Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neuronauka to nauka o tym, jak komórki w mózgu pośredniczą w różnych funkcjach. Pomiar ekspresji białek w neuronach i gleju ma kluczowe znaczenie dla badań neurobiologii, ponieważ funkcja komórkowa zależy od składu i aktywności białek komórkowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób immunocytochemię można połączyć ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni o wysokiej rozdzielczości, aby zapewnić półilościową miarę ekspresji białek w różnych obszarach mózgu. Technika ta może być stosowana do pojedynczej lub podwójnej ekspresji białka w tym samym regionie mózgu. Pomiar białek w ten sposób może być wykorzystany do uzyskania względnej zmiany w ekspresji białek za pomocą eksperymentalnej manipulacji, molekularnej sygnatury uczenia się i pamięci, aktywności w szlakach molekularnych i aktywności neuronalnej w wielu regionach mózgu. Korzystając z odpowiednich białek i analizy statystycznej, można również określić funkcjonalne połączenia między regionami mózgu. Biorąc pod uwagę łatwość wdrożenia immunocytochemii w laboratorium, zastosowanie immunocytochemii ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni w wysokiej rozdzielczości może rozszerzyć możliwości neurobiologa do badania procesów neurobiologicznych na poziomie systemowym.
Wprowadzenie
Badanie neuronauki dotyczy badania, w jaki sposób komórki w mózgu pośredniczą w określonych funkcjach1. Mogą one mieć charakter komórkowy, na przykład w jaki sposób komórki glejowe nadają odporność w ośrodkowym układzie nerwowym lub mogą obejmować eksperymenty, które mają na celu wyjaśnienie, w jaki sposób aktywność neuronów w grzbietowym hipokampie prowadzi do nawigacji przestrzennej. W szerokim znaczeniu funkcja komórkowa jest determinowana przez białka, które ulegają ekspresji w komórce i aktywność tych białek2. W rezultacie, pomiar ekspresji i/lub aktywności białek w komórkach mózgowych ma kluczowe znaczenie dla badań neurobiologii.
Dostępnych jest wiele technik pomiaru ekspresji białek w mózgu. Należą do nich metody in vivo, takie jak topografia emisji pozytonów dla gęstości receptorów3 oraz mikrodializa dla małych peptydów4. Częściej metody ex vivo są stosowane do badania funkcji i ekspresji białek. Należą do nich techniki spektrometrii mas5, test immunoenzymatyczny western blot i enzymatyczny (ELISA)6 oraz immunocytochemistry7. Immunocytochemia jest szeroko stosowana w dziedzinie neuronauki. Technika ta polega na użyciu przeciwciała pierwszorzędowego do wykrycia białka (lub antygenu) będącego przedmiotem zainteresowania (np. c-Fos) oraz sprzężonego przeciwciała drugorzędowego do wykrycia kompleksu białko-przeciwciało pierwotne (ryc. 1). Aby umożliwić wykrycie kompleksu białko-przeciwciało pierwszorzędowe-przeciwciało drugorzędowe, przeciwciała drugorzędowe mają sprzężone z nimi czynniki utleniające, takie jak peroksydaza chrzanowa (HRP). Pozwala to na tworzenie się osadów w komórkach, które można wykryć za pomocą mikroskopii świetlnej7. Przeciwciała drugorzędowe mogą również mieć sprzężone z nimi substancje chemiczne fluoryzujące (tj. Fluorofory). Po stymulacji te substancje chemiczne emitują światło, które może być wykorzystane do wykrywania kompleksów białko-przeciwciało pierwotne-przeciwciało drugorzędowe7. Wreszcie, czasami przeciwciała pierwszorzędowe mają przyłączone środki redukujące i chemikalia fluorescencyjne, które bezpośrednio negują potrzebę stosowania przeciwciał drugorzędowych7 (Figura 1).
Interesujące, wiele metod immunocytochemicznych pozwala na wizualizację białek w komórkach mózgowych, ale nie pozwala na ilościowe określenie ilości białka w określonej komórce lub regionie mózgu. Wykorzystanie mikroskopii świetlnej do wykrywania osadów z reakcji redukcji pozwala na wizualizację neuronów i gleju, ale metoda ta nie może być stosowana do ilościowego określania ekspresji białek w komórkach lub w określonym regionie mózgu. Teoretycznie można do tego wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną, ponieważ światło emitowane przez fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe jest miarą kompleksu białko-przeciwciało pierwotne-przeciwciało wtórne. Jednak autofluorescencja w tkance mózgowej może utrudniać wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia ekspresji białek w tkance mózgowej8. W rezultacie, światło emitowane z fluorescencyjnych obrazów tkanki mózgowej jest rzadko wykorzystywane do ilościowego określania ekspresji białek w mózgu.
Wiele z tych problemów można rozwiązać za pomocą immunocytochemii w bliskiej podczerwieni w połączeniu ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości9,10. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób immunocytochemia sprzężona z fluoroforami w widmach emisyjnych w bliskiej podczerwieni może być połączona ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości (np. 10–21 μm) w celu uzyskania ostrych obrazów, które pozwalają na częściową kwantyfikację białka w różnych obszarach mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Delaware. Do tego protokołu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley w wieku około 55–75 dni.
1. Ekstrakcja mózgu i przygotowanie tkanek
- Znieczulenie szczura izofluranem w komorze indukcyjnej znieczulenia, aż szczur przestanie reagować na uszczypnięcie stopy.
- Składaj ofiary ze szczurów poprzez szybkie ścinanie głów za pomocą gilotyny.
- Przeciąć skórę na czaszce od tyłu do przodu i od góry czaszki.
- Użyj rongeurs, aby ostrożnie usunąć tylną część czaszki, a następnie za pomocą małych nożyczek preparacyjnych przetnij linię środkową czaszki, cały czas naciskając w górę na górną część czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
- Użyj rongeurs, aby oderwać prawą i lewą połowę czaszki, aby odsłonić mózg.
- Użyj małej szpatułki, aby nabrać pod mózg i przeciąć nerwy, ostrożnie podnieś mózg i zamroź mózg w izopentanie schłodzonym na suchym lodzie (co najmniej -20 °C). Następnie przechowuj mózgi w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu pokrojenia.
- Pokrój mózgi w obszarach zainteresowania w temperaturze 30–50 μm w kriosacie utrzymywanym w temperaturze od -9 °C do -12 °C. Plastry należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach podstawowych i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu testu immunocytochemicznego.
nuta: W tym protokole obszarami mózgu będącymi przedmiotem zainteresowania były hipokamp i ciało migdałowate.
2. Pojedyncza reakcja immunohistochemiczna
UWAGA: Dla podwójnej reakcji immunohistochemicznej, protokół jest taki sam jak w przypadku pojedynczej reakcji immunohistochemicznej, z wyjątkiem tego, że ta reakcja ma dwa pierwszorzędowe przeciwciała różnych gospodarzy (np. królika i myszy), a dwa drugorzędowe przeciwciała dla odpowiadających im przeciwciał pierwszorzędowych powinny pochodzić od jednego gospodarza (np. kozia anty-królik i kozia antymysz). Przeciwciała drugorzędowe muszą również pochodzić z dwóch różnych widm, które są dostępne w skanerach o wysokiej rozdzielczości. Na przykład jedno przeciwciało drugorzędowe o piku widma emisyjnego przy 680 nm i jedno przeciwciało drugorzędowe 800CW (pik widma emisyjnego przy 780 nm).
- Wyjmij szkiełka podstawowe z zamrażarki i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej na 30 minut.
- Pod wyciągiem oparowym utrwalić tkankę mózgową w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać szkiełka w 0,1 M buforowanym roztworem soli fizjologicznej (TBS) trzy razy przez 10 minut każde. Przepuszczalność błon komórkowych poprzez inkubację szkiełek w łagodnym detergencie (np. 0,01% detergentu) przez 30-60 minut.
- Opłucz szkiełka w TBS trzy razy po 15 minut każda.
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w PBS w odpowiednim stężeniu. Na przykład, aby wykryć natychmiastowy wczesny gen c-Fos, przygotuj pierwszorzędowe przeciwciało anty c-Fos królika w stężeniu 1:500.
- Pipetować roztwór przeciwciała pierwotnego bezpośrednio na tkankę mózgową (około 200 μl na szkiełko o wymiarach 3 cale x 1 cal).
- Szkiełka nakrywkowe należy stosować do inkubacji tkanki mózgowej na szkiełkach podstawowych w pierwotnym rozcieńczeniu przeciwciał przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc (~17 godzin) w temperaturze 4 °C.
- Usuń szkiełka nakrywkowe i umyj szkiełka w TBS, do którego dodano niewielką ilość detergentu (np. 0,01% detergentu, "TBS-T") cztery razy przez 15 minut każdy.
- Szkiełka nakrywkowe należy stosować do inkubacji skrawków mózgu w przeciwciałie drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
nuta: Przeciwciało drugorzędowe musi być w odpowiednim rozcieńczeniu i w rozcieńczalniku zawierającym TBS, detergent i 1,5% surowicy gospodarza. Na przykład przeciwciało drugorzędowe kozie w rozcieńczeniu 1:2000 zawierałoby 1,5% surowicy koziej i 0,05% detergentu. - Szkiełka podstawowe należy płukać w TBS-T cztery razy po 20 minut każda, a następnie w TBS cztery razy po 20 minut każda.
- Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc. Gdy szkiełka wyschną, są gotowe do obrazowania.
3. Obrazowanie
- Umieść szkiełka na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni tkanką skierowaną w dół. Obraz jednego szklanego slajdu lub wielu slajdów naraz za pomocą narzędzia do zaznaczania.
- Obraz przesuwa się przy użyciu najwyższego ustawienia jakości z przesunięciem 0 nm i rozdzielczością 21 μm. Skanowanie trwa zwykle 13-19 godzin, w zależności od używanego sprzętu skanującego.
- Importuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageStudio), aby wyświetlić i oznaczyć je do półilościowej analizy białek.
4. Analiza ekspresji białek
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i wybierz obszar roboczy, do którego obraz został zeskanowany.
- Otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby wyświetlić skan i dostosuć, które długości fal są oglądane, a także wyświetlany kontrast, jasność i powiększenie bez zmiany surowego obrazu lub całkowitej emisji ilościowej.
- Zidentyfikuj kluczowe obszary do oceny ilościowej i wybierz kartę Analiza u góry strony, a następnie wybierz opcję Rysuj prostokąt (lub Rysuj elipsę/rysuj odręcznie), aby narysować prostokąt nad obszarem, który zostanie określony ilościowo.
- Aby wyświetlić rozmiar prostokąta, wybierz pozycję Kształty w lewym dolnym rogu ekranu, a następnie wybierz pozycję Kolumny w prawym dolnym rogu. Dodaj kolumny Wysokość i Szerokość, aby zidentyfikować rozmiar kształtu.
nuta: Ważne jest, aby kontrolować rozmiar kształtu podczas porównywania kwantyfikacji. Zaleca się stosowanie identycznych kształtów umieszczonych w żądanym miejscu oznaczania ilościowego, w celu uzyskania dokładnej próbki emisji dla tego regionu. - Następnie nazwij kształt i powtórz czynność. Po próbkowaniu wszystkich regionów można agregować i analizować dane dostępne na karcie kolumny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przed zastosowaniem skanowania o wysokiej rozdzielczości do immunohistochemii należy zweryfikować poprawność działania protokołu. Można to osiągnąć za pomocą testu walidacyjnego, w którym przekroje mózgu z tego samego zwierzęcia są inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, samym przeciwciałem drugorzędowym lub bez przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Wyniki takiego testu walidacyjnego przedstawiono na Rysunku 2. W tej reakcji ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyniki przedstawione w tym artykule pokazują, że immunocytochemia w bliskiej podczerwieni w połączeniu ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do uzyskania półilościowych pomiarów ekspresji białek w tkance mózgowej. Może być również używany do znakowania dwóch białek jednocześnie w tym samym regionie mózgu. Wcześniej używaliśmy immunohistochemii w bliskiej podczerwieni do pomiaru natychmiastowej wczesnej ekspresji genów w wielu regionach mózgu 9,10
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania opisane w tym raporcie zostały sfinansowane z grantu celowego od NIGMS (1P20GM103653) przyznanego DK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komora indukcyjna anestezjologiczna | |||
| Gilotyna Kleine'a | Aparat Harvard | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | służy do usuwania tylnej części czaszki |
| służy do cięcia w górę wzdłuż linii środkowej czaszki | |||
| Mikroszpatułka | Fischer Scientific | 21-401-5 | służy do wydobywania mózgu |
| Szkiełka mikroskopowe | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Reakcja | |||
| Triton X-100 | Stosowany jako łagodny detergent do przepuszczalności komórek po utrwaleniu w paraformaldehydzie, stosowany również jako łagodny detergent w połączeniu z surowicą gospodarza i przeciwciałem drugorzędowym | ||
| Tween-20 | Stosowany jako niewielka ilość detergentu dodawana do TBS w celu uzyskania TBS-T po nakrywkach z pierwotnym przeciwciałem | ||
| Skaner Licor Odyssey Licor | Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
Bibliografia
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
