Ciągłe pobieranie próbek krwi w pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej małych zwierząt umożliwia pomiar funkcji wejściowej tętnicy

Podsumowanie

Tutaj opisany jest protokół ciągłego pobierania próbek krwi podczas obrazowania PET/CT szczurów w celu pomiaru funkcji wejścia tętniczego (AIF). Przedstawiono cewnikowanie, kalibrację i konfigurację systemu oraz analizę danych dotyczących radioaktywności krwi. Wygenerowane dane dostarczają parametrów wejściowych do późniejszego modelowania biokinetycznego.

Streszczenie

Dla analizy ilościowej i modelowania biokinetycznego danych z pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT), określenie stężenia czasowego aktywności czasowej krwi, znanego również jako funkcja wejścia tętniczego (AIF), jest kluczowym punktem, szczególnie dla charakterystyki modeli chorób zwierzęcych i wprowadzenia nowo opracowanych radioznaczników. Wiedza na temat dostępności radioznaczników we krwi pomaga w interpretacji danych dotyczących aktywności tkanek pochodzących z PET/CT. W tym celu zaleca się pobieranie krwi online podczas obrazowania PET/CT w celu pomiaru AIF. W przeciwieństwie do ręcznego pobierania krwi i metod opartych na obrazie, ciągłe pobieranie próbek krwi online ma kilka zalet. Oprócz zminimalizowanej utraty krwi, istnieje lepsza rozdzielczość i doskonała dokładność pomiaru aktywności krwi. Jednak główną wadą pobierania próbek krwi online jest kosztowne i czasochłonne przygotowanie do cewnikowania naczyń udowych zwierzęcia. W tym miejscu opisujemy łatwy i kompletny przebieg cewnikowania i ciągłego pobierania próbek krwi podczas obrazowania PET/CT u małych zwierząt i porównaliśmy go z ręcznym pobieraniem krwi i podejściem opartym na obrazie. Korzystając z tego wysoce ustandaryzowanego przepływu pracy, demonstruje się oznaczanie fluorodeoksyglukozy ([¹⁸F]FDG) AIF. Co więcej, procedura ta może być zastosowana do dowolnego radioznacznika w połączeniu z różnymi modelami zwierzęcymi w celu uzyskania podstawowej wiedzy na temat kinetycznej i modelowej charakterystyki znacznika. Pozwala to na bardziej precyzyjną ocenę zachowania farmaceutyków, zarówno w przypadku podejść diagnostycznych, jak i terapeutycznych w badaniach przedklinicznych chorób onkologicznych, neurodegeneracyjnych i mięśnia sercowego.

Wprowadzenie

Pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa (PET/CT) to technologia obrazowania jądrowego, która umożliwia wizualizację procesów metabolicznych w organizmie po wstrzyknięciu radioaktywnie znakowanego ligandu, zwanego również znacznikiem. Podczas gdy ligand jest cząsteczką, która bierze udział w szlaku metabolicznym lub jest ukierunkowana na białka powierzchniowe komórki, znacznik radioaktywny jest radionuklidem emitującym pozytony. Promienie gamma są pośrednio emitowane przez rozpad pozytonów i pozwalają na wykrycie jego dystrybucji w organizmie za pomocą pozaustrojowych detektorów PET. W ten sposób można celować w różne cząsteczki komórkowe: receptory i transportery neuroprzekaźników, procesy metaboliczne, takie jak glikoliza lub białka mitochondrialne, takie jak białko translokacyjne 18 kDa (TSPO), w celu wykrycia aktywowanych komórek glejowych.

W badaniach przedklinicznych, PET/CT jest atrakcyjną metodą do badania procesów biochemicznych w sposób nieinwazyjny in vivo, umożliwiając tym samym badania podłużne. Dane z badań PET/CT pomagają w analizach mechanizmów chorobowych, ocenie charakterystyki i farmakokinetyki nowych leków oraz walidacji zarówno obecnych, jak i nowych radioznaczników na potrzeby badań translacyjnych.

Podczas analiz PET/CT można zdefiniować trzy stany znacznika (przykład modelu z 2 przedziałami tkankowymi): Po pierwsze, znacznik przepływa we krwi po jego zastosowaniu (stan 1; stężenie _[krew]). Po drugie, dostaje się do tkanki przez łożysko kapilarne i może tam albo swobodnie poruszać się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, albo jest niespecyficznie związany z różnymi strukturami komórkowymi lub zewnątrzkomórkowymi (stan 2; konc. _[unspec]). Po trzecie, znacznik może być specyficznie związany (z pułapką metaboliczną lub bez) ze swoją cząsteczką docelową (stan 3, stężenie_). Wszystkie te dynamiczne procesy między przedziałami są do pewnego stopnia dwukierunkowe, a procesy dyfuzji są opisane stałymi szybkości (K1, k2, k3 i k4). Podczas gdy stężenie znacznika we krwi (tj. stan 1) nazywa się "wejściem", stężenie niespecyficznie i specyficznie związanego znacznika (tj. stan 2 i stan 3) nazywa się "wyjściem" i może być bezpośrednio określone na podstawie obrazu PET. Ta fizjologiczna zależność może być przedstawiona w modelu 2-tkankowym (Rysunek 1).

Rysunek 1: Model dwutkankowy. Wyświetlane są warunki fizjologiczne trzech różnych stanów znacznika oraz procesy dynamiczne zachodzące między nimi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W idealnym przypadku, conc._[spec] jest proporcjonalne do stężenia docelowej cząsteczki. Jednak wynik pomiaru PET/CT jest sumą stężeń _[spec] i konc. _[unspec]. Aby określić stężenie _[spec] w obszarze zainteresowania, równolegle określa się stężenie _[unspec] regionu referencyjnego pozbawionego docelowego białka/szlaku. Korzystając z odpowiednich równań matematycznych, można teraz obliczyć koncentrację_, najczęściej przy użyciu modelu kompartmentowego (podejście do modelowania biokinetycznego). Jednak w wielu przypadkach taki region referencyjny pozbawiony białka docelowego nie jest dostępny^1,2. W takich przypadkach stężenie _krwi może być użyte do określenia stężenia _[spec]. Ponieważ stężenie _[krwi] różni się ze względu na różny klirens wątroby i nerek, wydalanie, przepływ krwi, różne przenikanie bariery mózgowo-krwionośnej i czynniki związane z chorobą³, obecnym złotym standardem jest pomiar stężenia _[krwi] równolegle do skanu PET/CT poprzez ciągłe pobieranie próbek krwi. Daje to tętniczą funkcję wejściową (AIF), która jest zdefiniowana jako conc._[blood] w czasie⁴. Warto zauważyć, że wykonywanie ciągłego pobierania próbek krwi jest uważane za technicznie bardzo trudne, zwłaszcza u małych zwierząt, takich jak szczury czy myszy⁵.

Tutaj oferujemy łatwy i praktyczny protokół ciągłego pobierania próbek krwi od szczurów za pomocą przecieku tętniczo-żylnego (a-v) między żyłą udową a tętnicą. W połączeniu z dostępnym na rynku systemem detektor-pompa, jesteśmy w stanie wygenerować w czasie rzeczywistym, ciągły AIF podczas dynamicznych skanów [¹⁸F]fluorodeoksyglukozy ([¹⁸F]FDG)-PET/CT u szczurów i porównać go z alternatywnymi podejściami. Obrazowanie PET/CT przeprowadzono u samców szczurów rasy sprague w wieku 4 miesięcy o średniej masie ciała 462 g ± 33 g (średnia ± odchylenie standardowe) przy użyciu multimodalnego skanera PET/CT.

Ponieważ podczas serii pomiarów używana jest szeroka gama urządzeń (kalibrator dawki, próbnik krwi online, PET/CT i licznik studni), potrzebna jest procedura kontroli jakości zwana kalibracją krzyżową, aby sprawdzić ilościową dokładność wszystkich systemów i skompensować różnice. Kalibracja krzyżowa w kontekście pobierania próbek krwi online oznacza, że szybkość zliczania dla danego stężenia aktywności mierzonego na skorygowanych obrazach PET może zostać przeliczona na stężenie zmierzone za pomocą systemu twilite dla tego samego stężenia. W związku z tym ustanowiono procedurę kalibracji krzyżowej między PET/CT, systemem pobierania próbek krwi i licznikiem studzienek.

Ta wysoce ustandaryzowana metodologia zapewnia potężne podejście do ilościowego określania procesów metabolicznych i komórkowych w przedklinicznych badaniach na małych zwierzętach i jest eleganckim sposobem na poprawę wiarygodności i odtwarzalności AIF. AIF można następnie wykorzystać do ilościowego określenia specyficznie związanego znacznika w tkance w przedklinicznych danych PET/CT przy użyciu modelowania biokinetycznego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i obchodzenie się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Państwową Komisję Badań nad Zwierzętami Meklemburgii-Pomorza Przedniego (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, zatwierdzenie: 03.04.2018). Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

UWAGA: Zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach (22 ± 2 °C, 12 godzin cyklu dnia i nocy) z wodą i jedzeniem ad libitum. Wszystkie niezbędne urządzenia do przygotowania systemu bocznikowego, procedura obsługi i rzeczywiste pomiary są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie i zabieg chirurgiczny do cewnikowania zwierzęcia

1. Pościć zwierzę przez co najmniej 12 godzin ze swobodnym dostępem do wody. W celu znieczulenia umieść szczura w komorze indukcyjnej i napełniaj ją w sposób ciągły mieszaniną tlenu i izofluranu. Do rozpoczęcia stosowania 2,5-3,5% izofluranu, a do leczenia podtrzymującego 1,5-3,0% (natężenie przepływu 1,2-1,5 l/min).
   UWAGA: Post jest konieczny w badaniach z użyciem znacznika [¹⁸F]FDG, ale nie w przypadku innych znaczników. Pomiar stężenia glukozy we krwi za pomocą ręcznego pobierania krwi opisanego w punkcie 4 jest zalecany w celu zapewnienia stabilnych wartości lub skorygowania w modelowaniu kinetycznym.
2. Umieść znieczulonego szczura w pozycji grzbietowej na macie grzewczej, pod mikroskopem chirurgicznym i dodaj maść weterynaryjną na jego oczy. Monitorować i utrzymywać temperaturę ciała szczura w sposób ciągły podczas eksperymentu (37 ± 0,5 °C) za pomocą sondy doodbytniczej.
3. Przyklej nogi szczura do powierzchni roboczej, aby utrzymać nogi na miejscu. Zdezynfekuj miejsce operacji środkiem do dezynfekcji błony śluzowej i ogol nogę i krocze (strona operacyjna) szczura. Zakończ końcowym oczyszczeniem za pomocą środka dezynfekującego.
4. Wykonaj nacięcie o długości około 20 mm za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek w pachwinie szczura. Wypreparuj cienkie warstwy skóry i odsłoń żyłę udową, tętnicę i nerw za pomocą mikrokleszczy. Umieść dwa cienkie włókna pod każdą żyłą udową i tętnicą.
5. Uszczelnij żyłę i tętnicę każdym dystalnym włóknem i utrzymuj napięcie za pomocą zacisku Bulldog.
   Użyj bliższych włókien szwu, aby napiąć naczynie za pomocą zacisków bulldog (bez węzła).
6. Zablokuj żyłę za pomocą zacisku tętniaka proksymalnego, ale 2-3 mm dystalnie od szwu za pomocą zacisku buldoga. Za pomocą nożyczek rogówkowych wykonaj małe nacięcie w żyle (1/3 średnicy) i usuń wyciekającą krew za pomocą sterylnej bawełnianej zamiany. Rozszerz żyłę kleszczami i trzymaj ją otwartą. Wprowadzić zaostrzony cewnik (średnica wewnętrzna [ID]: 0,58 mm, średnica zewnętrzna [OD]: 0,96 mm) do żyły i wepchnąć go w kierunku proksymalnym, aż do zacisku tętniaka.
7. Otwórz zacisk tętniaka i wepchnij cewnik dalej w kierunku proksymalnym (około 2-3 cm), jeśli cewnik zostanie umieszczony prawidłowo, krew wpłynie do cewnika. Zabezpiecz cewnik szwem proksymalnym, wykonując dwa węzły; W razie potrzeby umieść dodatkowy szew wokół żyły i cewnika. Sprawdź działanie cewnika, przepłukując go i odsysając strzykawką insulinową (igła 30 G) wypełnioną 100 μl heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej (50 jednostek/ml).
8. Umieść cewnik w tętnicy, powtarzając kroki 1.6 i 1.7.
9. Gdy oba cewniki zostaną prawidłowo umieszczone, zamknij nogę szwami i przenieś zwierzę do PET/CT.
   UWAGA: Należy zachować jak największą ostrożność z cewnikami podczas transportu zwierzęcia, w przeciwnym razie może dojść do przesunięcia cewnika.

2. Konfiguracja systemu bocznikowego

Rysunek 2: Schemat ustawień pomiaru. (A) Schematyczny rysunek konfiguracji pomiaru. (B) Zdjęcie podłączonego systemu bocznikowego z detektorem twilitu, pompą perystaltyczną i różnymi typami złączy. Przebieg radioaktywności we krwi szczura jest wykrywany podczas skanowania zwierzęcia (1) w PET/CT (2). Dlatego cewnik tętniczy (a) i żylny (b) jest podłączony do systemu pompy detektora za pomocą adapterów (złącze pomarańczowe, złącze niebieskie i złącze zielone). Krew tętnicza jest następnie pompowana z cewnika tętniczego przez detektor (3) do pompy perystaltycznej (4) i z powrotem do organizmu przez cewnik żylny. Zawór 3-drogowy (7) jest zintegrowany z systemem probówek do wykonywania iniekcji znacznika, ręcznego pobierania krwi i płukania. Trójnik (8) jest montowany do wstrzykiwania aktywności. Detektor jest połączony z komputerem w celu przeglądania, kalibracji i korygowania ciągłych danych krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Odciąć 6 części rurki polietylenowej o drobnym otworze (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) o długości c = 735 mm; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm i i = 75 mm (Rysunek 2). Odetnij 8 części silikonowych rurek pompy (//, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) o długości około 20 mm.
2. Umieść złącza redukcyjne (od ID 2.5 mm do ID 1.5 mm) na obu końcach silikonowej rurki pompy d (żółty/niebieski/żółty, ID: 1.52 mm, OD: 3.20 mm). Umieść przygotowaną 20 mm część silikonowych rurek (//) na drugim końcu używanych łączników redukcyjnych (patrz złącze niebieskie w Rysunek 2).
3. Umieść przygotowaną część c FBPT w zmontowanym złączu niebieskim na jednym końcu rurki pompy silikonowej d (żółta/niebieska/żółta), a przygotowaną część e FBPT w zmontowanym złączu niebieskim na drugim końcu. Umieść przygotowaną 20 mm część silikonowych rurek (//) na końcach dwóch trójników 5 i 6 (ID trójnika rurki: 1,5 mm; patrz złącze zielone w Rysunek 2).
4. Podłącz wolny koniec części e FBPT do lewej strony zmontowanego złącza zielonego (5) i umieść przygotowaną część f FBPT po przeciwnej stronie złącza zielonego (5). Umieść wolny koniec części f FBPT po lewej stronie zmontowanego złącza zielonego (6) i umieść przygotowaną część g FBPT po przeciwnej stronie złącza zielonego (6). Dodaj przygotowaną część h FBPT do wolnego końca zmontowanego łącznika w kolorze zielonym (5), a przygotowaną część i FBPT do wolnego końca zmontowanego łącznika w kolorze zielonym (6).
5. Podłączyć zatyczkę typu combi-stop do igły podskórnej (G 23 x 1 1/4''/ø 0,60 mm x 30 mm) i dodać ją do zaworu trójdrogowego. Umieść przygotowany zawór trójdrogowy z igłą w wolnym końcu części h FBPT. Podłączyć zatyczkę kombi do igły podskórnej i umieścić igłę w wolnym końcu części i FBPT.
   UWAGA: Przed rozpoczęciem pobierania próbek krwi online, patrz punkt 5.
6. Umieść wolne końce części c i g FBPT w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej 20 ml roztworu soli fizjologicznej (50 jednostek/ml). Uruchom pompę perystaltyczną z natężeniem przepływu 1,52 ml/min, aby system bocznikowy był całkowicie wypełniony fizjologicznym roztworem soli fizjologicznej. Następnie ustaw trzy zaciski nożycowe na końcach części c i g oraz na środku części i FBPT.
7. Zwolnij nożyce clamps z części c i g FBPT. Podłącz cewnik tętniczy a do wolnego końca części c FBPT i podłącz cewnik żylny b do wolnego końca części g FBPT (patrz złącze pomarańczowe w Rysunek 2).

3. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu

1. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej do leżania na palecie z łożem wahadłowym (70 mm). Kontroluj oddychanie szczura i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą poduszki grzewczej i sondy doodbytniczej przez cały czas akwizycji obrazu. Przesunąć łoże wahadłowe do pozycji wysuniętego łóżka do wstrzykiwania (przed pobraniem) i podłączyć wprowadzone cewniki do systemu zastawkowego.
2. Zwierzę należy znieczulić izofluranem (2,5% izofluranu w tlenie, natężenie przepływu 1,2-1,5 l/min) przez stożek nosowy.
3. Uruchom pompę perystaltyczną o natężeniu przepływu 1,52 ml/min, aby napełnić układ zastawkowy krwią zwierzęcia. Przesunąć łoże wahadłowe na środek pola view pierścienia detekcji PET i uruchomić system pobierania próbek krwi online (patrz rozdział 5).
4. Po 60 s należy rozpocząć przebieg badania PET/CT przy użyciu parametrów opisanych w punkcie 3.5, a następnie wstrzyknąć dożylnie dawkę około 22 MBq [¹⁸F]FDG w objętości około 0,5 ± 0,1 ml przez trójnik. Następnie przepłukać trójnik około 150 μl heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej.
5. Uzyskaj dynamiczny PET w ciągu 60 minut i tomografię komputerową na końcu obrazowania PET.
   1. W przypadku akwizycji emisji PET ustaw 3600 s (60 min) w opcji akwizycji według czasu. Wybierz F-18 jako izotop badany i użyj 350–650 keV jako poziomu energii i 3438 ns jako okna czasowego.
   2. W przypadku akwizycji CT wybierz skanowanie tłumienia w opcji akwizycji. W polu Ustawienia projekcji wybierz opcję Rzutowanie 120 dla połowy całkowitego obrotu. Aby uzyskać ustawienia pola widzenia (FOV) i rozdzielczości, wybierz niska jako powiększenie i 4 x 4 jako wiązanie z osiową długością skanowania 275 mm i 3328 px jako transosiowy rozmiar CCD. W polu ustawień ekspozycji ustaw 500 μA dla prądu, 80 kV dla napięcia i 180 ms dla czasu ekspozycji.
   3. W przypadku histogramu emisji PET ustaw serię 20 klatek (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s i 1 x 1800 s) jako dynamiczne kadrowanie. Wybierz opcję Odejmij jako opóźnienia. Wybierz w polu ustawień zaawansowanych 128 jako szerokość sinogramu, 3 jako zakres, 79 jako różnicę pierścienia i korekcję czasu martwego.
   4. Do rekonstrukcji PET należy użyć dwuwymiarowej maksymalizacji oczekiwań podzbioru uporządkowanego (2D-OSEM) z generowaniem, stosowaniem i zapisywaniem sinogramu rozproszenia, 4 iteracjami i algorytmem Fouriera do rekonstrukcji. Wybierz 128 x 128 jako rozmiar matrycy i użyj 1 jako powiększenia obrazu, wszystkie jako klatki i wszystkie jako segmenty.

4. Procedura ręcznego pobierania próbek krwi

1. Ręczne pobieranie próbek krwi należy wykonać 30 s, 60 s, 90 s, 600 s i 1800 s po rozpoczęciu akwizycji obrazowej.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, zdecydowanie zaleca się zwiększenie liczby ręcznych pobrań krwi, zwłaszcza w ciągu pierwszej minuty po wstrzyknięciu znacznika. W związku z tym objętość próbki krwi musi zostać zmniejszona do 20-30 μl na próbkę⁶.
   1. Otwórz pierwszą zastawkę trójdrogową i zbierz 100 μl krwi tętniczej do probówki EDTA do pobierania krwi włośniczkowej 30 s po wstrzyknięciu znacznika. Powtórz te czynności dla pozostałych punktów czasowych. Określ wagę pustej probówki i probówki wypełnionej krwią.
   2. Zmierz aktywność (liczby/jednostkę czasu) krwi pełnej przez 180 s w liczniku studzienek, który jest następnie kalibrowany krzyżowo w celu uzyskania danych w kBq / ml. Zapisz czas rozpoczęcia pomiaru licznika studni. Obliczyć aktywność krwi pełnej dla każdego punktu czasowego ręcznego pobierania próbek krwi w kBq/ml, zastosować korekcję zaniku i przenieść dane w postaci krzywej aktywności w czasie.

5. Procedura pobierania krwi online

1. Umieść rurkę w detektorze za pomocą prowadnicy rurki. Uruchom oprogramowanie do pobierania próbek krwi (np. PSAMPLE) i otwórz interfejs akwizycji. Upewnij się, że komputer zestawu do pobierania próbek krwi online i PET/CT jest zsynchronizowany czasowo.
2. Naciśnij przycisk start dokładnie 60 s przed wstrzyknięciem znacznika, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do korekcji tła. Po pomiarze zapisz surowe dane za pomocą przycisku zapisz w bazie danych PMOD.
3. Aby skorygować i skalibrować dane krwi online, przełącz się na interfejs korekcji. Włącz korekcję zaniku i wybierz 18 F. Zdefiniuj czas rozpoczęcia akwizycji obrazu i włącz przycisk uśredniania, aby wykonać korekcję tła. Aktywować kalibrację i wpisać poprzednio wyznaczony współczynnik kalibracji (patrz rozdział 7.1).
4. Zapisz poprawione i skalibrowane dane krwi za pomocą przycisku Zapisz TAC i wybierz plik blood.crv. Plik ten można następnie załadować jako krzywą wejściową krwi pełnej do narzędzia do modelowania kinetycznego i można przeprowadzić modelowanie kinetyczne. Odłączyć cewniki od pozacielesnego systemu zastawkowego.
5. Odłącz zwierzę od skanera PET/CT i poddaj eutanazji pentobarbitalem.
   UWAGA: W tym eksperymencie zwierzęta zostały poddane eutanazji po pomiarach, ponieważ mózgi zostały użyte do analiz in vitro w projekcie eksperymentalnym. Dzięki tej konfiguracji można również zaimplementować powtarzające się pomiary w badaniach podłużnych⁷. Użyj zupełnie nowego systemu rurek dla następnego zwierzęcia.

6. Funkcja wejściowa pochodząca z obrazu

1. Otwórz narzędzie Fuse it na PMOD. Załaduj obraz PET jako dane wejściowe, a przekładnik prądowy jako odniesienie. Kliknij opcję Już dopasowane.
2. Otwórz narzędzie do generowania interesującego ruchu (woksel zainteresowania). Umieść kursor w aorcie wstępującej w CT. Kliknij predefiniowane sferyczne VOI. Określ promień o długości dokładnie 0,7 mm. Wyodrębnij informacje o aktywności czasowej za pomocą przycisku statystyki VOI i skopiuj uśrednione wartości do schowka.

7. Procedura kalibracji krzyżowej systemu twilite, PET/CT i licznika studni

1. Twilite-PET/CT-kalibracja
   UWAGA: Przedstawiony przepływ pracy dla kalibracji twilitu jest częściowo oparty na procedurach opisanych w podręczniku referencyjnym modułu PSAMPLE PMOD.
   1. Napełnić strzykawkę około 100 MBq [¹⁸F]FDG. Zmierzyć dokładną aktywność A_F za pomocą skalibrowanego kalibratora dawki i udokumentować ją wraz z datą i godziną pomiaru oraz objętością pełnej strzykawki. Zarejestrowany czas jest punktem odniesienia dla wszystkich poprawek zaniku, które mają być wykonane.
   2. Napełnij zlewkę 500 ml wody z kranu. Dokładna objętość jest określana metodą ważenia. Zmierzyć masę mojej pustej zlewki za pomocą odpowiedniej i skalibrowanej wagi precyzyjnej (co najmniej klasa dokładności II). Napełnij zlewkę wodą z kranu i zmierz masę _mf pełnej zlewki.
   3. Obliczyć objętość V_b zlewki, wykorzystując różnicę masy i gęstości wody z kranu (r = 0,998 g/ml w temperaturze 20 °C):
      
   4. Wstrzyknąć [¹⁸F]FDG do napełnionej zlewki i ponownie napełnić pustą strzykawkę do jej pierwotnej objętości nieaktywną wodą z kranu i zmierzyć aktywność _{A E} ponownie napełnionej strzykawki w kalibratorze dawki. Stężenie aktywności c_b roztworu w zlewce jest określone wzorem , które powinno wynosić około 200 kBq/ml.
   5. Napełnij stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml roztworem ze zlewki (unikaj dużych pęcherzyków powietrza) i umieść ją centralnie w polu view skanera PET/CT. Napełnij cewnik identyczny z typem użytym w eksperymencie obrazowania PET/CT i umieść go w prowadnicy rurki systemu twilite. Napełnij cewnik roztworem znacznikowym ze zlewki za pomocą pompy perystaltycznej.
   6. Rozpocznij pomiar krzywej aktywności w czasie zgodnie z opisem w sekcji 5, używając tego samego parametru dla czasu całkowania i rebinacji, jak w eksperymencie, bez prowadnicy cewnika wewnątrz głowicy pomiarowej. Ten krok zapewnia pozyskanie wystarczającej ilości danych do odpowiedniej korekcji tła. Po 2 minutach, nie przerywając akwizycji danych przez system twilite, należy umieścić prowadnicę cewnika z napełnioną rurką w głowicy pomiarowej i kontynuować akwizycję danych przez około 5 minut.
   7. Rozpocznij równolegle 10-minutową akwizycję PET stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie standardową akwizycję CT w celu korekcji tłumienia. Należy zrekonstruować statyczny obraz PET stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml przy użyciu tego samego algorytmu rekonstrukcji PET i parametrów opisanych w sekcji 3. Użyj narzędzia do obrazowania po przetworzeniu (np. PVIEW) i umieść cylindryczny VOI pokrywający około 70% objętości wewnątrz zrekonstruowanych obrazów PET stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Ekstrahować średnie stężenie aktywności c_PET w kBq/ml w VOI.
   8. Wróć do oprogramowania próbnika krwi i użyj trybu kalibracji, aby skorygować uzyskany TAC pod kątem rozpadu, frakcji rozgałęzionej i tła. Dodaj wszystkie niezbędne informacje dotyczące nuklidu, stężenia aktywności i czasu rozpoczęcia akwizycji PET. Wewnętrznie oprogramowanie wyodrębnia szybkość zliczania zmierzoną za pomocą systemu twilite (_{CR twilite}) i oblicza współczynnik kalibracji krzyżowej dla systemu PET i _{twilite (CF PET/twilite}):
      
      UWAGA: Ważne jest, aby ten sam izotop był używany zarówno do kalibracji, jak i eksperymentów PET/CT, ponieważ frakcja rozgałęziająca się różni się między różnymi izotopami, co jest korygowane w procesie rekonstrukcji PET. Procedura ta musi być regularnie powtarzana pod kątem kontroli jakości, w przypadku wymiany istotnych elementów systemu (np. rur, parametrów zakupu i rekonstrukcji) oraz po pracach naprawczych.
2. Kalibracja licznika studzienek PET/CT
   1. Aby obliczyć współczynnik kalibracji CF_{licznika studni}, należy użyć tego samego roztworu aktywności, który został wyprodukowany w zlewce do kalibracji systemu twilite. Odczekać około 6 godzin, aby umożliwić zmniejszenie aktywności właściwej przez rozpad w celu zminimalizowania wpływu detektora scyntylacyjnego licznika odwiertu na czas martwy. Przykryj zlewkę, aby uniknąć parowania.
   2. Obliczyć dokładną różnicę czasu w stosunku do punktu odniesienia w czasie i określić rzeczywiste stężenie aktywności c_b(t₊) roztworu zlewki przez rozpad, korygując pierwotne stężenie aktywności. Pipetować wstępnie określone objętości (_próbka V), które są identyczne z objętością próbek krwi zmierzonych w ramach doświadczeń (np. 200 μl), ze zlewki do pięciu probówek z bezpiecznym zamknięciem. Zmierz aktywność każdej z pięciu probówek za pomocą licznika studzienek dla 180 s.
      UWAGA: Jeśli współczynnik zmienności dla pojedynczego pomiaru jest większy niż 1%, czas pomiaru należy wydłużyć. Zapisz zmierzoną szybkość zliczania w liczbach na minutę [cpm] dla każdej probówki i czas rozpoczęcia pomiaru. Wykonaj korekcję zaniku.
   3. Obliczyć współczynnik kalibracji _{CF-well-counter} dla każdego pomiaru, dzieląc współczynnik zliczania CR _licznika studzienki skorygowany o zanik przez skorygowane stężenie aktywności zlewki c_{zlewki (t+)}:
      
   4. Uśrednić pięć współczynników kalibracji, aby uzyskać średni współczynnik kalibracji.

Wyniki

Konfiguracja systemu bocznikowego jest wyświetlana w Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki danych z ciągłego pobierania próbek krwi w porównaniu z danymi z ręcznego pobierania próbek krwi u trzech szczurów typu dzikiego w okresie 30 minut przedstawiono w Rysunek 3A,C. Na początku ciągłego pobierania próbek krwi początkowy szczyt (maksymalne stężenie radioaktywności) można zaobserwować po 5 sekundach od wstrzyknięcia znacznika. Następnie aktywność krwi gwałtownie spada i osiąga plateau po około 15 minutach. W danych z ręcznego pobierania krwi wykryty pik jest mniejszy, a plateau nie jest łatwe do zdefiniowania (Rysunek 3A,C). Porównanie ciągłego pobierania próbek krwi z danymi pochodzącymi z obrazu jest wyświetlane w Rysunek 3B,D. W danych obrazowych szczyt i punkt początkowy plateau są wyraźnie widoczne, niemniej jednak maksimum piku jest mniejsze w porównaniu z danymi dotyczącymi ciągłego pobierania próbek krwi dla wszystkich zwierząt (Rysunek 3B, D).

Nieoptymalny wynik ciągłego pobierania próbek krwi za pomocą naszego zestawu jest pokazany w Rysunek 3E,F. Na początku ciągłego pobierania próbek krwi nie było możliwe zebranie danych w ciągu pierwszych 3,5 minuty z powodu krzepnięcia krwi. Odłączenie systemu rurowego na złączu pomarańczowym i unoszenie się na wodzie z heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej, przepływ w systemie rurowym został wznowiony, a pomiar kontynuowany. Szczyt można zaobserwować po około 4 minutach, co nie rejestruje maksymalnej radioaktywności we krwi (Rysunek 3E,F). Ręczne pobieranie próbek krwi (Rysunek 3E) i analizy obrazowe (Ryc. 3F) były nadal możliwe i porównywalne z prawidłowymi wynikami.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki ciągłego pobierania próbek krwi w porównaniu do ręcznego pobierania krwi. Przedstawiono typowe funkcje wejściowe tętnic uzyskane z ciągłego pobierania krwi w porównaniu z ręcznym pobieraniem próbek krwi (lewa kolumna) i ciągłym pobieraniem krwi w porównaniu z podejściem obrazowym (prawa kolumna). Panele A-D pokazują wyniki poprawnego wdrożenia protokołu u dwóch różnych zwierząt. Panele E i F ilustrują nieoptymalny wynik pomiaru. Wszystkie pokazane dane zostały skorygowane o współczynnik kalibracji krzyżowej i tło. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawione wyniki pochodzą z zakrojonego na szeroką skalę projektu dotyczącego aktywności neuronalnej w transgenicznym zwierzęcym modelu choroby Huntingtona w porównaniu ze szczurami typu dzikiego. W sumie 30 szczurów transgenicznych i dzikich zostało cewnikowanych i wykonano ręczne i internetowe pobieranie krwi równolegle z [¹⁸F]FDG-PET/CT. Pokazano tutaj trzy AFI szczurów typu dzikiego, aby zademonstrować zakres możliwych wyników protokołu. Wyniki całego projektu dotyczącego zmian aktywności neuronalnej w zwierzęcym modelu choroby Huntingtona zostaną opublikowane w innym miejscu.

Opisana tutaj metoda umożliwia szybkie i dokładne ciągłe pobieranie próbek krwi w dużej kohorcie i zapewnia pozbawiony przerw AIF do kinetycznego modelowania dynamicznych danych PET/CT u małych zwierząt. Zewnętrzne krążenie krwi jest generowane w celu wykrycia rzeczywistej aktywności czasowej we krwi zwierząt; W ten sposób unika się utraty krwi. Procedura chirurgiczna opiera się na Jespersen i ^wsp.8 i została zmodyfikowana w celu zaspokojenia potrzeb w zakresie pobierania próbek krwi tętniczej podczas pomiarów PET/CT. System bocznikowy został zweryfikowany przez Webera i ^wsp.9. W przypadku zastosowanej tutaj konfiguracji, zewnętrzna objętość krwi wynosząca około 1,1 ml przepływa przez system detektor-pompa. Szczur w wieku 4 miesięcy ma całkowitą objętość krwi około 30 ml. Średnica żyły udowej i tętnicy wynosi około 0,45-0,6 mm¹⁰ i musi być trochę wykrochmalona, aby wprowadzić używany cewnik.

AIF może być również mierzony poprzez sporadyczne ręczne pobieranie krwi lub może być zrekonstruowany na podstawie wczesnych punktów czasowych samych obrazów PET (pochodzących z obrazu). Oba podejścia przeprowadzono na podstawie przedstawionych tutaj danych i porównano z ciągłym pobieraniem prób krwi.

W porównaniu z ręcznym pobieraniem krwi, przy pobieraniu próbek krwi online możliwa staje się zauważalnie wyższa rozdzielczość czasowa (tutaj: 1800 punktów danych na 30 minut). Ręczne pobieranie krwi (tutaj: 5 punktów danych na 30 minut) jest ograniczone do objętości krwi obecnej u małego zwierzęcia, ponieważ próbki te nie są pompowane z powrotem do krążenia zwierzęcia. Co więcej, maksymalny interwał wynoszący 10-15 s jest technicznie możliwy do wdrożenia i brakuje ważnych informacji dla modelowania kinetycznego. Widać to również w przedstawionych danych, ponieważ różnica w wykrywanym maksimum ciągłego i ręcznego pobierania krwi jest oczywista (ryc. 3A,C,E). W przypadku pobierania próbek krwi online wykryty szczyt był wyższy niż w przypadku funkcji wejściowej pochodzącej z obrazu aorty^{wstępującej 11} (ryc. 3B, D, F). Funkcja wejściowa pochodząca z obrazu jest ograniczona do rozdzielczości przestrzennej skanerów PET, co skutkuje częściowymi efektami głośności¹² i ma na nią wpływ zrekonstruowane ramy czasowe.

Ogólną zaletą tej procedury ciągłego pobierania krwi jest to, że znacznik może być podawany przez cewnik, który jest mniej podatny na zakłócenia niż wstrzyknięcie przez boczną żyłę ogonową. Należy pamiętać, że znacznik powinien być nakładany w umiarkowanej objętości, aby zapobiec pozostaniu znacznika na początku systemu rurowego. Aby upewnić się, że w martwej objętości trójnika nie pozostała żadna aktywność, jest on następnie przepłukiwany heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej. Ponadto zaleca się stosowanie pompy infuzyjnej, ponieważ umożliwia ona regulację szybkości wstrzykiwania znacznika i może przyczynić się do bardziej skoordynowanego pomiaru maksymalnego piku radioaktywności przy ręcznym pobieraniu próbek krwi¹³.

Istnieje kilka możliwych problemów, które mogą wystąpić podczas przetwarzania protokołu i można je rozwiązać, wykonując następujące czynności związane z rozwiązywaniem problemów. Nieoptymalna pozycja cewników może prowadzić do niepełnego wykonania protokołu, dlatego należy upewnić się, że są one dokładnie zamocowane za pomocą szwu proksymalnego i że cewnik jest wepchnięty 2-3 cm proksymalnie do naczynia. Dodatkowo można zastosować klej fibrynowy. Również tworzenie się skrzeplin może zatkać cewniki. Można sobie z tym poradzić, zwiększając stężenie heparyny, a następnie przepłukując cewniki lub system rurek. Tak nieoptymalny wynik z powodu zatkania cewników jest pokazany w wynikach, maksymalny szczyt jest pomijany (ryc. 3E). Kolejnym krytycznym punktem dotyczącym ochrony i dobrostanu zwierząt jest długość pozaustrojowego przepływu krwi. Dlatego sugeruje się skrócenie długości systemu rur do minimum.

Przy pobieraniu próbek krwi należy wziąć pod uwagę trzy korekty otrzymanego AFI. Po pierwsze, korekcja plazmy. Znaczniki równoważą się między osoczem a komórkami krwi, głównie erytrocytami. W zależności od tego, jak szybkie są te procesy dyfuzji, dostępny znacznik jest obecny głównie w osoczu. W przypadku niektórych znaczników należy wziąć pod uwagę stosunek osocza do krwi pełnej, takich jak bardziej lipofilowe. W takich przypadkach należy określić aktywność osocza. Jeśli stosuje się [¹⁸F]FDG, nie ma potrzeby odwirowywania krwi w celu określenia aktywności osocza, ponieważ bardzo szybko równoważy się ona między osoczem a czerwonymi krwinkami, a dostępność [¹⁸F]FDG w osoczu jest podobna do tej we krwi pełnej. Po drugie, korekta metabolitów. Wiele znaczników jest metabolizowanych we krwi pełnej, a niektóre z tych metabolitów są nadal znakowane radioaktywnie¹⁴. Frakcja ta jest obecna w AIF, ale nie jest dostępna do wychwytu tkankowego. W przypadku niektórych substancji śladowych konieczne jest oznaczenie metabolitów we krwi pełnej lub osoczu oraz skorygowanie AIF. Po trzecie, korekta dyspersji. Dyspersja jest spowodowana kilkoma czynnikami, w tym (a) systematyczną różnicą czasu między czasami dotarcia znacznika do tkanki w stosunku do obwodowego miejsca pobierania próbek (korekcja opóźnienia) oraz (b) rozmazywaniem kształtu AFI, ponieważ na transport znacznika w systemie rurkowym wpływa kinetyka opóźnienia pierwszego rzędu (PT₁). Zaproponowano kilka poprawek opartych na dekonwolucji, głównie opartych na modelu Iida i ^wsp.15, ale większość z nich jest podatna na szumy. Metoda korekcji, która omija dekonwolucję, a zatem jest mniej podatna na szumy, została zaproponowana przez Munka i ^wsp.16. Niezbędne pomiary w celu oszacowania parametrów korekcyjnych muszą być wykonane dla każdej zastosowanej kombinacji przewodów i znaczników. Korekcję dyspersji należy wykonać przed korekcją opóźnienia czasowego¹⁷. Dyspersja ma jednak wpływ głównie na szybkie procesy perfuzji tkanek i wykazano również, że do modelowania badań [¹⁸F]FDG korekta dyspersji nie jest absolutnie^konieczna18. W związku z tym w przedstawionych przykładach nie zastosowano poprawki dyspersji ASI.

Właściwa kalibracja kalibratora dawki na miejscu i jego regularna kontrola jakości jest warunkiem wstępnym dla przedstawionego tutaj rodzaju procedur kalibracji krzyżowej. Jeżeli jednak aktywność podawana zwierzęciu jest mierzona za pomocą tego samego kalibratora dawki, wszelkie odchylenia w dokładności zostaną zniwelowane, pod warunkiem że odchylenie jest stałe i przestrzegana jest pełna procedura kalibracji krzyżowej, w tym poprawki specyficzne dla nuklidów (np. dla różnych okresów półtrwania lub różnych współczynników rozgałęzień). Stosując taką procedurę kalibracji do harmonizacji systemów PET/CT stosowanych w opiece zdrowotnej i badaniach naukowych, można osiągnąć dokładność co najmniej 5-10%^19,20.

Skalibrowane i skorygowane AFI wygenerowane w wyniku pomyślnego wdrożenia tego protokołu umożliwiają kwantyfikację danych PET/CT w celu scharakteryzowania modeli chorób zwierzęcych, testowania nowych opcji terapeutycznych, ustanowienia nowych znaczników i przeniesienia istniejących znaczników do innego gatunku. Wydaje się, że ciągłe pobieranie próbek krwi w [¹⁸]FDG-PET/CT u szczurów dostarcza najbardziej wiarygodnych informacji do obliczenia danych wejściowych w modelowaniu biokinetycznym. Biorąc pod uwagę indywidualny metabolizm, zwłaszcza klirens wątrobowy, możliwa jest bardziej precyzyjna ocena istotnych skutków patologicznych lub terapeutycznych. Dzięki temu praktycznemu protokołowi można łatwo wdrożyć wyższą wydajność przedklinicznej analizy danych PET/CT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sugery do zastawki tętniczo-żylnej
anestezjologicznej Klipsy	Groppler
	Aesculap	FT190T	5 mm, siła zamykania 70 g
Zacisk buldoga	Aesculap		35 mm
BC165	Aesculap	490-866	, do przygotowanie skóry
mata
strzykawka insulinowa	uchwyt		30G
	medicon	11.62.18	mikroszczypce chirurgiczne
do klipsów do tętniaków	Aesculap	FT 470T	Yasargil
portex rurka polietylenowa drobnootworowa	Smith Medical	800/100/200	ID 0,58 mm, OD 0,96 mm; Mikroskop chirurgiczny z rurką o ekwiwalencie PE50
z kamerą	Leica		M50 + MC120 HD
6.0			6.0, włókna do szwów polipropylenowych
3.0			3.0, wchłanialne, plecione
dwa kleszcze anatomiczne	Hammacher Soling	HSC601-11	mikrochirurgia, 45°
nożyczki naczyniowe lub rogówkowe	Geuder	G19605	nożyczki do mikrochirurgii
PET/CT obrazowanie
kalibrator dawki ISOMED 2010	nivia instruments GmbH		do porcjowania znaczników
Inveon PET/CT	Siemens
tracer (np. 18F-FDG)
manuel pobieranie krwi
probówka do pobierania krwi włośniczkowej KABE	Labortechnik GmbH		GK 150 EDTA 200 µ l
probówki	SARSTEDT		5 ml, 75 x 12 mm,
licznik studzienek PS CAPTUS 700t	Ręczny pomiar aktywności krwi	firmy Capintec
automatyczne pobieranie krwi
BD Bezpieczny osłonięty cewnik dożylny Venflon TM pro; 18 G (1,3 mm x 32 mm)	BD	3932269	złącza luer (pasujące do trójników)
bloodsampler twilite two	swisstrace GmbH
korek combi	Braun	4495101
heparyna			50U/ml do płukania rurki przed eksperymentem i aspiracji podczas operacji cewnika
igła			G23 x 1 1/4" / 0,6 x 30 mm
mikroprocesorem pompa rurkowa	Ismatec/Cole-Parmer	ISM596	12 rolek, 2 kanały
PSAMPLE moduł PMOD	PMOD
	Ismatec/Cole-Parmer	ISM569A	od ID 2,5 mm do ID 1,5 mm
silikonowe rurki pompy	Ismatec/Cole-Parmer	070535-17-ND /SC0065N	do pompy rolkowej (żółta/niebieska/żółta ID 1,52 mm, WT 0,84 mm, średnica zewnętrzna 3,2 mm)
silikonowe rurki do pomp - rurki adaptera	Ismatec/Cole-Parmer	SC 0107	//ID 0,76 mm, WT 0,86 mm, średnica zewnętrzna: 2,48 mm
trójnik lub trójnik	Ismatec/Cole-Parmer	ISM 693A	ID 2,5 mm