Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Summary

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Abstract

Neuronauka to nauka o tym, jak komórki w mózgu pośredniczą w różnych funkcjach. Pomiar ekspresji białek w neuronach i gleju ma kluczowe znaczenie dla badań neurobiologii, ponieważ funkcja komórkowa zależy od składu i aktywności białek komórkowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób immunocytochemię można połączyć ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni o wysokiej rozdzielczości, aby zapewnić półilościową miarę ekspresji białek w różnych obszarach mózgu. Technika ta może być stosowana do pojedynczej lub podwójnej ekspresji białka w tym samym regionie mózgu. Pomiar białek w ten sposób może być wykorzystany do uzyskania względnej zmiany w ekspresji białek za pomocą eksperymentalnej manipulacji, molekularnej sygnatury uczenia się i pamięci, aktywności w szlakach molekularnych i aktywności neuronalnej w wielu regionach mózgu. Korzystając z odpowiednich białek i analizy statystycznej, można również określić funkcjonalne połączenia między regionami mózgu. Biorąc pod uwagę łatwość wdrożenia immunocytochemii w laboratorium, zastosowanie immunocytochemii ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni w wysokiej rozdzielczości może rozszerzyć możliwości neurobiologa do badania procesów neurobiologicznych na poziomie systemowym.

Introduction

Badanie neuronauki dotyczy badania, w jaki sposób komórki w mózgu pośredniczą w określonych funkcjach¹. Mogą one mieć charakter komórkowy, na przykład w jaki sposób komórki glejowe nadają odporność w ośrodkowym układzie nerwowym lub mogą obejmować eksperymenty, które mają na celu wyjaśnienie, w jaki sposób aktywność neuronów w grzbietowym hipokampie prowadzi do nawigacji przestrzennej. W szerokim znaczeniu funkcja komórkowa jest determinowana przez białka, które ulegają ekspresji w komórce i aktywność tych białek². W rezultacie, pomiar ekspresji i/lub aktywności białek w komórkach mózgowych ma kluczowe znaczenie dla bada....

Protocol

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Delaware. Do tego protokołu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley w wieku około 55–75 dni.

1. Ekstrakcja mózgu i przygotowanie tkanek

1. Znieczulenie szczura izofluranem w komorze indukcyjnej znieczulenia, aż szczur przestanie reagować na uszczypnięcie stopy.
2. Składaj ofiary ze szczurów poprzez szybkie ścinanie głów za pomocą gilotyny.
3. Przeciąć skórę na czaszce od tyłu do przodu i od góry czaszki.
4. Użyj rongeurs, aby ostrożnie usunąć tylną część czaszki, a następnie za pomocą....

Results

Przed użyciem skanowania w wysokiej rozdzielczości do immunohistochemii, należy sprawdzić, czy protokół działa. Można to osiągnąć za pomocą testu walidacyjnego, w którym skrawki mózgu tego samego zwierzęcia są inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, samymi przeciwciałami drugorzędowymi lub ani ani przeciwciałami pierwszorzędowymi, ani drugorzędowymi. Wyniki takiego testu walidacyjnego są pokazane w Rysunek 2. W tej reakcji wykryliśmy natychmiast.......

Discussion

Wyniki przedstawione w tym artykule pokazują, że immunocytochemia w bliskiej podczerwieni w połączeniu ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do uzyskania półilościowych pomiarów ekspresji białek w tkance mózgowej. Może być również używany do znakowania dwóch białek jednocześnie w tym samym regionie mózgu. Wcześniej używaliśmy immunohistochemii w bliskiej podczerwieni do pomiaru natychmiastowej wczesnej ekspresji genów w wielu regionach mózgu ^9,10

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komora indukcyjna anestezjologiczna
Gilotyna Kleine'a	Aparat Harvard	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	służy do usuwania tylnej części czaszki
			służy do cięcia w górę wzdłuż linii środkowej czaszki
Mikroszpatułka	Fischer Scientific	21-401-5	służy do wydobywania mózgu
Szkiełka mikroskopowe	Fischer Scientific	12-549-6
Reakcja
Triton X-100			Stosowany jako łagodny detergent do przepuszczalności komórek po utrwaleniu w paraformaldehydzie, stosowany również jako łagodny detergent w połączeniu z surowicą gospodarza i przeciwciałem drugorzędowym
Tween-20			Stosowany jako niewielka ilość detergentu dodawana do TBS  w celu uzyskania TBS-T po nakrywkach z pierwotnym przeciwciałem
Skaner Licor Odyssey Licor	Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.