komórki tworzące skupisko rozpadną się.
    UWAGA: Zbyt duże dozowanie spowoduje uwolnienie szczeliny powietrznej strzykawki, tworząc pęcherzyki w roztworze i pogarszając widoczność.
  8. Śledź na oko położenie pojedynczych komórek. Ręcznie dodaj cząstki za pomocą przycisku joysticka lub ręcznie wybierając z menu.
    UWAGA: Wielokrotne zaznaczenie pojedynczych komórek spowoduje utworzenie listy pobrania. Cząstki zostaną pobrane i zdeponowane jedna po drugiej w kolejnych probówkach/dołkach PCR (patrz sekcja 4.22.6). Jednak tryb interaktywny (tryb ręczny) zatrzyma kapilarnę tuż przed aspiracją, umożliwiając w ten sposób eksperymentatorowi kontrolowanie tego krytycznego kroku i zapewnienie udanego pobrania.
  9. Wybierz pobranie aktywowanych cząstek, aby rozpocząć zbieranie.
    UWAGA: Ilość roztworu do lizy komórek pozwoli na całkowitą lizę pojedynczej komórki. Jednak długotrwała ekspozycja zlizowanej zawartości na czynnik lizujący może spowodować degradację DNA lub mRNA. Dlatego przejdź od razu do następnego kroku.
  10. Natychmiast zamknij probówkę zawierającą pobraną pojedynczą komórkę i przenieś na suchy lód w celu natychmiastowego zamrożenia.
  11. Szybko zakręć probówką i sprawdź, czy po bokach rurki nie ma kropli, aby zapewnić prawidłową lizę osadzonej komórki.
  12. Powtórz od kroku 5, aby rozpocząć nowe zbieranie.
    UWAGA: Stolik mikroskopu będzie przemieszczał się od jednej dodanej cząstki do drugiej z prędkością opisaną w rozdziale 4.23.1. Zawieszenie CTC w bardzo niskiej płycie mocującej może się poruszać, powodując wadliwe pobieranie z powodu nieprawidłowego ustawienia.

7. Izolacja CTC do wstrzykiwania myszy

  1. Upewnij się, że pracujesz z roztworami i materiałami aseptycznymi, aby zachować sterylność podczas całej procedury.
  2. Przygotuj probówkę do PCR z 5 μl sterylnego 1x DPBS.
  3. Szybko odkręć roztwór na dno probówki. Umieścić pojemniki do deponowania w miejscu docelowym 2 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. W ustawieniach osadu zastosuj zmianę w kroku 4.22.6: Ustaw maksymalną ilość osadów cząstek na studzienkę na 1 000 i liczbę celów do rozprowadzenia cząstek na 1. Ten krok gwarantuje, że pobrane komórki zostaną zdeponowane w tej samej probówce 1,000 razy.
  5. Używaj tylko trybu interaktywnego (tryb ręczny), aby precyzyjnie kontrolować etap pobierania i utrzymywać pobrany roztwór wolny od komórek zanieczyszczających.
    UWAGA: Jeśli potrzebnych jest więcej niż 1,000 komórek, zwiększ liczbę celów do rozprowadzenia cząstek, aby uniknąć utraty próbki po 1,000 komórek.
  6. Kontynuuj kroki opisane w sekcji 4.26, aby rozpocząć nową kompletację. Powtórz krok 6, aby wykonać wiele pobrań. Opisz liczbę komórek zebranych przy każdym pobraniu, aby śledzić liczbę komórek dostępnych do wstrzyknięcia myszy.
  7. Pod koniec zbioru odwirować probówkę o masie 72 x g przez 4 minuty (patrz sekcja 3.1) i zassać supernatant.
  8. Ponownie zawiesić zebrane CTC w wybranym buforze, odpowiednim do wstrzyknięcia u myszy. W przypadku wstrzyknięcia poduszeczki tłuszczowej do poduszeczki tłuszczowej należy ponownie zawiesić zebrane CTC w stosunku 1 do 1 1x DPBS i odtworzyć odtworzoną błonę podstawną ekstrahowaną i utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego pobrane CTC należy ponownie zawiesić tylko w DPBS.
    UWAGA: Objętość roztworu ściśle zależy od liczby CTC, które zostaną wstrzyknięte. Zaleca się wstrzyknięcie do poduszeczki tłuszczowej sutka lub dożylnie maksymalnie 100 μl na mysz. Przy obliczaniu objętości należy zawsze brać pod uwagę objętość martwą do manipulacji i ładowania strzykawki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany przepływ pracy pozwala na przygotowanie indywidualnych CTC, zarówno z pojedynczych CTC, jak i oddzielonych od klastrów CTC. CTC od pacjentów lub myszy z nowotworem są wzbogacane z krwi pełnej dostępnymi metodami wzbogacania CTC, a następnie barwione przeciwciałami przeciwko markerom związanym z rakiem (np. EpCAM, zielony) i markerom specyficznym dla WBC (np. CD45, czerwony) (Figura 1A). Barwiony produkt CTC jest następnie przenoszony do stacji mikromanipul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka molekularna CTC daje nadzieję na lepsze zrozumienie procesu przerzutowego i ukierunkowanie rozwoju nowych terapii przeciwprzerzutowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis tych protokołów, które umożliwiają mikromanipulację CTC i dalszą analizę, w tym zarówno testy funkcjonalne oparte na pojedynczych komórkach, analizę ekspresji genów, jak i przeszczep in vivo w celu oceny potencjału przerzutowego20.

Jednym z najbardziej krytycznych eta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.A. i B.M.S. są wymienieni jako wynalazcy we wnioskach patentowych, które odnoszą się do krążących komórek nowotworowych i leczenia raka. N.A. jest płatnym konsultantem dla firm farmaceutycznych i ubezpieczeniowych zainteresowanych płynną biopsją.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim pacjentom, którzy oddali krew do naszego badania, a także wszystkim zaangażowanym klinicystom i pielęgniarkom prowadzącym badanie. Dziękujemy Jensowi Eberhardtowi, Uwe Birke i dr Katharinie Uhlig z ALS Automated Lab solutions GmbH za nieustanne wsparcie. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Aceto za opinie i dyskusje. Badania w laboratorium Aceto są wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, Unię Europejską, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki, Szwajcarską Ligę Walki z Rakiem, Bazylejską Ligę Walki z Rakiem, dwa kantony Bazylei za pośrednictwem ETH Zürich oraz Uniwersytet w Bazylei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
technologia sygnalizacji komórkowejEpCAM-AF488CST5198klon: VU1D9
1X DPBSInvitrogen14190169bez wapnia, bez magnisium
6-dołkowe Ultra-niska płytka mocującaKlon 304041 Corning3471
Anti-human CD45-BV605BiolegendHI30
Anti-human EGFR-FITC Klon GeneTexGTX11400: ICR10
Anti-human HER2-AF488 Klon Biolegend324410: 24D2
Anti-Mouse CD45-BV605Klon 103139 Biolegend: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTABD366643do pobierania krwi ludzkiej
Jednostka główna Cell CelectorALSCC1001 
Oprogramowanie CellDALSwersja 3.0
Cultrex PathClear Obniżony czynnik wzrostu BME, typ 2R& D Systems3533-005-02
Mikroprobówka 1,3 ml K3EDTASarstedt41.3395.005do probówek PCR do pobierania krwi myszy
CorningPCR-02-L-C
RLT PlusQuiagen1053393
SUPERase  W inhibitorze RNazyThermo FisherAM2696  1 U/&mikro; L 
Przeciw-ludzka :

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6(2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33(2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032(2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147(2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika mikromanipulacjiizolacja CTCpobieranie pojedynczych kom rekskupiska CTChodowla ex vivoprzerzuty in vivodysocjacja CTCheterogeniczno wewn trzskupiskowasekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rek

Powiązane artykuły