Method Article

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

DOI:

10.3791/59681

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spermatogeneza definiuje wysoce uporządkowany proces różnicowania męskich komórek rozrodczych u ssaków. W jądrach transkrypcja i translacja są rozłączone, co podkreśla znaczenie potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów koordynowanej przez RBP. Aby wyjaśnić mechanistyczne role RBP, można zastosować metodologię immunoprecypitacji sieciowania (CLIP) w celu uchwycenia jego endogennych bezpośrednich celów RNA i zdefiniowania rzeczywistych miejsc interakcji. Ulepszony CLIP (eCLIP) to nowo opracowana metoda, która oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi CLIPs. Jednak do tej pory zastosowanie eCLIP było ograniczone do linii komórkowych, co wymagało rozszerzonych zastosowań. W tym przypadku wykorzystaliśmy eCLIP do zbadania MOV10 i MOV10L1, dwóch znanych helikaz wiążących RNA, w jądrach myszy. Zgodnie z oczekiwaniami stwierdzamy, że MOV10 głównie wiąże się z nieulegającymi translacji regionami 3' (UTR) mRNA i MOV10L1 selektywnie wiąże się z transkryptami prekursorowymi RNA oddziałującego z Piwi (piRNA). Nasza metoda eCLIP pozwala na szybkie określenie głównych gatunków RNA związanych przez różne RBP poprzez sekwencjonowanie subklonów na małą skalę, a tym samym dostępność kwalifikowanych bibliotek, co stanowi gwarancję kontynuowania głębokiego sekwencjonowania. Badanie to stanowi podstawę do zastosowania eCLIP w jądrach ssaków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jądro ssaków reprezentuje doskonały model rozwojowy, w którym skomplikowany program różnicowania komórek przebiega cyklicznie, dając liczne plemniki. Unikalna wartość tego modelu polega na pojawieniu się inaktywacji transkrypcji na określonych etapach spermatogenezy, zazwyczaj gdy dochodzi do inaktywacji mejotycznych chromosomów płciowych (MSCI)1,2 oraz gdy okrągłe plemniki ulegają drastycznemu zagęszczeniu jądrowemu podczas spermiogenezy3. Te nienastępujące po sobie zdarzenia transkrypcyjne wymagają potranskrypcyjnej regulacji genów, w której białka wiążące RNA (RBP) odgrywają kluczową rolę, kształtując transkryptom i utrzymując męską płodność.

Aby zidentyfikować bona fide cele RNA pojedynczego RBP in vivo, opracowano metodę immunoprecypitacji sieciowania (CLIP)4,5, w oparciu o regularną immunoprecypitację RNA (RIP)6,7, poprzez włączenie kluczowych etapów, w tym sieciowania ultrafioletowego (UV), rygorystycznego mycia i transferu żelu w celu poprawy specyficzności sygnału. Zaawansowane zastosowanie CLIP w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem wywołało duże zainteresowanie profilowaniem interakcji białko-RNA na poziomie całego genomu8. Oprócz badań genetycznych nad funkcją RBP, takie metody biochemiczne, które identyfikują bezpośrednie wzajemne oddziaływanie endogennego białka i RNA, były niezbędne do dokładnego wyjaśnienia regulacyjnej roli RBP w zakresie RNA. Na przykład MOV10L1 jest helikazą RNA specyficzną dla jąder, wymaganą dla męskiej płodności i biogenezy RNA oddziałującego z Piwi (piRNA)9. Jego paralog MOV10 jest znany jako wszechobecna i wielofunkcyjna helikaza RNA, która odgrywa role w wielu aspektach biologii RNA10,11,12,13,14,15,16,17,18. Stosując konwencjonalny CLIP-seq, odkryliśmy, że wiąże MOV10L1 i reguluje pierwotne prekursory piRNA, aby zainicjować wczesne przetwarzanie piRNA19,20, oraz że MOV10 wiąże mRNA 3' UTR, a także niekodujące gatunki RNA w komórkach rozrodczych jąder (dane nie pokazane).

Mimo to, CLIP jest pierwotnie pracochłonną, radioaktywną procedurą, po której następuje przygotowanie biblioteki sekwencjonowania z niezwykłą utratą znaczników CLIP. W konwencjonalnym CIN biblioteka cDNA jest przygotowywana przy użyciu adapterów ligowanych na obu końcach RNA. Po trawieniu białek usieciowane krótkie polipeptydy pozostają przyłączone do fragmentów RNA. Ten znak sieciowania częściowo blokuje progresję odwrotnej transkryptazy (RTazy) podczas syntezy cDNA, co skutkuje skróceniem cDNA, które stanowią około 80% biblioteki cDNA21,22. W ten sposób sekwencjonowane są tylko fragmenty cDNA powstałe w wyniku ominięcia RTazy z pominięciem miejsca sieciowania (read-through). Ostatnio zastosowano różne metody CLIP, takie jak PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP i uvCLAP, w celu identyfikacji miejsc usieciowania RBP w żywych komórkach. PAR-CLIP polega na zastosowaniu promieniowania UV o długości fali 365 nm i fotoaktywowalnych analogów nukleotydów, a zatem jest przeznaczony wyłącznie do hodowli żywych komórek, a włączenie analogów nukleozydów do nowo zsyntetyzowanych transkryptów jest podatne na powstawanie stronniczości, w której RNA fizycznie oddziałuje z białkiem23,24. W iCLIP tylko pojedynczy adapter jest ligowany do końca 3' usieciowanych fragmentów RNA. Po odwrotnej transkrypcji (RT) zarówno skrócone, jak i odczytane cDNA są uzyskiwane przez wewnątrzcząsteczkową cyrkularyzację i relinearyzację, a następnie amplifikację w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)25,26. Jednak skuteczność cyrkularyzacji wewnątrzcząsteczkowej jest stosunkowo niska. Chociaż starsze protokoły CLIP wymagają znakowania usieciowanego RNA za pomocą radioizotopu, sieciowanie ultrafioletowe i oczyszczanie powinowactwa (uvCLAP), z procesem rygorystycznego oczyszczania powinowactwa tandemowego, nie opiera się na radioaktywności27. Niemniej jednak uvCLAP jest ograniczony do hodowanych komórek, które muszą być transfekowane wektorem ekspresyjnym przenoszącym 3x znacznik FLAG-HBH w celu tandemowego oczyszczania powinowactwa.

W eCLIP, adaptery były najpierw ligowane na końcu 3' RNA, następnie RT, a następnie na końcu 3' cDNA w trybie międzycząsteczkowym. W związku z tym eCLIP jest w stanie przechwycić wszystkie okrojone i odczytane cDNA28. Nie ogranicza się również do znakowania radioaktywnego ani do używania linii komórkowych w oparciu o jego zasadę, przy zachowaniu rozdzielczości pojedynczego nukleotydu.

Tutaj podajemy krok po kroku opis protokołu eCLIP dostosowanego do jąder myszy. Krótko mówiąc, ten protokół eCLIP rozpoczyna się od sieciowania kanalików jądrowych UV, a następnie częściowego trawienia RNazy i immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała specyficznego dla białka. Następnie RNA związane z białkiem jest defosforylowane, a adapter jest ligowany do końca 3'. Po elektroforezie żelu białkowego i transferze żel do błony, RNA izoluje się poprzez przecięcie obszaru błony o oczekiwanym zakresie rozmiarów. Po RT adapter DNA jest ligowany do końca 3' cDNA, a następnie amplifikacja PCR. Badania przesiewowe subklonów przed sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości są traktowane jako kontrola jakości biblioteki. Protokół ten jest skuteczny w identyfikacji głównych gatunków RNA RBP związanych z białkiem, czego przykładem są dwie helikazy RNA wykazujące ekspresję jąder MOV10L1 i MOV10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Samce myszy C57BL/6 trzymano w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych i zaopatrywano je w pokarm i wodę.

1. Pobieranie tkanek i sieciowanie UV

  1. Poddaj eutanazji 2 dorosłe myszy za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ) przez 1-2 minuty lub do momentu ustania oddychania. Następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy na każdej myszy.
  2. Zbierz około 100 mg jąder od myszy w odpowiednim wieku (jedno dorosłe jądro w tym badaniu) do każdego eksperymentu immunoprecypitacji i umieść tkanki w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Delikatnie usuń osłonkę białawą za pomocą jednej pary pęset z cienką końcówką.
  4. Dodaj 3 ml lodowatego PBS do młynka do tkanek i rozcieraj tkankę za pomocą łagodnej siły mechanicznej za pomocą luźnego szklanego tłuczka (tłuczek szklany typu A).
    nuta: Celem tego etapu nie jest liza komórek, ale rozerwanie tkanki. Ważne jest zachowanie żywotności i integralności komórek.
  5. Przenieść zawiesinę tkankową do naczynia do hodowli komórkowych (o średnicy 10 cm) i dodać lodowaty PBS do 6 ml.
  6. Szybko potrząśnij talerzem, aby płyn równomiernie pokrył dno naczynia. Jeśli tkanka zostanie odpowiednio zmielona, widoczne będą równomiernie rozmieszczone kanaliki nasienne, natomiast obecność grudek tkanek wskazuje, że dyspersja tkanek jest nieoptymalna.
  7. Trzykrotnie sieciować zawieszenie za pomocą 400 mJ/cm2 przy 254 nm na lodzie. Mieszać zawiesinę między każdym napromieniowaniem.
    nuta: Dla każdego nowego eksperymentu sieciowanie powinno być optymalizowane.
  8. Zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osad o objętości 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS, a następnie przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w temperaturze 4 °C i masie 1 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
  9. W tym momencie natychmiast przejdź do pozostałej części protokołu lub zamroź granulki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Przygotowanie koralików

  1. Dodać 125 μl kulek magnetycznych białka A na próbkę (osad) do świeżej probówki wirówkowej.
    nuta: Użyj kulek magnetycznych białka G dla przeciwciał myszy.
  2. Umieść rurkę na magnesie, aby oddzielić kulki od roztworu. Po 10 s usunąć supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml lodowatego buforu do lizy.
    nuta: Kolejnym krokiem jest oddzielenie kulek magnetycznych białka A. Skład buforu do lizy to 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholan sodu; 1/50 Koktajl inhibitorów proteazy bez kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (dodać świeży).
  3. Zawiesić kulki w 100 μl buforu do lizy na zimno z 10 μg przeciwciała eCLIP. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 45 min.
    nuta: Końcowe stężenie przeciwciał do immunoprecypitacji wynosi 10 μg/ml. Jeśli stężenie przeciwciał jest nieznane, należy zoptymalizować ilość przeciwciał.
  4. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml lodowatego buforu do lizy
    5. .

3. Liza tkanek i częściowe trawienie RNA

  1. Zawiesić osady tkankowe w 1 ml zimnego buforu do lizy (dodać 22 μl koktajlu inhibitorów białek wolnych od 50x (EDTA) i 11 μl inhibitora RNazy do 1 ml buforu do lizy).
    1. Zawiesić dwie granulki usieciowane promieniami UV i dwie granulki nieusieciowane na grupę eksperymentów: granulki usieciowane promieniami UV 1 dla biblioteki eCLIP (UV-1); Granulki UV-crosslinked-2 do biblioteki eCLIP (UV-2); granulki nieusieciowane 1 do biblioteki eCLIP jako kontrola (bez UV); nieusieciowane 2 granulki dla IgG IP w celu wykazania specyficzności przeciwciał.
      UWAGA: Idealną kontrolą dla biblioteki eCLIP dla testów szerokokątnych usieciowanych promieniami UV są jądra nokautujące usieciowane promieniami UV od myszy z tego samego miotu.
  2. Utrzymuj lizę próbek na lodzie przez 15 minut (aby zapobiec degradacji białka i RNA).
  3. Sonikować w cyfrowym sonikatorze przy amplitudzie 10% przez 5 minut, po 30 s włączenia/30 s wyłączenia. Zawsze umieszczaj próbkę na lodzie i czyść sondę wodą wolną od nukleaz między każdą próbką.
  4. Dodaj 4 μl DNazy do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  5. Dodać 10 μl rozcieńczonej RNazy I (4 μl RNazy I w PBS) i dobrze wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  6. Oczyścić lizat przez odwirowanie w temperaturze 15 000 x g przez 20 minut (w temperaturze 4 °C).
  7. Ostrożnie zebrać supernatant. Pozostaw 50 μl lizatu i wyrzuć wraz z nim osad.
  8. Zapisz próbki wejściowe jako RWB (run dla western blot) i RRI (run dla izolacji RNA). Zaoszczędź 20 μl (2%) próbek UV-1, UV-2, nie-UV i IgG jako dane wejściowe do ładowania żelu RWB. Zaoszczędź 20 μl (2%) próbek UV-1 lub UV-2 jako dane wejściowe do ładowania żelu RRI.

4. Immunoprecypitacja

  1. Dodać 1 ml lizatu (z kroku 3.7) do kulek (przygotowanych w sekcji 2) i obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny lub przez noc.
  2. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Przemyć kulki dwukrotnie 900 μl buforu o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholanu sodu), a następnie dwukrotnie przepłukać kulki 900 μL buforu do przemywania (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
    nuta: W przypadku próbki IgG należy w tym miejscu przerwać procedurę i przechowywać na lodzie w buforze do przemywania wodą.
  3. Przemyć kulki raz 500 μl 1x buforu defosforylacyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 5 mM MgCl2; 100 mM KCl; 0,02% Triton X-100).

5. Defosforylacja końców RNA 3'

  1. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Usuń resztki płynu za pomocą cienkich końcówek pipet. Do każdej próbki dodać 100 μl głównej mieszanki defosforylacji (10 μl 10x buforu defosforylacyjnego [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M KCl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)]; 78 μl wody wolnej od nukleaz; 2 μl inhibitora RNazy; 2 μl DNazy; 8 μl fosfatazy alkalicznej) do każdej próbki, i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  2. Do każdej próbki dodać 300 μl głównej mieszanki kinazy polinukleotydowej (PNK) (60 μL 5x buforu PNK pH 6,5 [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 223 μL wody wolnej od nukleaz; 5 μl inhibitora RNazy; 2 μL DNazy; 7 μL enzymu PNK; 3 μL 0,1 M ditiotreitolu), inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  3. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Umyj koraliki jednorazowo 500 μl buforu do mycia na zimno. Następnie przemyj kulki jednorazowo 500 μl zimnego buforu o wysokiej zawartości soli. Powtórz te prania jeszcze raz w tej kolejności.
  4. Przemyć kulki raz 500 μL buforu do płukania na zimno, a następnie dwukrotnie 300 μL zimnego buforu do ligacji 1x (bez ditiotreitolu, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2).

6. Ligacja adaptera RNA do końca RNA 3'

  1. Odrzucić supernatant i usunąć pozostałą ciecz za pomocą cienkich końcówek pipet. Do każdej próbki dodać 25 μl 3' głównej mieszanki ligacyjnej. Dokładnie wymieszać pipetując. Ten krok jest podatny na tworzenie pęcherzyków.
    nuta: Główna mieszanka do ligacji zawiera 3 μl 10-krotnego buforu do ligacji [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2]; 9 μl wody wolnej od nukleaz; 0,4 μl inhibitora RNazy; 0,3 μL 0,1 M ATP; 0,8 μl dimetylosulfotlenku (DMSO); 9 μl 50% glikolu polietylenowego (PEG) 8000; 2,5 μl ligazy RNA [30 U/μL].
  2. Do każdej próbki dodać 2,5 μl adaptera RNA X1A (tabela 1) i 2,5 μl adaptera RNA X1B (tabela 1). Dokładnie wymieszać pipetując lub strzepując, i inkubować przez 75 minut w temperaturze 25 °C, przesuwając do wymieszania co 10 minut.
  3. Przemyć kulki raz 500 μl buforu do płukania na zimno (wznów próbkę IgG tutaj).
  4. Przemyć kulki raz 500 μl zimnego buforu o wysokiej zawartości soli, a następnie 500 μl buforu do płukania na zimno. Powtórz te prania jeszcze raz.
  5. Magnetycznie oddziel kulki i usuń resztki płynu za pomocą cienkich końcówek pipet.
  6. Zawiesić kulki w 100 μl buforu do płukania na zimno (w tym miejscu zatrzymać próbkę IgG i przechowywać na lodzie w buforze do płukania). Przenieść 20 μl do nowych probówek jako próbki RWB. Pozostałe 80 μl należy oddzielić magnetycznie jako próbki RRI. Usunąć supernatant z próbek RRI i ponownie zawiesić kulki w 20 μl buforu do płukania.
  7. Do próbki IgG dodać 37,5 μl 4x buforu dodecylosiarczanu litu (LDS) i 15 μl 10x środka redukującego próbkę do próbki IgG. Do (pozostałych) próbek dodać 7,5 μl 4x buforu do próbki LDS i 3 μl 10x środka redukującego próbkę. (Nie mieszać przez pipetowanie). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Schłodzić na lodzie przez 1 minutę i odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.

7. SDS-PAGE i transfer membranowy

  1. Załaduj żele.
    1. W przypadku żelu RRI (4-12% żel białkowy Bis-Tris, 10-dołkowy, 1,5 mm) umieść probówki na magnesie i oddziel eluat białkowy od kulek. Załadować 30 μl próbki do studzienki. Próbki są rozmieszczone za pomocą wstępnie wybarwionego markera wielkości białka.
    2. W przypadku żelu RWB (4-12% żel białkowy Bis-Tris, 10-dołkowy, 1,5 mm) umieść probówki na magnesie i oddziel eluat białkowy od kulek. Załadować 15 μl próbki do studzienki. Pozostałe próbki należy zapisać w temperaturze -20 °C jako kopie zapasowe.
  2. Dodaj 500 μl przeciwutleniacza do 500 ml 1x buforu do biegania SDS. Uruchom pod napięciem 200 V w 1x buforze do pracy SDS przez 50 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dole.
    nuta: Przeciwutleniacz zawiera N, N-dimetyloformamid, wodorosiarczyn sodu, który migruje ze zredukowanymi białkami, aby zapobiec reoksydacji wrażliwych aminokwasów, takich jak metionina i tryptofan.
  3. Przenieś kompleksy białko-RNA z żelu do membrany nitrocelulozowej pod napięciem 10 V przez 70 minut w buforze 1xtransfer z 10% metanolem (vol/vol). Wypłucz membranę RRI w zimnym PBS, zawiń ją w folię spożywczą i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  4. Zatkać membranę RWB w 5% mleku w TBST w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Wypłukać membranę w TBST. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w TBST w temperaturze 4 °C przez noc. Umyć dwukrotnie TBST przez 5 minut. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:5 000 HRP kozi anty-króliczą IgG) w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyć trzykrotnie TBST odpowiednio przez 5 minut, 10 minut i 15 minut.
  5. Wymieszać równe objętości buforu A i buforu B elektrochemiluminescencji (ECL), dodać do membrany i inkubować przez 1 min. Przykryć membranę folią spożywczą i wystawić na działanie filmu rentgenowskiego w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty. Następnie wywołaj film.
    nuta: Film z prześwietleniem wyraźnie pokaże kształt krawędzi membrany, dzięki czemu film może być wyrównany z powrotem do membrany RWB. Następnie wyrównaj membrany RWB i RRI w oparciu o położenie znajdujących się w nich znaczników. Warstwami od dołu do góry są kolejno folia, membrana RWB i membrana RRI.

8. Izolacja RNA

  1. Wytnij obszar od pasma białka do 75 kDa (około 220 nt RNA) powyżej, używając błony i folii RWB jako prowadnic.
    nuta: Ponieważ cząsteczka RNA chroniona białkiem może mieć maksymalną długość 225 zasad, z około 340 Da na zasadę, rozsądne jest przecięcie regionu około 75 kDa powyżej pasma RBP, aby pobrać wszystkie kompleksy białko-RNA.
  2. Pokrój wycięty kawałek błony na kilka małych plasterków i umieść je w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl buforu proteinazy K (PK) (100 mM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) z 40 μl PK do kawałków błony. Mieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  3. Dodać 200 μl buforu mocznikowego PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M mocznika) do każdej próbki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  4. Dodać 400 μl kwaśnego fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1), dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  5. Umieść 2 ml ciężkiej probówki z żelem blokującym fazę (PLG) w wirówce i wiruj z prędkością 15 000 x g przez 25 s.
  6. Przenieś całą zawartość z wyjątkiem plastrów membrany do ciężkiej rurki PLG. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  7. Wirować w temperaturze pokojowej i 15 000 x g przez 15 minut. Przenieść warstwę wodną do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  8. Użyj kolumn do oczyszczania i zagęszczania RNA, aby wyekstrahować RNA.
    1. Dodać 2 objętości (800 μl) buforu wiążącego RNA do każdej próbki (od kroku 8.7) i wymieszać. Dodać równą objętość (1200 μl) 100% etanolu i wymieszać.
    2. Przenieść 750 μl próbki (z kroku 8.8.1) do kolumn oczyszczania i zagęszczania RNA w probówce zbiorczej i odwirowywać przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
    3. Powtarzać krok 8.8.2, aż wszystkie próbki zostaną przepuszczone przez kolumnę. Dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ, zastosować 700 μl buforu płuczącego RNA i odwirować kolumnę przy 15 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
    4. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA do kolumny i odwirować przy 15 000 x g przez 2 min. Ostrożnie przenieść kolumnę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl wody wolnej od nukleaz do matrycy kolumny, odstawić na 2 minuty i odwirować przy 15 000 x g przez 30 s. Przechowuj próbki eCLIP w temperaturze -80 °C do czasu RT (krok 11.1).

9. Defosforylacja końców wejściowego RNA 3'

  1. Dodać 15 μl głównej mieszanki defosforylacji (2,5 μl 10x buforu defosforylacyjnego [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M KCl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml BSA]; 9,5 μl wody wolnej od nukleaz; 0,5 μl inhibitora RNazy; 2,5 μl fosfatazy alkalicznej) do 10 μl próbek wejściowych (od kroku 8.8.4). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  2. Do próbek dodać 75 μl głównej mieszanki PNK (20 μl 5x buforu PNK PH6,5 [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl 2]; 44 μl wody wolnej od nukleaz; 1 μl inhibitora RNazy; 2 μl DNazy; 7 μl enzymu PNK; 1 μl 0,1 M ditiotreitolu) do próbek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
  3. Oczyszczanie wejściowego RNA
    1. Ponownie zawiesićekstrakcja kwasów nukleinowych kulki magnetycznew fiolce (wirować przez ponad 30 s). Dodaj 20 μl kulek magnetycznych do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla każdej próbki do nowych probówek. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant.
    2. Umyj kulki raz 1 ml buforu do lizy oczyszczania RNA (bufor RLT). Umieść probówkę na magnesie na 30 s i wyrzuć supernatant.
      nuta: Następnie oddzielenie kwasów nukleinowych od ekstrakcji kulek magnetycznych nastąpiło na tym etapie.
    3. Zawiesić kulki za pomocą 300 μl buforu RLT i dodać do próbki. Dodać 10 μl 5 M NaCl i 615 μl 100% alkoholu etylowego (EtOH) i wymieszać pipetując. Obracać w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Magnetycznie oddziel koraliki i usuń supernatant.
    4. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 75% EtOH i przenieść do nowej probówki. Po 30 s zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Umyj dwukrotnie 75% EtOH, magnetycznie oddziel kulki i wylej resztki płynu za pomocą cienkich końcówek pipet. Suszyć na powietrzu przez 5 minut (unikać nadmiernego suszenia).
    5. Ponownie zawiesić kulki w 10 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 5 minut. Magnetycznie oddzielić kulki i przenieść 5 μl supernatantu do nowej probówki (do ligacji adaptera 3' poniżej). Pozostałe RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C jako kopie zapasowe.

10. Ligacja adaptera RNA do końca wejściowego RNA 3'

  1. Dodać 1,5 μl DMSO i 0,5 μl łącznika RiL19 (tabela 1) do 5 μl wejściowego RNA (z kroku 9.3.5), inkubować przez 2 minuty w temperaturze 65 °C i umieszczać na lodzie na dłużej niż 1 minutę. Dodać 13,5 μl 3' głównej mieszanki ligacji do każdej próbki, mieszać pipetując, i inkubować przez 75 minut w temperaturze 25 °C, z przesuwaniem do mieszania co 15 minut.
    nuta: Główna mieszanka ligacji zawiera 2 μl 10-krotnego buforu ligacyjnego [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2; 10 mM ditiotreitol]; 1,5 μl wody wolnej od nukleaz; 0,2 μl inhibitora RNazy; 0,2 μl 0,1 M ATP; 0,3 μl DMSO; 8 μl 50% PEG8000; 1,3 μL ligazy RNA [30 U/μL].
  2. Oczyszczanie ligowanego wejściowego RNA
    1. Oddzielić magnetycznie 20 μl kulek magnetycznych do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla każdej próbki i usunąć supernatant. Umyj koraliki raz 1 ml buforu RLT.
    2. Zawiesić kulki w 61,6 μl buforu RLT i przenieść zawiesinę do każdej próbki. Dodać 61,6 μl 100% EtOH. Mieszaj pipetą przez 15 minut co 5 minut. Magnetycznie oddziel koraliki i usuń supernatant.
    3. Powtórz krok 9.3.4.
    4. Zawiesić kulki w 10 μl wody wolnej od nukleaz i pozostawić na 5 minut. Magnetycznie oddzielić kulki i przenieść 10 μl supernatantu do nowej probówki.
      nuta: Jest to możliwy punkt zatrzymania (próbki wejściowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do następnego dnia).

11. Odwrotna transkrypcja, Ligacja adaptera DNA do cDNA 3' Kończy się

  1. Dodać odpowiednio 0,5 μl startera RT (tabela 1) do 10 μl wejściowego RNA (z kroku 10.2.4) i 10 μl CLIP RNA (z kroku 8.8.4), inkubować przez 2 minuty we wstępnie podgrzanym bloku PCR w temperaturze 65 °C, umieścić na lodzie na ponad 1 minutę.
  2. Dodać 10 μl głównej mieszanki RT (2 μl buforu RT [500 mM Tris-HCl, pH 8,3; 750 mM KCl; 30 mM MgCl2]; 4 μl wody wolnej od nukleaz; 0,3 μl inhibitora RNazy; 2 μl 0,1 M ditiotreitolu; 0,2 μL 0,1 M dATP; 0,2 μL 0,1 M dCTP; 0,2 μL 0,1 M dGTP; 0,2 μL 0,1 M dTTP; 0,2 μL 0,1 M dTTP; 0,9 μ L odwrotnej transkryptazy) do każdej próbki, wymieszać, inkubować w temperaturze 55 °C przez 45 minut na wstępnie podgrzanym bloku PCR.
  3. Zmieszać 20 μl produktu reakcji RT z 3,5 μl odczynnika do czyszczenia produktu PCR. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 1 μl 0,5 M EDTA, wymieszać pipetując. Dodać 3 μl 1 M NaOH, wymieszać pipetując i inkubować przez 12 minut w temperaturze 70 °C na bloku PCR w celu hydrolizy matrycowego RNA.
  5. Dodać 3 μl 1 M HCl, wymieszać pipetą w celu zneutralizowania buforu.
  6. Oczyszczanie cDNA
    1. Oddzielić magnetycznie 10 μl kulek magnetycznych do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla każdej próbki, usunąć supernatant. Przemyć raz 500 μl buforu RLT.
    2. Zawiesić kulki w 93 μl buforu RLT i przenieść zawiesinę do próbki. Dodać 111,6 μl 100% EtOH, inkubować przez 5 minut i mieszać pipetą co 2 minuty. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 80% EtOH i przenieść do nowej probówki.
    3. Po 30 s zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Umyć dwukrotnie 80% EtOH. Oddziel magnetycznie i wyrzuć pozostałą ciecz za pomocą cienkiej końcówki. Suszyć na powietrzu przez 5 minut (unikać nadmiernego suszenia). Zawiesić kulki w 5 μl 5 mM Tris-HCl i inkubować przez 5 minut.
  7. Dodać 0,8 μl adaptera DNA (Tabela 1) i 1 μl DMSO do kulek, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 75 °C. Umieścić na lodzie na dłużej niż 1 minutę.
  8. Przygotować 12,8 μl głównej mieszanki ligacyjnej (2 μl 10x buforu ligacyjnego [500 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM ditiotreitolu]; 1,1 μl wody wolnej od nukleaz; 0,2 μL 0,1 M ATP; 9 μL 50% PEG8000; 0,5 μL ligazy RNA [30 U/μL]), przesunąć, aby wymieszać, Krótko odwirować w wirówce i dodać do każdej próbki, powoli mieszać próbkę końcówką pipety.
  9. Dodać kolejny 1 μl ligazy RNA [30 U/μL] do każdej próbki i przetrzeć do mieszania. Inkubować przez 30 s w temperaturze 25 °C, wstrząsając z prędkością 1 200 obr./min. Inkubować w temperaturze 25 °C przez noc. Lekko wymieszaj 5 do 6 razy, raz na godzinę.
  10. Oczyszczanie z ligowanego cDNA
    1. Oddziel magnetycznie 5 μl kulek magnetycznych do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla każdej próbki i usuń supernatant.
    2. Przemyć raz 500 μl buforu RLT.
    3. Zawiesić kulki w 60 μl buforu RLT do kulek i przenieść zawiesinę do każdej próbki. Dodać 60 μl 100% EtOH, inkubować przez 5 minut i mieszać pipetą co 2 minuty. Magnetycznie oddzielony, odrzucić supernatant.
    4. Powtórz krok 9.3.4.
    5. Ponownie zawiesić kulki w 27 μL 10 mM Tris-HCl, inkubować przez 5 minut. Magnetycznie oddzielić i przenieść 25 μl próbki do nowej probówki. Rozcieńczyć 1 μl ligowanego cDNA 9 μl wody wolnej od nukleaz w nowej probówce. Pozostałe próbki przechowywać w temperaturze -20 °C do etapu 13.1.

12. Kwantyfikacja cDNA metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

  1. Dodaj 9 μl głównej mieszanki qPCR (5 μl 2x mistrzyni; 3,6 μl wody wolnej od nukleaz; 0,4 μl mieszanki starterów [10 μM PCR-F-D50X i 10 μM PCR-R-D70X]) do 96-dołkowej płytki qPCR. Dodać 1 μl rozcieńczonego w stosunku 1:10 (wH2O) cDNA (z kroku 11.10.5), zamknąć i wymieszać.
  2. Uruchomić program qPCR w termocyklerze: 2 minuty w temperaturze 50 °C; 2 minuty w temperaturze 95 °C; 3 s w temperaturze 95 °C, a następnie 30 s w temperaturze 68 °C przez 40 cykli; 15 s w temperaturze 95 °C, następnie 60 s w temperaturze 68 °C, a następnie 15 s w temperaturze 95 °C przez 1 cykl. Zwróć uwagę na wartość Ct (próg cyklu).

13. PCR Amplifikacja cDNA

  1. Dozować 35 μl mieszanki wzorcowej PCR (25 μl 2x mieszanki głównej PCR; 5 μl wody wolnej od nukleaz; 5 μl mieszanki starterowej [20 μM PCR-F-D50X i 20 μM PCR-R-D70X]) do 8-dołkowych pasków. Dla grupy CLIP dodać 12,5 μl próbki CLIP + 2,5 μlH2O; dla grupy wsadów dodać 10 μl wkładów + 5 μLH2O. Dobrze wymieszać i krótko odwirować w wirówce.
  2. Uruchom program PCR: 30 s w 98 °C; 15 s w 98 °C, następnie 30 s w 68 °C, a następnie 40 s w 72 °C przez 6 cykli; 15 s w 98 °C, a następnie 60 s w 72 °C dla cykli N = (qPCR Ct values-3)-6; 60 s w 72 °C; 4 °C hold.
    nuta: Lepiej jest wykonać od 1 do 2 dodatkowych cykli PCR dla pierwszych kilku CLIPs.

14. Oczyszczanie żelu

  1. Załaduj próbki na 3% żel agarozowy o wysokiej rozdzielczości. Pozostawiając 1 pustą studzienkę między próbkami i użyj drabiny po obu stronach żelu. Praca pod napięciem 100 V przez 75 minut w 1x buforze Tris-Borate-EDTA (TBE).
  2. Przy niebieskim oświetleniu światłem pokrój plastry żelu o 175-350 pz za pomocą świeżych żyletek dla każdej próbki. Umieść je w 15 ml stożkowych probówek.
    1. Zważ plasterek żelu i eluuj żel za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
    2. Dodać 6 razy więcej objętości buforu do rozpuszczania żelu, aby stopić żel (100 mg żelu = 600 μl buforu do rozpuszczania żelu). Żel rozpuścić w temperaturze pokojowej. (Wstrząsaj i mieszaj co 15 minut, aż plasterek żelu całkowicie się rozpuści). Dodaj 1 objętość żelu 100% izopropanolu i dobrze wymieszaj.
    3. Przenieść 750 μl próbki (z kroku 14.2.2) do kolumny w probówce zbiorczej i odwirować przy 17 900 x g przez 1 minutę.
    4. Powtarzać krok 14.2.3 do momentu, aż wszystkie próbki przejdą przez kolumnę, przemyć raz 500 μl żelowego buforu do rozpuszczania.
    5. Dodać 750 μl buforu do przemywania (z zestawu do ekstrakcji żelu) do kolumny i odwirowywać przy 17 900 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ, wirować przy 17 900 x g przez 2 min. Umieścić kolumnę w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    6. Usuń cały pozostały bufor płuczący z plastikowej fioletowej krawędzi kolumny. Suszyć na powietrzu przez 2 minuty. Dodać 12,5 μl wody wolnej od nukleaz do środka membrany. Pozostaw kolumnę na 2 minuty w temperaturze pokojowej i wiruj w temperaturze 17 900 x g przez 1 minutę (Aby uzyskać lepszą wydajność, powtórz etap elucji).

15. TOPO Klon produktu PCR

  1. Przygotować mieszaninę reakcyjną klonowania TOPO (1 μl produktu PCR z kroku 14.2.6; 1 μl mieszanki klonującej; 3 μl sterylnej wody). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 20-37 °C. Schłodzić na lodzie.
  2. Rozmrozić chemicznie kompetentne bakterie E. coli na lodzie. Dodać 5 μl produktu do klonowania TOPO do 100 μl kompetentnych bakterii29. Delikatnie dobrze wymieszaj. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  3. Szok termiczny przez 60 s w temperaturze 42 °C. Następnie schłodzić na lodzie przez 2 min. Dodać 900 μl pożywki bulionu lizogenicznego (LB), inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 225 obr./min. Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 1 minutę, a następnie usunąć 900 μl supernatantu. Ponownie zawieś pozostałą część rozwiązania.
  4. Przekształcone bakterie należy umieścić na płytkach agarowych o stężeniu 1,5% LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Przygotuj co najmniej 20 probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml dla każdej konstrukcji. Napełnij jeden zestaw 500 μl pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Za pomocą sterylnej końcówki pipety losowo zeskrobać jedną kolonię bakteryjną i wymieszać (pipetując) z 500 μl pożywki LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 godzin, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
  6. Sekwencjonuj fragment insertu za pomocą startera odwróconego M13: CAGGAAACAGCTATGAC by Sanger Sequencing30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura eCLIP i wyniki są zilustrowane w Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4. Myszy poddano eutanazji dwutlenkiem węgla, a w dolnej części brzucha wykonano małe nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych (Ryc. 2A,B). Jądra my...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rosnącym zrozumieniem uniwersalnej roli RBP zarówno w kontekście biologicznym, jak i patologicznym, metody CLIP są szeroko stosowane w celu ujawnienia funkcji molekularnej RBP 20,32,33,34,35. Opisany tutaj protokół stanowi dostosowane zastosowanie metody eCLIP do jąder myszy.

Jednym z wyzwań związanych z wykonywaniem eCLIP w ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ericowi L Van Nostrandowi i Gene'owi W Yeo za pomocne wskazówki dotyczące oryginalnego protokołu. K.Z. był wspierany przez National Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) oraz National Natural Science Foundation of China (31771653). L.Y. był wspierany przez National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) oraz Innovative and Entrepreneurial Program of Jiangsu Province.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciała
Przeciwciało przeciw mysom MOV10 Proteintech, Chiny10370-1-AP
Przeciwciało przeciw myszym MOV10L1Zheng i wsp.20109poliklonalne surowice odpornościowe UP2175dostarczone przez P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime, ChinyA7016
Wirówka sprzętowa
Eppendorf, Hamburg, Niemcy5242R
Cyfrowy sonifierBRANSON, USABBV12081048A450 watów; 50/60 Hz
DynaMag-2 MagnesInvitrogen, USA12321D
Mini Moduł BlotInvitrogen, USAB1000
Mini zbiornik żelowyInvitrogen, USAA25977
Inkubator z wytrząsaniemEppendorf, Hamburg, NiemcyKomfort termomiksera 
Młynek do tkanek, DouncePYREX, tylko USA1234F35  w tym protokole używany jest "luźny" tłuczek
Norma regionalna 96 GradientBiometra, NiemcyNr seryjny: 2604323
Rewolwer rurowy Kryształ, USAnr seryjny: 3406051
Sieciownik UVUVP, USACL-1000
Materiały
TC Naczynie hodowlaneCorning, USA430167100 mm 
ProbówkiCorning, USA43079115 ml
MikroprobówkiAXYGEN , USAMCT-150-C1,5 mL 
odczynniki 
Kwaśny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy Solarbio, ChinyP101125:24:01
AffinityScriptEnzyme Agilent, USA600107
PrzeciwutleniaczInvitrogen, USANP0005
DH5&alfa; kompetentne bakterieThermo Scientific, USA18265017te ekonomiczne komórki dają >1 x 106 transformanty/&mikro; g kontrolne DNA na 50 &mikro; Reakcja L.
DMSOSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneD8418
DNA LadderInvitrogen, Stany Zjednoczone10416014
dNTPSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneDNTP100-1KT
Dynabeads Białko A Invitrogen, USA10002D
odczynnik ECLVazyme, ChinyE411-04
EDTAInvitrogen, USAAM9260G
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche, USA04693132001dodaj świeży
Exo-SAP-ITAffymetrix, USA78201Odczynnik do czyszczenia produktu PCR 
Enzym FastAPThermo Scientific, USAEF0652
Bufor do próbek LDSThermo Scientific, USANP0007
MetaPhor Agaroza lonza, Szwajcaria50180
MgCl2Invitrogen, Stany ZjednoczoneAM9530G
Ekstrakcja żelu MiniEluteQIAGEN, Niemcy28604kolumna przechowywać przy 4 Ω; bufor QG=bufor do rozpuszczania żelu; bufor PE= bufor do płukania (dla kroku 14)
Koraliki silanowe MyONEThermo Scientific, USA37002DEkstrakcja kwasów nukleinowych kulki magnetyczne
NaClInvitrogen,USAAM9759
 
NP-40Amresco, Stany ZjednoczoneM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Żele białkoweInvitrogen, USANP0336BOX4%– 12%,1,5 mm, 15-dołkowy
zestaw buforowy NuPAGE MOPS SDS Invitrogen, USANP0050
PBSGibco, USA10010023
Żel Phase-Locked (PLG) ciężka tuba   TIANGEN, ChinyWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems, USAA25742
Proteinaza KNEB, Nowa Anglia P8107S
Q5 PCR master mix NEB, Nowa Anglia M0492L
Bufor RLTQIAGEN, Niemcy79216Bufor do lizy oczyszczania RNA 
RNA Czyste & Koncentrator-5 kolumn ZYMO RESEARCH, USAR1016Kolumny do oczyszczania i zagęszczania RNA
RNaza I Invitrogen, USAAM2295
Inhibitor RNazyPromega, USAN251B
RQ1 DNazaPromega, USAM610A
Środek redukujący próbkęInvitrogen, USANP0009
Roztwór SDSInvitrogen, USA1555302710%
deoksycholan soduSigma-Aldrich, USA30970chronić przed lekki
enzym T4 PNKNEB, Nowa Anglia M0201L
T4 Ligaza RNA 1 o wysokim stężeniuNEB, Nowa Anglia M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning MixVazyme, ChinyC601-01
TBE Invitrogen, USAAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen, USA15567027
Triton X-100Sangon Biotech, ChinyA600198 
Tween-20Sangon Biotech, ChinyA600560
MocznikSigma-Aldrich, USAU5378
Filmy rentgenowskieCaresteam, Kanada6535876

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
  2. Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  3. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  4. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  5. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
  6. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
  7. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
  8. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
  9. Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
  10. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
  11. Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
  12. Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
  13. Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).
  14. Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
  15. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
  16. Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
  17. Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).
  18. Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54(2017).
  19. Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).
  20. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  21. Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
  22. Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  23. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  24. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  25. Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  26. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  27. Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).
  28. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  29. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24(2011).
  30. Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
  31. Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
  32. Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
  33. Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
  34. Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
  35. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  36. Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhanced CLIPProtein bound RNAMouse TestisRNA binding ProteinsCrosslinking ImmunoprecipitationSpermatogenesisGerm CellsMOV10 MOV10L1Piwi interacting RNA3 UTR Targets

Related Articles