Artykuł metodologiczny

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59700

⸱

16 września 2019

 , 
1School of Biosciences, University of Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Streszczenie

Guide box C/D małe jąderkowe RNA (snoRNA) katalizują 2'-O-metylację rybosomalnego i małego jądrowego RNA. Jednak duża liczba snoRNA u wyższych eukariontów może rozwiązle rozpoznawać inne gatunki RNA i wiele celów 2'-O-metylanu. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący szybkiej i niedrogiej analizy specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O przy użyciu dobrze znanej metody wykorzystującej krótkie oligonukleotydy DNA zwane DNAzymes. Te fragmenty DNA zawierają sekwencje katalityczne, które rozszczepiają RNA w określonych pozycjach konsensusu, a także zmienne ramiona homologiczne kierujące DNAzyme do jego celów RNA. Aktywność DNAzymu jest hamowana przez 2-'O-metylację nukleotydu sąsiadującego z miejscem cięcia w RNA. Tak więc DNAzymy, ograniczone jedynie konsensusem rozszczepionej sekwencji, są doskonałymi narzędziami do szybkiej analizy 2'-O-metylacji RNA za pośrednictwem snoRNA. Przeanalizowaliśmy snoRNA snR13- i snR47 sterowaną 2'-O-metylacją rybosomalnego RNA 25S w Saccharomyces cerevisiae, aby zademonstrować prostotę techniki i zapewnić szczegółowy protokół testu zależnego od DNAzyme.

Wprowadzenie

Modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów. Metylacja 2'-O i pseudourydylacja RNA, które są kierowane odpowiednio przez małe jąderkowe RNA (snoRNA) w pudełku C/D i w pudełku H/ACA, chronią RNA przed degradacją i stabilizują ich struktury wyższego rzędu1,2,3. Cele SnoRNA zostały zidentyfikowane głównie w rybosomalnych RNA (rRNA) i małych jądrowych RNA (snRNA). Jednak u wyższych eukariontów istnieją potencjalnie setki snoRNA bez przypisanych funkcji, a niektóre z nich mogą rozpoznawać wiele RNA1,4,5,6,7. Dlatego też metody, które pozwalają na identyfikację i analizę modyfikacji sterowanych przez snoRNA, są ważnymi narzędziami w odkrywaniu mechanizmów rządzących procesami komórkowymi.

A pole C/D domniemane miejsce metylacji 2'-O snoRNA może być zidentyfikowane bioinformatyczną i potwierdzone eksperymentalnie za pomocą wielu technik, w tym rozszczepienia skierowanego przez RNazę H, lub metod specyficznych dla miejsca i całego genomu, które wykorzystują odwrotną transkrypcję w podejściu o niskim stężeniu nukleotydów (dNTPs)8,9,10,11. Techniki te są bardzo czułe, ale także pracochłonne i kosztowne, dlatego mogą nie być odpowiednie do wstępnych lub szybkich testów. Jedną z najprostszych i najtańszych metod identyfikacji miejsc metylacji 2'-O jest DNAzyme-zależne od DNA rozszczepienie RNA12. DNAzymy to krótkie, jednoniciowe i katalitycznie aktywne cząsteczki DNA zdolne do endonukleolitycznego rozszczepienia RNA w określonych pozycjach. Składają się one z konserwatywnej i katalitycznie aktywnej sekwencji rdzenia oraz ramion wiążących 5' i 3' złożonych ze zmiennych sekwencji zaprojektowanych do hybrydyzacji przez parowanie zasad Watsona-Cricka z celem RNA (Figura 1). W ten sposób ramiona 5' i 3' dostarczają sekwencję katalityczną do określonego miejsca RNA. Rozszczepienie zależne od DNAzymu jest hamowane przez 2'-O-metylację nukleotydu umieszczonego bezpośrednio przed miejscem rozszczepienia12,13. To sprawia, że DNAzymes jest bardzo praktycznym narzędziem do analizy przypuszczalnych lub znanych miejsc metylacji 2'-O RNA.

Dwa rodzaje DNAzymów są używane do analiz modyfikacji RNA12. Aktywna sekwencja 10-23 DNAzyme (Rysunek 1A) składa się z 15 nukleotydów (5'RGGCTAGCTACAACGA3'), które tworzą pętlę wokół docelowego dinukleotydu RNA puryna-pirymidyny (RY) i katalizują rozszczepienie między tymi dwoma nukleotydami. Puryna RNA (R) nie jest sparowana z DNAzymem, a metylacja 2'-O obecna na DNAzymie hamuje rozszczepienie. Ramiona wiążące 10-23 DNAzymy mają zwykle długość 10-15 nukleotydów. Druga klasa DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Rysunek 1B) zawiera 14-nukleotydową sekwencję katalityczną (5'TCCGAGCCGGACGA3'). NukleotydyC2, C, 3 iG4 łączą się z C, 9, G, 10 iG11, tworząc krótką strukturę łodygowo-pętlową. 8-17 DNAzymy rozszczepiają RNA przed dowolną guaniną, która jest nieidealnie sparowana z pierwszą tyminą z aktywnej sekwencji DNAzyme. Nukleotyd RNA przed guaniną nie jest sparowany z DNAzymem, a jego metylacja 2'-O upośledza rozszczepienie. 8-17 DNAzymy wymagają dłuższych ramion homologicznych wynoszących około 20 nukleotydów, aby skierować DNAzyme do jego określonej sekwencji.

Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół analizy 2'-O-metylacji rRNA w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu podejść zależnych od DNAzyme 10-23 i 8-1712,13 (Rysunek 1C). Protokół ten można łatwo dostosować do innych organizmów i gatunków RNA i zastosować do szybkich, wstępnych lub głównych analiz specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O-M RNA.

Protokół

1. Szczepy, podłoża i receptury buforowe

  1. Przygotuj pożywkę drożdżową (S. cerevisiae) zgodnie z opisem tutaj: YP (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu bakteriologicznego) oraz zapasy glukozy i galaktozy w stężeniu 20% w/v.
  2. Przygotować bufor octanu sodu (NaAc)-EDTA (AE) zgodnie z opisem tutaj: 50 mM NaAc pH 5,3 i 10 mM EDTA.
  3. Przygotuj 10-23 DNAzyme 4x bufor inkubacyjny zgodnie z opisem tutaj: 24 mM Tris pH 8,0, 60 mM NaCl i 10-23 DNAzyme 4x Bufor reakcyjny: 200 mM Tris pH 8,0 i 600 mM NaCl.
  4. Przygotuj 8-17 DNAzyme 2x bufor reakcyjny zgodnie z opisem tutaj: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2 i 15 mM MnCl2.
  5. Przygotuj 10x bufor MOPS zgodnie z opisem tutaj: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 i 1,5x Bufor do denaturacji próbki: 50% v/v formamidu, 20% v/v formaldehydu, 1,5x bufor MOPS.
  6. Otrzymanie szczepów S. cerevisiae, BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 (jako BY4741, ale GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (jako BY4741, ale GAL1::SNR47:HIS3mX). Do tej analizy można użyć dowolnego innego szczepu drożdży.

2. Projekt DNAzyme

  1. Znajdź interesującą sekwencję RNA lub przypuszczalne miejsce metylacji, korzystając z odpowiedniej bazy danych. W przypadku celów snoRNA S. cerevisiae należy użyć bazy danych snoRNA drożdży: http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
  2. Aby znaleźć interesujące nas miejsce metylacji, np. miejsce zależne od snR13, wybierz "snR13" i zanotuj położenie zmodyfikowanego nukleotydu (np. A2281 kierowanego snR13 w 25S rRNA).
  3. Znajdź sekwencje przed i za zmodyfikowanym nukleotydem, korzystając z odpowiedniej bazy danych. W przypadku S. cerevisiae należy skorzystać z bazy danych genomu Saccharomyces: https://www.yeastgenome.org/
  4. Wyszukaj nazwę docelowego genu, np. RDN25 (kodujący 25S rRNA).
  5. Z zakładki "sekwencja" wybierz 10-15 nukleotydów przed (ramię 5') i za (ramię 3') miejsca metylacji przy użyciu testu 10-23 DNAzyme i 20 nukleotydów przed (ramię 5') i za (ramię 3') dla 8-17 DNAzymu.
  6. Twórz komplementarne sekwencje ramion 5' i 3'.
  7. Flankuj sekwencję katalityczną 10-23 lub 8-17 DNAzyme z komplementarnymi sekwencjami ramion 5' i 3'.
  8. Zamów DNAzyme jako normalny oligonukleotyd DNA od dostawcy.

3. Warunki wzrostu S. cerevisiae

UWAGA: Użyto pochodnych szczepu S. cerevisiae BY4741, w których ekspresja snoRNA SNR13 lub SNR47 jest sterowana przez indukowalny promotor GAL1. W celu indukcji lub zahamowania ich syntezy należy hodować komórki na pożywce zawierającej galaktozę (transkrypcja zależna od GAL1) lub glukozę (transkrypcja zależna od GAL1). Jako kontrolę użyj szczepu typu dzikiego (BY4741) uprawianego na galaktozie lub glukozie.

  1. Uprawiaj szczepy drożdży w odpowiednim podłożu i warunkach. Aby przeanalizować szczepy GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47, a także izogeniczny szczep typu dzikiego, należy wyhodować komórki w 50 ml pożywki YP z 2% glukozą (YPD) lub galaktozą (YPGal) w temperaturze 30 °C do środkowej fazy wykładniczej.
  2. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić supernatant i zachować granulki.
  4. Zamrażać granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    ostrożność: Ciekły azot może powodować poważne oparzenia kriogeniczne. Zawsze noś odzież ochronną i środki ostrożności podczas ćwiczeń.
    nuta: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 miesiąca. W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać.

4. Izolacja RNA15

UWAGA: Użyj najbardziej odpowiedniej metody do izolacji RNA. W przypadku drożdży S. cerevisiae można zastosować ekstrakcję RNA gorącym fenolem.

  1. Dodaj 1 ml lodowatej wody, ponownie zawieś granulki i przenieś zawieszone komórki do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Wirować przy 20 000 x g przez 10 s w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  3. Dodać 400 μl buforu AE i ponownie zawiesić komórki.
    nuta: Kroki 4.4-4.15 wykonuje się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
  4. Dodać 40 μl 10% SDS i 400 μl kwaśnego fenolu (pH 4,5).
    ostrożność: Fenol jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary podczas pracy z fenolem. Utylizować odpady zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  5. Dobrze wymieszaj, wirując przez 20 sekund.
  6. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Co 2 minuty delikatnie otwieraj i zamykaj rurkę, aby zwolnić ciśnienie i obróć rurkę 2-3 razy, aby wymieszać fazy.
  7. Przenieść probówki do temperatury -80 °C i inkubować przez 10 minut.
  8. Rozmrozić probówki na stole i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przenieść górną fazę do nowej probówki zawierającej 400 μl kwasu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1). Nie zakłócaj interphase.
    ostrożność: Chloroform jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Podczas pracy z chloroformem zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  10. Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Przenieść górną fazę (~400 μL) do nowej probówki zawierającej 400 μL chloroformu.
  12. Dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Przenieś górną fazę (~300-350 μL) do nowej probówki zawierającej 1 ml EtOH i 40 μl 7,5 M octanu amonu (NH4AC). Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.
  14. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C.
    nuta: W tym miejscu procedurę można wstrzymać.
  15. Wirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki pojawi się mały, biały granulek RNA.
  16. Usunąć EtOH przez pipetowanie, aby uniknąć naruszenia osadu.
  17. Dodaj 1 ml 70% EtOH i odwiruj przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  18. Usunąć 70% EtOH przez pipetowanie.
  19. Wirować przy 20 000 x g przez 15 s i usunąć pozostały EtOH za pomocą pipety o pojemności 2-20 μl.
  20. Pozostaw probówkę otwartą na ławce na 5 minut, aby wysuszyć osad RNA.
    nuta: Osad RNA po wyschnięciu zmienia kolor z białego na przezroczysty
    21. .
  21. Zawiesić osad RNA w 30 μlH2Owolnego od RNaz/DNaz, natychmiast przenieść probówkę na lód i zmierzyć stężenie RNA na mikrospektrofotometrze.
  22. Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C.
    nuta: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca i w temperaturze -80 °C do 1 roku. Procedurę można w tym miejscu wstrzymać lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.

5. Trawienie DNAzymu

  1. 10-23 DNAtrawienie zymu
    1. W probówkach o pojemności 1,5 ml przygotuj mieszaninę inkubacyjną, łącząc 5 μg RNA, 200 pmol 10-23 DNAzymu (2 μl 100 μM roztworu podstawowego) i 2,5 μl 4x 10-23 buforu inkubacyjnego w całkowitej objętości 10 μL. Trzymaj probówki na lodzie.
    2. Przenieść probówki do suchego bloku grzewczego ustawionego w temperaturze 95 °C i inkubować przez 3 minuty.
    3. Natychmiast przenieś probówki na lód i inkubuj przez 5 minut.
    4. Odkręć na chwilę i połóż rurki z powrotem na lodzie.
    5. Dodać 20 j. inhibitora RNazy (np. 0,5 μl inhibitora RNazy RiboLock).
    6. Umieścić probówki w suchym bloku grzewczym ustawionym na 25 °C i inkubować przez 10 minut.
    7. W międzyczasie należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce o pojemności 1,5 μl, łącząc 5 μl 4x 10-23 buforu reakcyjnego z 4 μl 300 mM MgCl2 i 1 μLH2O. Umieścić probówkę w suchym bloku ustawionym na 37 °C.
    8. Przenieść mieszaninę inkubacyjną do suchego bloku grzewczego ustawionego na 37 °C i dodać 10 μl wstępnie podgrzanej mieszaniny reakcyjnej.
    9. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    10. Przenieś probówki na lód i przejdź do kroku 5.3.1.
  2. 8-17 DNAtrawienie zymu
    1. Przygotować mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml z 5 μg RNA w łącznej objętości 6 μl. Probówkę należy trzymać na lodzie.
    2. Przygotuj mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml z 400 pmol 8-17 DNAzyme (4 μl ze 100 μM zapasu). Trzymaj probówkę na lodzie.
    3. Przenieść probówki do suchego bloku grzewczego ustawionego na 95 °C i inkubować przez 2 minuty.
    4. Przenieś próbkę RNA na lodzie.
    5. Wirować probówkę z DNAzymem przez 5 s i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
    6. W tym samym czasie przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml z 10 μl 2x 8-17 buforu reakcyjnego i inkubować w temperaturze 25 °C.
    7. Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając 10 μl wstępnie podgrzanego buforu reakcyjnego 2x do probówki z DNAzymem.
    8. Przenieść 14 μl mieszaniny reakcyjnej do probówki z RNA i dodać 20 j. inhibitora RNazy.
    9. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 2 godziny.
    10. Przenieść probówkę na lód i przystąpić do oczyszczania RNA (krok 5.3.1).
  3. Oczyszczanie RNA
    1. Dodać 350 μl wody i 400 μl chloroformu do probówki reakcyjnej, dobrze wymieszać przez wirowanie przez 30 s i odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś górną fazę (~300-350 μL) do nowej probówki zawierającej 1 ml EtOH, 40 μl 7,5 M NH4AC i 1 μl glikogenu (10 μg/μL). Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy.
    3. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C.
      nuta: W tym miejscu procedurę można wstrzymać.
    4. Powtórz kroki od 4.15 do 4.21.
    5. Zawiesić osad RNA w 10 μl H2O wolnego od RNazy/DNaz i natychmiast przenieść probówki na lód.
    6. Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C.
      nuta: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do miesiąca i w temperaturze -80 °C do 1 roku. W tym miejscu procedurę można przerwać lub przejść do elektroforezy RNA.

6. Elektroforeza RNA

  1. Spryskaj sprzęt do elektroforezy (zbiornik, tackę, grzebień) 1% SDS, pozostaw na 15 minut i spłucz dużą ilością ddH2O.
  2. Rozpuść 1,5 g agarozy w 127,5 ml ddH2O, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej.
  3. Dodaj 15 ml 10x MOPS i 7,5 ml 37% formaldehydu do roztworu agarozy (całkowita objętość wynosi 150 ml).
    ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny i powinien być przenoszony pod wyciągiem. Podczas pracy z formaldehydem zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  4. Do roztworu agarozy dodać odpowiednią ilość wybranego barwnika żelowego (np. 15 μl barwnika żelowego SYBR Safe DNA). Dobrze wymieszaj i wlej agarozę na tacę.
  5. Natychmiast włóż grzebień do żelu.
  6. Pozostaw na 45 minut pod wyciągiem. Przykryj tacę folią aluminiową, gdy używasz światłoczułej plamy z żelu.
  7. Przygotuj 600 ml 1x buforu MOPS.
  8. Przygotowanie próbki RNA
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 10 μl strawionej i oczyszczonej próbki RNA, 5 μl buforu do denaturacji próbki i 0,5 μl 6-krotnego barwnika ładującego.
      ostrożność: Formamid jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem. Podczas pracy z formamidem należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary. Odpady należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    2. Próbki RNA inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut. Próbki przenieść na lód. Inkubować przez 5 minut.
    3. Odkręć na chwilę przed załadowaniem żelu.
  9. Umieść żel w zbiorniku do elektroforezy i napełnij 1x buforem MOPS. Załadować całą objętość każdej próbki (15 μl) na żel. Pracować pod napięciem 80 V, aż błękit bromofenolowy osiągnie 2/3 długości żelu.
  10. Zobrazuj żel za pomocą imagera odpowiedniego do wykrycia wybranej plamy żelowej (np. transilluminator UV).

Wyniki

Użyteczność cięcia zależnego od DNAzymu w analizie modyfikacji rRNA została niedawno wykazana w kontekście dojrzewania snoRNA13. Analiza zależna od DNAzymu została wykorzystana do wykazania, że brak przetwarzania 5’-końca pre-snoRNA wpływa na poziomy 2’-O-metylacji 25S i 18S rRNA w S. cerevisiae13.

W tym przypadku wykorzystano indukowalny system transkrypcji snoRNA, aby zademonstrować skuteczność i prostotę tej techniki. snoRNA Box C/D snR13 kieruje metylację w dwóch pozycjach 25S rRNA, w tym w adeninie 281 (Rycina 2A). Za tym nukleotydem następuje uracyl, co tworzy konsensusowy dinukleotyd (RY) podatny na cięcie przez DNAzym 10-23. Box C/D snR47 również kieruje metylacją dwóch nukleotydów w 25S rRNA (Rycina 2B). Za adeniną w pozycji 20 następuje reszta guaniny i ten dinukleotyd może być cięty przez DNAzym 8-17. Aby indukować lub hamować syntezę snoRNA snR13 lub snR47, wprowadzono indukowalny promotor GAL1 powyżej genów SNR13 lub SNR47 i hodowano komórki w medium zawierającym galaktozę (transkrypcja zależna od GAL1 włączona) lub glukozę (transkrypcja zależna od GAL1 wyłączona). Następnie RNA wyizolowane z komórek GAL1::SNR13 inkubowano z DNAzymem 10-23 zaprojektowanym do cięcia 25S rRNA w miejscu zależnym od snR13, pomiędzy nukleotydami 2281 i 282 (Rycina 2C). RNA ze szczepu GAL1::SNR47 poddano działaniu DNAzymu 8-17 celującego w miejsce zależne od snR47 pomiędzy nukleotydami 220 i 21 (Rycina 2D). Jako kontrolę RNA ze szczepu typu dzikiego BY4741 rosnącego na galaktozie lub glukozie inkubowano z obydwoma DNAzymami. Elektroforeza RNA traktowanego DNAzymami wykazała, że 25S rRNA wyizolowane ze szczepów GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 rosnących na galaktozie (GAL) pozostało nienaruszone (Rycina 3A,B; ścieżki 3). W przeciwieństwie do tego, RNA wyizolowane z komórek GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 rosnących na glukozie (GLC) zostało strawione przez odpowiednie DNAzymy (Rycina 3A,B; ścieżki 4). W obu przypadkach prążek 25S rRNA uległ zmniejszeniu i zaobserwowano produkty cięcia z końców 5’ i 3’ (A i B). Wskazuje to, że w szczepach GAL1::SNR13 i GAL1::SNR47 25S rRNA uległo 2’-O-metylacji w miejscach kierowanych przez snR13 lub snR47, gdy galaktoza służyła jako źródło węgla i te snoRNA były ekspresjonowane. Brak metylacji 25S rRNA po wyłączeniu ekspresji snR13 lub snR47 na glukozie umożliwił cięcie zależne od DNAzymu. Nie zaobserwowano trawienia RNA w próbkach typu dzikiego (Rycina 3A,B; ścieżki 1 i 2), ponieważ ekspresja snR13 i snR47 w tym szczepie jest niezależna od galaktozy/glukozy. W związku z tym rRNA było prawidłowo zmetylowane, a zatem oporne na aktywność DNAzymów.

Ogólnie nasz eksperyment wykazuje, że aktywność cięcia DNAzymów 10-23 (Rysunek 3A) oraz 8-17 (Rysunek 3B) korelowała z brakiem snoRNA snR13 lub snR47 typu box C/D, co wyraźnie wskazuje, że te snoRNA są odpowiedzialne za 2’-O-metylację 25S rRNA w konkretnych miejscach.

Schemat procesu cięcia przez DNAzym; sekwencje, ścieżki cięcia, etapy schematu doświadczalnego.
Rysunek 1: DNAzymy i ich substraty RNA. (ADNAzymy 10-23 rozcinają dinukleotyd RNA puryna-pirymidyna (RY). R w RNA nie tworzy pary z DNAzymem, natomiast Y jest komplementarny do zasady R w DNAzymie. Metylacja puryny (R) w RNA hamuje rozcinanie zależne od DNAzymu.B) DNAzymy 8-17 przecinają RNA powyżej guaniny, która jest niedoskonałe sparowana z pierwszą tyminą w katalitycznej sekwencji DNAzymu. Nukleotyd poprzedzający guaninę nie jest sparowany, a jego metylacja chroni przed cięciem zależnym od DNAzymu. RNA przedstawiono w kolorze szarym (z wyjątkiem miejsca metylacji), a DNAzym w kolorze fioletowym. N = dowolny nukleotyd, R = puryna: adenina lub guanina, Y = pirymidyna: cytozyna lub uracyl; CH3- oznacza metylację RNA. Pary zasad w obrębie aktywnych sekwencji DNAzymu zaznaczono liniami przerywanymi. Niebieska błyskawica oznacza miejsce cięcia. (C) Schemat blokowy przedstawiający etapy analizy zależnej od DNAzymu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

DNazym celujący w metylację zależną od snR13/snR47, analiza sekwencji genów, schemat.
Rysunek 2: DNAzymy celujące w miejsca metylacji zależne od snR13 i snR47 w 25S rRNA. (A, BZrzuty ekranu z przeglądarki przedstawiające zależne od snR13 (A) i zależne od snR47 (B) miejsca metylacji w 25S rRNA (C) sekwencja 25S rRNA w otoczeniu miejsca metylacji zależnej od snR13 (A2281) oraz DNAzymu 10-23 (zaznaczony na fioletowo), zaprojektowanego do rozcinania RNA pomiędzy A2281 oraz U2282. A2281 nie jest sparowany z DNAzymem, podczas gdy U2282 tworzy parę z pierwszym nukleotydem aktywnej sekwencji DNAzymu (oznaczonej niebieską linią). Niebieski symbol błyskawicy oznacza miejsce cięcia. (D) sekwencja 25S rRNA w obrębie miejsca metylacji zależnej od snR47 (A2220) oraz DNAzym 8-17 (zaznaczony na fioletowo), zaprojektowany do rozcinania RNA pomiędzy A2220 oraz G2221. A2220 nie hybrydyzuje z DNAzymem, podczas gdy G2221 jest niedoskonale sparowany z tyminą (oznaczone przerywaną linią). Niebieski symbol błyskawicy wskazuje miejsce cięcia. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Wyniki elektroforezy żelowej po traktowaniu DNAzymą; prążki 25S i 18S rRNA; analiza snR13, snR47.
Rysunek 3: Analiza specyficznych dla miejsca 2’-O-metylacji 25S rRNA z wykorzystaniem testu zależnego od DNAzymów 10-23 i 8-17. (A) Analiza metylacji 25S rRNA zależna od snR13 z wykorzystaniem DNAzymu 10-23. (BAnaliza metylacji 25S rRNA zależna od snR47 z wykorzystaniem DNAzymu 8-17. RNA wizualizowano za pomocą barwienia w denaturującym żelu agarozowym. Produkty cięcia A i B zaznaczono czerwonymi strzałkami. WT = szczep dziki; GAL = galaktoza, GLC = glukoza. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Trawienie zależne od DNAzymu może być stosowane jako prosta i szybka metoda analizy specyficznej dla miejsca metylacji 2'-O RNA12,13. DNAzymy rozszczepiają RNA, jeśli nukleotyd znajdujący się przed miejscem rozszczepienia nie jest metylowany. W przeciwieństwie do innych podejść, w tym trawienia kierowanego przez RNazę H, degradacji alkalicznej lub odwrotnej transkrypcji w niskich stężeniach nukleotydów, a następnie ilościowego PCR lub sekwencjonowania 8,10,11,16, podejście DNAzyme wymaga prostego oligonukleotydu DNA i podstawowych odczynników, które są obecne w każdym laboratorium biologii molekularnej. Co więcej, DNAzymy mogą być wykorzystywane w podobny sposób do analizy pseudourydylacji RNA, w której pośredniczy snoRNA12 box H/ACA, co czyni je wszechstronnymi narzędziami w badaniu celów snoRNA.

Podejścia zależne od DNAzymu są ograniczone jedynie przez sekwencje konsensusu miejsca rozszczepienia17. 10-23 DNAzymy mogą być używane do analizy metylacji 2'-O tylko w pozycji R dinukleotydu RY, podczas gdy DNAzymy 8-17 rozpoznają modyfikację nukleotydu znajdującego się przed guaniną. W rezultacie nie można analizować modyfikacji, takich jak metylacja 2'-O pierwszego nukleotydu w dinukleotydach guanina-adenina (GA), adenina-adenina (AA), pirymidyno-adenina (YA) i pirymidyna-pirymidyna (YY). Ponadto należy wziąć pod uwagę niską skuteczność rozszczepienia DNAzymezależnego od 12 . Chociaż niektóre DNAzymy rozszczepiają RNA prawie całkowicie (Figura 3B), wiele DNAzymów tylko częściowo trawi swoje cele (Figura 3B). Skuteczność może zależeć od sekwencji otaczającej miejsce rozszczepienia. Na przykład regiony RNA z odcinkami tego samego nukleotydu mogą wpływać na prawidłowe pozycjonowanie sekwencji aktywnej DNAzyme. Co więcej, regiony RNA tworzące silną strukturę drugorzędową mogą ponownie hybrydyzować i hamować wiązanie DNAzymu z sekwencją docelową. Aby przezwyciężyć te problemy, można zastosować cykle ogrzewania i chłodzenia 10-23 DNAzymu i jego substratu RNA18.

Zastosowaliśmy podejście DNAzyme do zbadania metylacji 2'-O rRNA. Można również użyć tej techniki do analizy innych modyfikacji RNA, takich jak N 6-metyloadenozyna19. Rybosomalne RNA, ze względu na swoją obfitość, można analizować za pomocą elektroforezy, a produkty rozszczepienia można uwidocznić w świetle UV. Nie dotyczy to jednak mniej licznych RNA, takich jak kodujące RNA (mRNA) i niekodujące RNA (ncRNA) generowane przez polimerazę II. Te RNA zwykle nie mogą być wykryte bezpośrednio przez barwienie RNA w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych. W takich przypadkach rozszczepienie zależne od DNAzymu można uwidocznić za pomocą Northern blot, pośrednio wykryć za pomocą PCR/ilościowego PCR lub przeanalizować za pomocą ilościowego PCR z polimerazami (np. Polimerazą DNA KlenTaq) zdolnymi do odróżnienia 2′-O-metylowanego RNA od niemetylowanego RNA20,21.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Mayi Wilson i Aneice Leney za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Henry'ego Dale'a ufundowane wspólnie przez Wellcome Trust i Royal Society (200473/Z/16/Z).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Acid fenolSIGMAP4682
AgarozaVWRA2114
Octan amonuSIGMAA1542
ChlorophormFisher scientific10293850
Woda wolna od DNazy/RNazFischer Scientific10526945
DNAzymeZintegrowana technologia DNANiestandardowe oligo DNA
EDTASIGMAE9884
Absolutny etanolFisher 10437341
naukowy FormaldehydSigmaF8775
FormamidsigmaF9037
GalaktozaSIGMAG0750
Barwnik ładujący żelThermo Fisher ScientificR0611
GlukozaSIGMAG7021
GlikogenThermo Fisher ScientificR0561
HEPESSIGMAH3375
IzoamylSIGMAW205702
KClSIGMAP9333
MgCl2SIGMAM8266
MnCl2SIGMA244589
MOPSSIGMAM1254
NaClSIGMAS7653
Oxoid Pepton BakteriologicznyThermo Fisher ScientificLP0037
Ekstrakt z drożdży oxoidowych w proszkuThermo Fisher ScientificLP0021
RNaza RiboLock Inhibitor (40 U/&mikro; L)Thermo Fisher ScientificEO0382
SDSSIGMA74255
Trójwodny octan soduSIGMAS8625
SYBR Bezpieczna plama żelowa DNAThermo Fisher ScientificS33102
Tris bazaSIGMATRIS-RO
silny>NazwaFirma Numer katalogowyUwagi
Equipment
1,5 mL mikroprobówkiSarstedt
152VR5C01M -80° Zamrażarka CThermo Fisher Scientific
250 ml Kolby ErlenmeyeraCole-Parmer
50 ml probówki stożkoweSarstedt
Combicup VX200 vortexAppleton Woods
DS-11Denovix
Komora do elektroforezy (taca 20 cm)SIGMA
Miernik pH FiveEasy F20Appleton Woods
Mikrowirówka Syngene
Heraeus Fresco 21Wirówka Fisher Scientific
Megafuge 8R z rotatorem odpowiednia do probówek stożkowych 50 mlWirówka Fisher Scientific
Mini Fuge PlusStarlab
Mieszalnik HC blok termicznyStarlab
OLS26 Kąpiel z wytrząsaniemGrant
PowerPac zasilaczBioRad
< Mikrospektrofotometr System dokumentacji żelu

Bibliografia

  1. Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
  2. Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
  3. Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
  4. Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
  5. Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
  6. Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
  7. Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage? BMC Genomics. 12, 543(2011).
  8. Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
  9. Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
  10. Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157(2012).
  11. Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
  12. Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
  13. Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783(2018).
  14. Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
  15. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
  16. Maden, B. E. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
  17. Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
  18. Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
  19. Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
  20. Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
  21. Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza DNAzymemmetylacja RNAfunkcja snoRNArybosomalny RNAelektroforeza RNAizolacja RNAtrawienie DNAzymemSaccharomyces cerevisiaemetylacja specyficzna dla miejsca
Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.