Artykuł metodologiczny

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

DOI:

10.3791/59697

⸱

27 sierpnia 2019

 , 
1Norfolk Academy, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Howard Hughes Medical Institute, Yale School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanistyczny wgląd wynika z dokładnych badań i kwantyfikacji konkretnych RNA i białek. Względne lokalizacje tych biomolekuł w komórce w określonych momentach można uchwycić za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunofluorescencji (IF). Podczas zakażenia herpeswirusem litycznym wirus przejmuje kontrolę nad komórką gospodarza, aby preferencyjnie wyrażać geny wirusa, powodując zmiany w morfologii komórek i zachowaniu biomolekuł. Aktywność lityczna jest skoncentrowana w fabrykach jądrowych, zwanych przedziałami replikacji wirusa, które są dostrzegalne tylko w przypadku FISH i IF. Tutaj opisujemy adaptowalny protokół technik RNA FISH i IF dla komórek zakażonych wirusem opryszczki związanej z mięsakiem Kaposiego (KSHV), zarówno przylegających, jak i w zawiesinie. Metoda obejmuje etapy opracowywania specyficznych oligonukleotydów antysensownych, ryb z podwójnym RNA, RYBY RNA z IF oraz ilościowe obliczenia intensywności fluorescencji. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wielu typów komórek, komórek niezakażonych, komórek utajonych, komórek litycznych, przebiegów czasowych i komórek traktowanych inhibitorami w celu analizy czasoprzestrzennej aktywności określonych RNA i białek zarówno od ludzkiego gospodarza, jak i KSHV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W swojej litycznej (aktywnej) fazie, herpeswirusy przejmują kontrolę nad komórką gospodarza, powodując zmiany w morfologii komórki i lokalizacji cząsteczek biologicznych, aby wytworzyć wiriony. Podstawą operacji jest jądro, w którym dwuniciowy genom wirusa DNA jest replikowany i pakowany w otoczkę białkową, zwaną capsid1. Po pierwsze, wirus wykazuje ekspresję własnych białek, przejmując kontrolę nad maszynerią gospodarza i zapobiegając ekspresji nieistotnych genów gospodarza, proces ten określa się mianem efektu wyłączenia gospodarza. Większość tej aktywności jest zlokalizowana w specyficznych regionach jądrowych wolnych od 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) zwanych przedziałami replikacji wirusa, składającymi się zarówno z białek gospodarza, jak i wirusa, RNA i wirusowego DNA2. Komórka jest remontowana w celu zapewnienia miejsca i zasobów dla przedziałów replikacyjnych, a tym samym montażu kapsydów wirusowych. Gdy kapsyd opuści jądro, nie jest jasne, w jaki sposób kapsyd jest otoczony cytoplazmą w celu wytworzenia cząsteczki wirusa związanej z błoną, znanej również jako wirion. Zrozumienie lokalizacji i przesunięć przestrzennych biomolekuł zarówno gospodarza, jak i wirusa podczas fazy litycznej zapewnia głębszy mechanistyczny wgląd w układ przedziału replikacyjnego, efekt wyłączenia gospodarza, szlak wyjścia wirionu i inne procesy związane z infekcją i replikacją wirusa opryszczki.

Obecnie najlepszą metodą wykrywania i badania tych zmian jest wizualizacja białek i RNA w zainfekowanych komórkach odpowiednio za pomocą immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Zastosowanie przebiegu czasowego z tymi technikami ujawnia lokalizację biomolekuł w kluczowych punktach fazy litycznej lub po prostu danych czasoprzestrzennych. FISH i IF uzupełniają inne techniki biochemiczne, takie jak hamowanie procesu komórkowego (np. hamowanie replikacji wirusowego DNA), RT-qPCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym), sekwencjonowanie RNA, plamy północne, spektrometria mas, Western blotting i analiza produkcji DNA wirusa, które mogą zapewnić bardziej globalny obraz aktywności komórkowej.

Opracowaliśmy strategie RNA FISH do badania produktów RNA z określonych genów oraz analizę obliczeniową, która ilościowo oblicza stosunek nukleocytoplazmatyczny określonego produktu genu. Przygotowanie próbki, zmodyfikowane na podstawie wcześniejszych publikacji Steitza i współpracowników3,4, jest stosunkowo łatwe i może być stosowane zarówno do komórek przylegających, jak i zawieszonych. Protokół można również dostosować do jednoczesnego stosowania wielu strategii RNA FISH (double RNA FISH) lub RNA FISH ze strategiami IF. Opracowanie konkretnej strategii FISH jest wyzwaniem, ale przedstawiono sugestie dotyczące poprawy sukcesu. Opisana tutaj analiza danych jest ilościowa, jeśli stosuje się koraliki fluorescencyjne i silne markery granic przedziałów, i oferuje dodatkowy wgląd w mikrofotografie, wgląd, który usuwa błąd obserwacji. Szczegółowy protokół jest przeznaczony zarówno dla komórek utajonych, jak i litycznych zakażonych herpeswirusem związanym z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i może być stosowany z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi innymi herpeswirusami5. Metody oznaczania ilościowego mają zastosowanie do badań nad przesunięciami nukleocytoplazmatycznym lub relokalizacją między przedziałami subkomórkowymi w większości komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie fluorescencyjnych oligonukleotydów antysensownych in situ (FISH) do wykrywania specyficznego transkryptu herpeswirusowego

  1. Wybierz od 25 do 40 segmentów nt z sekwencji RNA będącej przedmiotem zainteresowania i przekształć je w antysensowne. Skuteczna strategia FISH może zawierać od jednego do dziesięciu lub więcej różnych oligonukleotydów antysensownych. Podczas wybierania sekwencji należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Jeśli interesujący nas RNA zawiera unikalny region powtórzeń, wykorzystaj tę cechę i zaprojektuj oligonukleotyd antysensowny, który będzie celował w sekwencję powtórzeń.
      UWAGA: Tycowski i współpracownicy5 podają przykład tej strategii z poliadenylowanym jądrowym (PAN) RNA rezusa rhadinowirusa (RRV).
    2. Jeśli interesujący nas RNA zawiera znane miejsce wiązania białka lub strukturę pętli macierzystej, zaprojektuj oligonukleotydy, które unikają tych regionów.
    3. W zależności od celów eksperymentów, rozważ sekwencję intronową i czy zaprojektować dla niej oligonukleotyd antysensowny.
  2. Wykonuj proste analizy obliczeniowe na wybranych sekwencjach antysensownych, aby zapewnić specyficzność wiązania i zmniejszyć agregację oligonukleotydu antysensownego.
    1. Sekwencje muszą być bogate w około 50% GC (wysoka zawartość guaniny i cytozyny) i mieć temperaturę topnienia w zakresie od 60 do 70 °C.
    2. Użyj narzędzia do analizy sekwencji, aby wybrać sekwencje, które nie ulegają samoistnej dimeryzacji lub tworzą spinki do włosów o temperaturach topnienia powyżej 37 °C, czyli temperatury hybrydyzacji.
    3. Wykonaj wyszukiwanie NCBI BLASTn (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool for nucleotide alignments) wybranych sekwencji zarówno w odniesieniu do transkryptomu gospodarza, jak i wirusa, używając "nieco podobnego" ustawienia. To wyszukiwanie pozwoli zidentyfikować unikalne oligonukleotydy antysensowne, które prawdopodobnie nie będą wiązać się z innymi transkryptami gospodarza lub wirusa.
      UWAGA: Jeśli transkryptomy nie są dostępne, przeprowadź wyszukiwanie BLAST z sekwencjami genomowymi. Jest to idealne rozwiązanie, jeśli badania są przeprowadzane na sekwencjach wirusa wyizolowanych z zakażonych komórek użytych w eksperymencie, ponieważ dzikie szczepy mają tendencję do różnicowania się i zawierają kombinację sekwencji z różnych szczepów laboratoryjnych.
  3. Zamów oczyszczone oligonukleotydy DNA odpowiadające sekwencji antysensownej, która została zweryfikowana obliczeniowo jako unikalna i prawdopodobnie wiąże się z docelowym RNA. Nie trzeba wprowadzać żadnych specjalnych modyfikacji do oligonukleotydów.
  4. Przetestuj zaprojektowane oligonukleotydy antysensowne pod kątem specyficzności wiązania przez FISH i Northern blot.
    1. Używając niezakażonej linii komórkowej od tego samego gatunku gospodarza (np. 293T) i najlepiej tego samego typu komórki, przeprowadź transfekcję z plazmidem wyrażającym interesujące RNA z silnego promotora (CMV, wirus cytomegalii) i plazmidem z pustym wektorem (np. pcDNA3). Do transfekcji należy użyć kontroli dodatniej, takiej jak kotransfekcja plazmidem GFP (zielone białko fluorescencyjne) (np. pmaxGFP) lub wektorem zawierającym GFP.
      UWAGA: Ważne jest, aby unikać linii komórkowych, które zostały unieśmiertelnione za pomocą wirusa opryszczki wirusa Epsteina-Barr (EBV), ponieważ istnieją podobieństwa sekwencji między herpeswirusami.
    2. Wykonaj FISH zgodnie z opisem w sekcji 3 na obu zestawach komórek z oligonukleotydami antysensownymi, jak opisano w tym protokole. Wydedukuj zwycięskich kandydatów, porównując eksperymenty FISH z pojedynczymi, parami lub zestawami oligonukleotydów antysensownych. Użyj kontroli pozytywnej dla protokołu FISH, takiej jak U2 snRNA (małe jądrowe RNA) FISH, obecne w 500 000 kopii na jądro komórki ludzkiej6 (Tabela 1).
    3. Sygnał fluorescencyjny powinien być specyficzny i silny w komórce zawierającej interesujące nas RNA. Zaprojektuj dodatkowe oligonukleotydy antysensowne, aby wzmocnić sygnał i usunąć oligonukleotydy antysensowne, które wiążą się niespecyficznie. Siła sygnału musi znajdować się powyżej tła i autofluorescencji.
    4. Zbadaj swoistość wiązania za pomocą Northern blot.

2. Przygotowanie oligonukleotydów i komórek

  1. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, użyj transferazy końcowej, aby oznaczyć oligonukleotydy antysensowne dioksygeniną(DIG)-dUTP lub, jeśli silnie wiążą, bezpośrednio nukleotydem fluorescencyjnym, takim jak Alexa Fluor 594-5-dUTP. Po oznakowaniu dodatkowe oczyszczanie nie jest konieczne. Znakowane oligonukleotydy należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku lat oraz w folii aluminiowej, jeśli są bezpośrednio oznakowane, aby zapobiec fotowybielaniu.
    UWAGA: Roztwór do etykietowania zawiera materiał toksyczny, kakodylan potasu. Obsługa reakcji etykietowania za pomocą rękawiczek.
    UWAGA: Aby oszczędzać zasoby, w jednej reakcji można oznaczyć kilka różnych oligonukleotydów antysensownych. Protokół ten wykorzystuje etykietowanie końca 3'. Znakowanie wewnętrzne jest trudne, ponieważ grupa chemiczna (np. DIG lub fluorofor) zostaje złapana lub nie jest w stanie dostać się do miejsca aktywnego polimerazy DNA. Eksperyment z dwoma różnymi RNA można przeprowadzić przy użyciu bezpośrednio znakowanych oligonukleotydów antysensownych i immunofluorescencji anty-DIG z innym fluoroforem (np. FITC (fluoresceina) lub Alexa Fluor 488 z Alexa Fluor 594).
  2. Przyklej ogniwa do szkiełek ośmiokomorowych.
    UWAGA: Ośmiokomorowe szkiełka umożliwiają jednoczesne przeprowadzanie kilku eksperymentów, jednocześnie minimalizując cenne zasoby, takie jak przeciwciała. Alternatywą dla szkiełek ośmiokomorowych jest sześciodołkowa płytka do hodowli tkankowej ze standardowymi szkiełkami nakrywkowymi (22 mm x 22 mm), które są sterylne. Podobny układ jest możliwy w przypadku okrągłych szkiełek nakrywkowych i 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. W obu przypadkach należy zwiększyć objętości wymienione w tym protokole odpowiednio 10-15x (np. 1,75 ml roztworu do hybrydyzacji) i 4x (np. 600 μl roztworu hybrydyzacyjnego).
    1. W przypadku przylegających komórek litycznych użyj 1x trypsyna/PBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 minut, aby zawiesić komórki i rozcieńczyć do 60% konfluencji.
      UWAGA: Przylegające linie komórkowe używane w eksperymentach FISH obejmowały 293T, iSLK.2197 i iSLK-BAC36 cells8.
    2. Nałożyć 200 μl zawiesiny komórkowej na każdą komorę sterylnych szkiełek ośmiokomorowych i pozostawić nasiona na wzrost przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W razie potrzeby dostosować do wolno lub szybko rosnących komórek oraz do komórek, które łatwo ulegają uszkodzeniu przez trypsynę.
      UWAGA: Celem jest, aby równomiernie rozmieszczone komórki były mocno przymocowane do szkiełka. Rozważ wywołanie fazy litycznej po adhezji, jeśli komórki lityczne są delikatne. Wnioski wyciągnięte z eksperymentów z komórkami iSLK są ograniczone9.
    3. W przypadku litycznych komórek zawiesinowych należy wstępnie potraktować ośmiokomorowe szkiełka poli-L-lizyną w skali 1:10 przez 5 minut pod kapturem do hodowli tkankowej. Następnie pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej lub 1 godzinę w temperaturze 65 °C. Inkubować 800 μl komórek litycznych o stężeniu 1 x 106 komórek/ml za pomocą szkiełek komorowych przez 30 min do 1 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Komórki zawiesinowe osadzają się w monowarstwie, przyklejając się do poli L-lizyny, a zatem nadmiar komórek nie stanowi problemu w porównaniu z komórkami przylegającymi. Komórki lityczne, które tworzą kiście winogron, jeśli to możliwe, należy oddzielić delikatnym wirowaniem lub środkami chemicznymi. Trzeba przyznać, że autorzy nie odnieśli większych sukcesów z takimi zaleceniami w przypadku litycznych komórek BJAB-RRV-GFP. Jeśli komórki zawiesinowe nie przylegają dobrze, należy rozważyć wydłużenie czasu lub stężenia inkubacji poli-L-lizyny.

3. Utrwalenie, immunofluorescencja (opcjonalnie), hybrydyzacja i wizualizacja wirusowych RNA

  1. Usuń nośnik i nadmiar komórek. W trakcie stosowania tego protokołu należy stosować odsysanie próżniowe w celu usunięcia roztworów i delikatne mikropipetowanie w celu dodania roztworów.
    UWAGA: Siłę próżni można zmniejszyć, umieszczając końcówkę mikropipety o pojemności 200 μl na szklanej pipecie Pasteura. Wymieniaj końcówkę mikropipety między etapami mycia, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Każdy etap mycia musi być wykonywany szybko, ponieważ konieczne jest, aby komórki nigdy nie wyschły.
  2. Natychmiast utrwalić komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem/PBS (solą fizjologiczną buforowaną fosforanami) na lodzie przez 30 minut. Umyć komórki trzykrotnie 200 μl 1x PBS schłodzonym do 4 °C i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub na lodzie.
    1. Utrwalone komórki należy przesłodzić 200 μl wstępnie schłodzonego 0,5% Triton-X/PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) przez 10 minut na lodzie lub 750 μl wstępnie schłodzonego 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez 1 h (min) do 7 d (max).
      UWAGA: Zbierz próbki białek, całkowitego RNA i genomowego DNA w miejscu utrwalenia, aby zapewnić spójność między obrazami a testami biochemicznymi. Wszystkie prania w całym tym protokole są wykonywane w ten sam sposób, chyba że określono inaczej. 70% etanol rozluźnia klej między komorami a suwakiem, co ułatwia późniejsze rozdzielanie, a także zapewnia znaczną przerwę w protokole. Niemniej jednak użyj folii parafinowej wokół szkiełka komory, aby zmniejszyć parowanie i sprawdzaj poziom etanolu w każdej komorze co około 8 godzin. 70% etanolu również spłaszcza komórki, tworząc wyraźniejszy obraz, podczas gdy Triton-X nie odwadnia komórek i nie zmienia wymiarów ogniwa.
  3. Ostrożnie wyjmij komory, aby zapobiec pęknięciu zamka. Jeśli eksperyment obejmuje immunofluorescencję (IF) białka wirusa lub gospodarza z poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym, wykonaj IF zgodnie z opisem poniżej przed przystąpieniem do RNA FISH. Jeśli immunofluorescencja wykorzystuje pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne, należy przeprowadzić immunofluorescencję zgodnie z opisem w kroku 3.3.1 po kroku 3.11.
    UWAGA: Użyj nowego urządzenia do usuwania lub takiego, które zawiera bardzo mało resztek kleju dostarczonego przez producenta i delikatnie zdejmij komory, aby zapobiec pękaniu szkiełka. Stosowanie 70% etanolu jako odczynnika przepuszczalnego przez 4 godziny znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pękania. W przypadku pęknięcia należy kontynuować protokół w komorach niedotkniętych pęknięciem i pamiętać o wyższym współczynniku utleniania nieidealnie uszczelnionych szkiełek (tj. skróconym okresie przechowywania).
    1. Przepłukać komórki wstępnie schłodzonym 1x PBS i blokować wstępnie schłodzonym 4% BSA (albumina surowicy bydlęcej)/1x PBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Stosowanie BSA w całym tym protokole ogranicza niespecyficzne etykietowanie.
    2. Usunąć roztwór blokujący i inkubować komórki z 1:200 lub innym poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym w 0,1% BSA/1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie umyj trzykrotnie 1x PBS.
      UWAGA: Przeciwciało10 do wykrywania SSB/ORF6 (wirusowe jednoniciowe białko wiążące DNA) zastosowano w rozcieńczeniu 1:200.
    3. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym z fluoroforem zgodnym z przeciwciałem wykrywającym FISH przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć trzykrotnie 1x PBS. Następnie utrwal 4% formaldehydem/1x PBS przez 10-15 minut i przepuszczaj Triton-X lub 70% etanolem, jak opisano wcześniej, przed przystąpieniem do FISH. Przykryj szkiełko folią aluminiową, aby zachować sygnał fluorescencyjny i zapobiec fotowybielaniu.
  4. Umyj komórki 2x SSC (solny cytrynian sodu) raz, a następnie nałóż 45 μl roztworu hybrydyzacyjnego składającego się z 50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 μg/ml DNA plemników łososia, 125 μg/ml tRNA E. coli i 1 mM kompleksów rybonukleozydów wanadylu. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej, którą może być szalka Petriego o średnicy 150 mm z wilgotnymi sterylnymi chusteczkami.
    UWAGA: Przygotuj świeży roztwór hybrydyzacyjny co najmniej godzinę przed użyciem. Siarczan dekstranu należy najpierw rozpuścić w wodzie, często wirując i inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Oblicz, aby uzyskać sugerowane stężenie 25 μM oligonukleotydów w 35-μl roztworze hybrydyzacyjnym na komorę. W razie potrzeby dostosuj stężenie oligonukleotydu antysensownego. Dodać wodę destylowaną do oligonukleotydów, aby zwiększyć objętość denaturacji do 10 μl.
    UWAGA: Po reakcji znakowania oligonukleotydy są przechowywane w hartowanym roztworze zawierającym 0,18 M kakodylanu potasu, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/ml BSA, 4,5 mM CoCl2, 18 mM EDTA, 2,7 mM K-fosforanu i 6,8 mM KCl, 45 μM 2-merkaptoetanolu, 0,02% Triton X-100 i 2% glicerolu. Stężenia są na tyle wysokie, że rozcieńczenie wodą doprowadzi roztwór denaturacyjny do stężeń bliskich 1x TE (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA), standardowego buforu denaturacyjnego oligonukleotydów.
  6. Denaturować oligonukleotydy znakowane DIG i/lub Alexa Fluor 594 w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Następnie dodać 35 μl świeżego roztworu hybrydyzacyjnego na przeznaczoną komorę do zdenaturowanych oligonukleotydów. W przypadku wykonywania podwójnej FISH, oba zestawy oligonukleotydów antysensownych mogą być zdenaturowane i zhybrydyzowane razem.
  7. Usuń roztwór przed hybrydyzacją, a następnie dodaj do komórek roztwór hybrydyzacyjny zawierający znakowane oligonukleotydy. Inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C z folią aluminiową w celu ochrony oligonukleotydów znakowanych fluoroforem.
    UWAGA: Inkubacja powinna trwać co najmniej 10 godzin i nie więcej niż 24 godziny.
  8. Następnego dnia przemyć komórki dwukrotnie 2x SSC przez 10 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dwukrotnie 1x SSC przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
  9. Utrwal komórki wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem/1x PBS przez 10-15 minut na lodzie. Następnie przemyć ogniwa trzykrotnie PBS i przepuszczać przez 1 godzinę wstępnie schłodzonym 70% etanolem lub przez 10 minut wstępnie schłodzonym 0,5% Triton-X/1x PBS w temperaturze 4 °C.
  10. Inkubować komórki z 1:200 anty-DIG FITC we wstępnie schłodzonym 0,1% BSA/1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć trzykrotnie 1x PBS.
  11. Utrwalić wstępnie schłodzonym 4% formaldehydem/1x PBS przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie umyć trzy razy 1x PBS. W przypadku przeprowadzania immunofluorescencji białka gospodarza lub wirusa za pomocą pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego, należy przeniknąć komórki, a następnie wykonać protokół IF opisany w kroku 3.3.1. W przeciwnym razie przejdź do barwienia DAPI.
  12. Inkubować komórki z 0,4 μg/ml DAPI we wstępnie schłodzonym 0,5% Triton-X/1x PBS przez 15 minut na lodzie, a następnie przemyć trzykrotnie 1x PBS.
  13. Zamontuj prowadnice za pomocą koralików fluorescencyjnych (opcjonalnie) i medium montażowego. Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci.
  14. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zbierz obrazy próbek w ciągu godziny do tygodnia od wykonania protokołu w powiększeniu 630x. Nałóż wiele warstw lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i przedłużyć żywotność fluoroforu poprzez zmniejszenie szybkości utleniania.
    UWAGA: Nie używaj nośnika montażowego zawierającego DAPI. Zbierając obrazy, dołącz pasek skali na każdym obrazie w celu późniejszej kwantyfikacji. Koraliki fluorescencyjne służą jako elementy sterujące intensywnością fluorescencji między preparatami i preparatami próbek11. Uzyskaj obrazy w środkowej części komórki w celu dwuwymiarowej (2D) kwantyfikacji w kroku 4.

4. Kwantyfikacja obrazów FISH i IF w celu podkreślenia lokalizacji subkomórkowej i określenia nukleocytoplazmatycznego stosunku fluorescencji

  1. Przeprowadź analizę obrazu na zmontowanym stosie różnych obrazów barwionych fluorescencyjnie i scalonych, aby zapewnić spójność. Ustaw skalę oprogramowania do analizy obrazów za pomocą paska skali dołączonego podczas zbierania obrazów.
  2. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji w kilku kanałach i w odniesieniu do barwienia jądrowego DAPI, należy użyć narzędzia liniowego i funkcji profilu wykresu. Następnie zaznacz linię na stałe na kopii obrazu za pomocą markerów, które nie zasłaniają ani nie wpływają na ocenę widza.
    1. Ustal kryteria wskazujące, gdzie przebiega linia, taka jak ślad obejmujący różnorodność cech topograficznych, szczytów i dolin, wzdłuż osi środkowej lub linia, która nie przecina obszarów przesyconych.
      UWAGA: Te ślady linii przedstawiają surową fluorescencję w komórce, a zatem ograniczają się do porównań lokalizacji plamy, a nie intensywności. Aby porównać intensywność tej samej plamy między szkiełkami, zabiegami lub preparatami, dodaj koralik fluorescencyjny do szkiełka jako kontrolę wewnętrzną w kroku 3.13. Koralik fluorescencyjny musi zostać dodany podczas procesu montażu i wykryty przy tych samych ustawieniach na laserze wzbudzającym i lampie fotopowielacza (konfokal
      2. ).
  3. Aby określić ilościowo zmianę lokalizacji subkomórkowej, oblicz proporcje nukleocytoplazmatyczne komórek poddawanych różnym zabiegom.
    1. Zmierz obszar i intensywność surowej fluorescencji zarówno jądra, jak i cytoplazmy za pomocą jądrowego barwnika DAPI, aby wyznaczyć wewnętrzną granicę. Uwzględnij kontrole jądrowe i cytoplazmatyczne, takie jak jądrowy RNA (np. KSHV PAN RNA) i cytoplazmatyczne RNA (np. mRNA GAPDH gospodarza). Ponadto oblicz intensywność tła dla trzech obszarów przypominających komórki i uśrednij wartości na piksel lub μm2,
      UWAGA: W wartościach intensywności zwykle brakuje jednostek, dlatego używany jest termin "jednostki".
    2. Znormalizuj zarówno jądrowe, jak i komórkowe wartości surowej intensywności, najpierw określając średnie tło dla tego samego obszaru, a następnie odejmując tę zindywidualizowaną wartość od surowej intensywności obszaru.
      1. Na przykład jądro litycznej komórki B ma powierzchnię 133,4 μm2 i surową intensywność 75976 jednostek, podczas gdy intensywność tła dla tego samego sygnału fluorescencyjnego określono na 0,67 jednostki na μm2. Znormalizowana intensywność jądrowa wynosiłaby
        figure-protocol-1
    3. Wprowadź wartości w następującym równaniu.
      figure-protocol-2
      UWAGA: To obliczenie kontroluje zmiany w obszarze subkomórkowym. Indukcja lityczna i leczenie farmakologiczne mogą odpowiednio powiększyć jądro lub zmienić rozmiar komórki.
    4. Aby zinterpretować wyniki, utwórz wykres wąsów pudełkowych. Równy rozkład sygnału fluorescencyjnego byłby bliski zeru, podczas gdy rozkład jądrowy faworyzowałby dodatnią wartość stosunku, a rozkład cytoplazmatyczny wykazywałby tendencję w kierunku ujemnej wartości stosunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody FISH i IF szczegółowo opisane w tym manuskrypcie są pokazane w Rysunek 1 wraz z kwantyfikacją wyników za pomocą liniowych śladów intensywności fluorescencji. Przedstawione tutaj wyniki są półilościowe i dają wgląd w lokalizację, a nie w porównania intensywności różnych barwników fluorescencyjnych, ponieważ eksperymenty nie obejmowały kulki fluorescencyjnej w przygotowaniu szkiełka. Rysunek 1 pokazuje również, że obszary cy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym raporcie może być dostosowany do różnych typów komórek i obejmuje etapy dla podwójnego RNA FISH i RNA FISH z IF przy użyciu zarówno monoklonalnych, jak i poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych. Chociaż przygotowane preparaty są zwykle obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego, obrazowanie można wykonać za pomocą mikroskopu STED (stimulated emission depletion) po modyfikacji zwiększonego stężenia przeciwciał i innego podłoża montażowego. W celu lepszej analizy pojedynczych komórek, próbki p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jonathanowi Rodenfelsowi, Kazimierzowi Tycowskiemu i Johannie B. Withers za porady dotyczące analizy danych. Dziękujemy również G. Haywardowi za przeciwciało anty-SSB. Prace te były wspierane przez granty T32GM007223 i T32AI055403 z National Institutes of Health (dla TKV) oraz grant NIH (CA16038) (dla JAS). JAS jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Rysunki 1-3 i Tabela 1 zostały powielone za zgodą Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologii na licencji Creative Commons Attribution z następującej publikacji: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Accumulation in Nuclear Foci Is Influence by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenyled Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlexaFluor594-5-dUTPLife TechnologiesC1100
anti-DIG FITC Jackson Lab Immunologicals200-092-156
Anty-królicze wtórne AlexaFluor594 Przeciwciało monoklonalneInvitrogenA-11037Kozie
przeciwciało anty-SSBN/A/ARef. Chiou et al. 2002
BLASTnNIH NCBIN/AOprogramowanie do wyrównywania swobodnej sekwencji
Siarczan dekstranuSigma AldrichD8906Klasa biologii molekularnej
Zestaw do ogonowania oligonukleotydów DIGSigma Roche# 03353583910
Ośmiokomorowe prowadniceNunc Lab Tek II#154453Niebieska uszczelka sprzyja napięciu powierzchniowemu, ale dostępna jest również separacja za pomocą przezroczystego żelu. 
FormamidSigma AldrichF9037Biologia molekularna klasy
GAPDH SondyStellarisSMF-2019-1Kompatybilny z protokołem, Quasar 670
ImageJ NIH, Bethesda, MDN/ADarmowe oprogramowanie do analizy obrazu, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzerIDTN/AFree Oligonukleotyd Analyzer 
pcDNA3InvitrogenA-150228
pmaxGFPAmaxaVDF-1012
Poly L-LysineSigma AldrichP8920
Transferaza końcowaSigma Roche#003333574001
Kompleksy rybonukleozydowe wanadylu NEBS1402S
VectashieldVector Laboratories, Inc. H-1000DAPI w mediach montażowych rozprasza światło i zmniejsza kontrast.
N 2. generacji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81(2011).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  3. Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
  4. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300(2011).
  5. Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
  6. Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  9. Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
  10. Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
  11. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  12. Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
  13. Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
  14. Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
  15. Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
  16. Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
  17. Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
  18. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hybrydyzacja in situ RNA RNA FISHpodw jna hybrydyzacja in situ RNA Double RNA FISHhybrydyzacja in situ RNA z immunofluorescencj RNA FISH z IFilo ciowe nat enia fluorescencjimikroskopia konfokalnaWestern blotqPCR

Powiązane artykuły