Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Podsumowanie

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Streszczenie

Metody oparte na rekombinacji homologicznej do modyfikacji genów znacznie przyczyniły się do rozwoju badań biologicznych. Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są rygorystyczną metodą badania rozwoju i chorób ssaków. Nasze laboratorium opracowało kilka GEMM raka prostaty (PCa), które nie wykazują ekspresji jednego lub wielu genów supresorowych przy użyciu specyficznego dla miejsca systemu rekombinazy Cre-loxP i promotora specyficznego dla prostaty. W tym artykule opisujemy naszą metodę sekcji zwłok tych GEMM PCa, koncentrując się przede wszystkim na rozwarstwieniu guzów prostaty myszy. Nowe metody opracowane w ciągu ostatniej dekady ułatwiły hodowlę komórek pochodzących z nabłonka w celu modelowania układów narządów in vitro w trzech wymiarach. Szczegółowo opisujemy również metodę hodowli komórek 3D w celu generowania organoidów nowotworowych z mysich PCa GEMM. Przedkliniczne badania nad rakiem zostały zdominowane przez hodowle komórkowe 2D i modele ksenoprzeszczepów pochodzące od linii komórkowych lub od pacjentów. Metody te nie obejmują mikrośrodowiska guza, co jest ograniczeniem w stosowaniu tych technik w badaniach przedklinicznych. GEMM są bardziej fizjologicznie istotne dla zrozumienia nowotworzenia i progresji raka. Hodowla organoidów nowotworowych to system modelowy in vitro, który podsumowuje architekturę guza i charakterystykę linii komórkowej. Ponadto metody hodowli komórkowych 3D pozwalają na wzrost normalnych komórek w celu porównania z kulturami komórek nowotworowych, co jest rzadko możliwe przy użyciu technik hodowli komórkowych 2D. W połączeniu, zastosowanie GEMM i hodowli komórek 3D w badaniach przedklinicznych może potencjalnie poprawić naszą wiedzę na temat biologii nowotworów.

Wprowadzenie

Od końca lat 80. możliwość zmiany genów poprzez rekombinację homologiczną znacznie posunęła naprzód badania nad systemami biologicznymi¹. Indukowalne, tkankowo lub komórkowo specyficzne systemy promotoryczne i rekombinazy specyficzne dla miejsca, takie jak Cre-loxP, przyczyniły się do zaawansowanych badań genetycznych, ułatwiając kontrolę nad modyfikacjami genetycznymi zarówno czasowo, jak i przestrzennie^2,3,4. Połączenie tych strategii genetycznych stworzyło szeroki wachlarz eksperymentalnych systemów modelowych^5,6,7.

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są integralnym narzędziem do oceny, jak poszczególne geny lub grupy genów wpływają na rozwój i choroby ssaków. W przedklinicznych badaniach nad rakiem GEMM są najbardziej fizjologicznie istotną i rygorystyczną metodą badania rozwoju, progresji i leczenia raka⁸. Nasze laboratorium specjalizuje się w generowaniu i charakteryzowaniu nowotworowych GEMM.

Najbardziej najczęściej diagnozowanym nowotworem nieskórnym wśród mężczyzn w Stanach Zjednoczonych jest rak prostaty (PCa). Większość pacjentów z PCa ma chorobę niskiego ryzyka i wysokie prawdopodobieństwo przeżycia, ale wskaźniki przeżycia drastycznie spadają, gdy choroba jest diagnozowana w zaawansowanym stadium lub jeśli celowana terapia hormonalna indukuje progresję do agresywnych, nieuleczalnych podtypów PCa9^,10. Nasze laboratorium opracowało GEMM, które wykorzystują floksowane allele jednego lub więcej genów supresorowych nowotworu. Rekombinacja i utrata ekspresji genu supresorowego nowotworu zachodzi specyficznie w prostacie, ponieważ wprowadziliśmy transgen z rekombinazą Cre za promotorem probasinu, aktywowany tylko w komórkach nabłonka prostaty^11,12. Wyhodowaliśmy również nasze GEMM tak, aby zawierały transgen reporterowy Cre o nazwie mT/mG, który indukuje ekspresję białka fluorescencyjnego pomidora w komórkach pozbawionych ekspresji Cre i białka zielonej fluorescencji (GFP) w komórkach z klasą Cre¹³. Chociaż prezentacja tej metody i nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że GEMM badamy w naszym laboratorium, protokół ten może być wykorzystany do generowania organoidów raka prostaty z dowolnego modelu mysiego. Jednak, jak omówiono szczegółowo w naszej sekcji wyników reprezentatywnych, zaobserwowaliśmy, że niektóre cechy guza są optymalne do generowania organoidów raka prostaty.

W ostatnim dziesięcioleciu nowe metody hodowli komórek z tkanek pochodzenia nabłonkowego doprowadziły do znacznego postępu w naszej zdolności do modelowania układów narządów in vitro^14,15. Termin "hodowla komórkowa 3D" został przypisany technikom związanym z tworzeniem i utrzymywaniem organoidów, które można ogólnie zdefiniować jako struktury składające się z komórek, które składają się z wtórnej architektury napędzanej przez cechy linii komórkowej specyficznej dla narządu¹⁶. Te nowe metody różnią się od klasycznej hodowli komórkowej 2D tym, że komórki nie wymagają transformacji ani unieśmiertelnienia w celu długotrwałego wzrostu; w ten sposób hodowle 3D normalnych komórek można porównać z komórkami chorymi. Jest to szczególnie cenne w badaniach nad rakiem, w których normalne hodowle komórkowe zazwyczaj nie były dostępne. Ponadto organoidy spontanicznie tworzą wtórne architektury tkanek z odpowiednio zróżnicowanymi typami komórek, co czyni je lepszym systemem modelowym do zrozumienia raka in vitro niż linie komórkowe 2D¹⁷. Nasze laboratorium stworzyło linie organoidów 3D z guza wyizolowane z naszych GEMM PCa, aby uzupełnić nasze dane in vivo i przeprowadzić eksperymenty, które nie byłyby wykonalne w GEMM.

W tym artykule prezentujemy pisemne i wizualne protokoły pełnej sekcji zwłok PCa GEMMs, w tym preparację różnych mysich płatów prostaty i zmian przerzutowych. Opisujemy i pokazujemy krok po kroku metodę generowania organoidów z guzów prostaty myszy w oparciu o protokół wcześniej opublikowany przez Drosta i wsp. do wyprowadzania organoidów z normalnej tkanki nabłonka prostaty myszy¹⁸.

Protokół

Opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Departamencie Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nowy Jork.

UWAGA: Samce myszy, które mają być poddane sekcji w celu wyizolowania prostaty lub guzów prostaty w celu wytworzenia organoidów, powinny osiągnąć co najmniej wiek dojrzałości płciowej — około 8-10 tygodni życia. Konkretny wiek myszy może się różnić w zależności od badania. Niektóre czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze wieku, obejmują zależne od wieku zmiany w populacjach komórek prostaty, zależną od wieku ekspresję określonych transgenów Cre napędzanych przez promotor oraz szybkość progresji guza prostaty w określonym GEMM.

1. Sekcja i obrazowanie guza prostaty myszy i guzów przerzutowych

1. Preparaty
   1. Zaopatrz się w niezbędne sterylne narzędzia do preparowania. Etap rozwarstwienia obszaru na czystej, sterylnej powierzchni za pomocą linijki 15 cm, wagi precyzyjnej, wagi analitycznej, butelki z rozpylaczem z 70% etanolem, soli fizjologicznej buforowanej fosfo (PBS) i ręczników papierowych.
   2. Przygotowanie roztworów utrwalających narządy trzewne i kości, które nie mają być stosowane do wytwarzania organoidów
      1. W przypadku narządów trzewnych: Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Na jedną mysz przygotuj 20 ml 4% PFA, podwielokrotność do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml i trzymaj w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
      2. W przypadku kości długich: Podamy 10 ml wstępnie przygotowanej 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i przechowujemy w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
   3. Zaopatrz się w nieprzetworzone szalki o średnicy 10 cm i napełnij je niesterylnym PBS — będą one służyć jako tymczasowe pojemniki na narządy podczas dokładnej sekcji przy użyciu mikroskopu preparacyjnego.
      nuta: Sterylne narzędzia służą do preparowania tkanek w celu wytworzenia organoidów. Do wstępnego nacięcia i rozwarstwienia kończyn tylnych używa się narzędzi niesterylnych.
2. Eutanazja i pierwsze nacięcie
   1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO₂ przy natężeniu przepływu 2,0 l/min przez 5 minut. Wyjmij mysz z klatki i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Użyj wagi precyzyjnej, aby zmierzyć masę ciała myszy i nagrywać.
   2. Umieść mysz na ręczniku papierowym i zorientuj się na powierzchni sekcji brzuszną stroną do góry, z głową myszy skierowaną w stronę przeciwną do badacza. Przymocuj mysz do planszy, rozciągając jej kończyny i przekłuwając każdą z przednich i tylnych łap jedną jednorazową igłą.
   3. Za pomocą butelki z rozpylaczem oblaj sierść myszy 70% etanolem. Używając niesterylnych nożyczek preparacyjnych i prostych kleszczy, uszczypnij tuż nad penisem myszy i wykonaj małe nacięcie tylko przez futro.
   4. Kontynuuj nacięcie linii środkowej aż do szyi myszy tylko przez futro. Wykonuj obustronne nacięcia od punktu początkowego nacięcia przez płaszczyznę brzuszną myszy tylko przez futro.
   5. Chwyć futro i ostrożnie odciągnij je od skóry myszy. Przypnij futro do deski, aby umożliwić dostęp zarówno do jamy brzusznej, jak i klatki piersiowej.
3. Ekstrakcja męskiego układu moczowo-płciowego en bloc
   1. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych i prostych kleszczy ostrożnie przeciąć skórę około 0,75 cm nad odbytnicą. Kontynuuj nacięcie w linii środkowej aż do klatki piersiowej, nie naruszając żadnych narządów w jamie brzusznej. Ostrożnie odciągnij skórę i przypnij do deski, aby odsłonić całą jamę brzuszną.
      nuta: Nie pozwól, aby te instrumenty dotykały zewnętrznej strony myszy lub jakiejkolwiek powierzchni w obszarze przejściowym, ponieważ tkanki te będą używane do generowania organoidów.
   2. Przeanalizuj układ moczowo-płciowy i inne narządy zgodnie ze schematem w Rysunek 1A, z liczbami wskazującymi kolejność, w jakiej narządy zostaną usunięte z myszy.
   3. Znajdź pęcherz, a następnie chwyć poduszkę tłuszczową w lewo lub w prawo i pociągnij w górę, aby odsłonić jądro. Ostrożnie odetnij jądro od reszty okolicy układu moczowo-płciowego i odłóż na bok. Wykonaj tę samą procedurę po drugiej stronie.
      nuta: Osiągnięcie optymalnej jakości tkanek i szczegółowej charakterystyki guzów prostaty wymaga usunięcia całego obszaru moczowo-płciowego myszy en bloc¹⁹. Zaleca się, aby najpierw usunąć okolicę moczowo-płciową (Rysunek 1A).
   4. Chwyć pęcherz i ostrożnie pociągnij do góry, aby okolica moczowo-płciowa uniosła się razem, odsłaniając cewkę moczową pod spodem. Trzymając pęcherz, ustaw nożyczki tak, aby przylegały do spodu grzbietowej prostaty i przetnij cewkę moczową. Cały obszar moczowo-płciowy zostanie wtedy uwolniony z jamy brzusznej.
   5. Umieść okolicę moczowo-płciową w 10-centymetrowym naczyniu wypełnionym PBS. Jeśli nadal jest wypełniony moczem, opróżnij pęcherz, wykonując małe nacięcie. Za pomocą wagi analitycznej zważ układ moczowo-płciowy i zapisz.
4. Ekstrakcja węzłów chłonnych miednicy, śledziony, wątroby, nerek, płuc, kości piszczelowej i kości udowej
   1. Usunięcie układu moczowo-płciowego odsłania węzły chłonne miednicy, znajdujące się tuż za układem moczowo-płciowym (Rysunek 1A) i po obu stronach kręgosłupa. Węzły chłonne będą widoczne tylko wtedy, gdy zawierają zmiany przerzutowe lub jeśli występuje miejscowy stan zapalny. Ustaw proste kleszcze pod węzłem chłonnym i pociągnij do góry, aby usunąć węzeł chłonny. Wykonaj tę samą procedurę po drugiej stronie.
   2. Chwyć odbytnicę prostymi kleszczami i przetnij. Pociągnij za odbytnicę, aby rozplątać całą okrężnicę i jelito cienkie, szukając przerzutów w węzłach chłonnych krezkowych. Po usunięciu całego jelita krętego kontynuuj ciągnięcie dwunastnicy, aby odsłonić żołądek. Przetnij przełyk, aby całkowicie usunąć żołądek i wyrzucić. W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek zmian przerzutowych w węzłach chłonnych, należy je ostrożnie wyciąć z jelita i przechowywać w 10-centymetrowym naczyniu PBS.
   3. Odsłonięcie i usunięcie żołądka spowoduje ściągnięcie śledziony z grzbietowej strony brzucha (Rysunek 1A). Usuń śledzionę i umieść w 4% PFA. Śledziona służy jako kontrola barwienia hemotoksyliny, ponieważ jest wysoce komórkowa.
      nuta: Tkanki trzewne, które nie mają być używane do wytwarzania organoidów, zostaną utrwalone przez noc w 4% PFA, przemyte PBS, a następnie umieszczone w 70% etanolu.
   4. Usuń wątrobę w górnej części brzucha (Rysunek 1A). W zależności od obciążenia przerzutami w wątrobie można wyciąć poszczególne płaty lub usunąć całą wątrobę, ostrożnie przecinając wzdłuż przepony. (Nie przecinaj w tym momencie membrany). Umieść wątrobę w 10 cm naczyniu PBS.
   5. Usunięcie wątroby całkowicie odsłoni nerki po obu stronach kręgosłupa (Rysunek 1A). Usuń nerki - wraz z węzłami chłonnymi nerkowymi, jeśli węzły mają zmiany przerzutowe - umieszczając proste kleszcze pod nerką i podciągając do góry. Wykonaj tę samą procedurę dla drugiej strony.
   6. Aby odsłonić klatkę piersiową, ostrożnie przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej. Przebicie przepony uwolni podciśnienie w klatce piersiowej i odsłoni serce i płuca (Rysunek 1A).
   7. Chwyć mostek i pociągnij do góry, aby jeszcze bardziej otworzyć klatkę piersiową. Obserwuj brzuszną powierzchnię klatki piersiowej wzdłuż klatki piersiowej pod kątem zmian przerzutowych w węzłach chłonnych piersiowych i przeprowadź sekcję, jeśli występuje.
   8. Nadal trzymając mostek, odetnij brzuszną klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i płuc. Chwyć serce, podciągnij i przetnij pod płucami. Aby całkowicie usunąć serce i płuca en bloc, przetnij wszystkie przednie naczynia krwionośne i tchawicę. Umieść tkankę w PBS i ostrożnie usuń serce, nie uszkadzając tkanki płucnej ani zmian przerzutowych do płuc.
   9. Weź niesterylne proste kleszcze i nożyczki preparacyjne i odetnij tylną nogę na głowie kości udowej. Ostrożnie chwyć kość udową i zdejmij tylną nogę z futra.
   10. Połóż tylną nogę na ręczniku papierowym i chwyć tylną łapę. Użyj żyletki z pojedynczą krawędzią, aby zeskrobać/odciąć wszystkie mięśnie i tkankę łączną z kości piszczelowej i udowej. Usuń kość udową z kości piszczelowej, przecinając tył rzepki i usuń kość piszczelową, usuwając tylną łapę. Umieść kość piszczelową i kość udową w 10% NBF. Wykonaj tę samą procedurę po drugiej stronie.
       nuta: Do celów zbadania kości długich myszy pod kątem zmian przerzutowych kość strzałkowa nie musi być nienaruszona. Kości długie zostaną utrwalone w 10% NBF przez tydzień, a następnie odwapnione za pomocą neutralnego roztworu EDTA²⁰. Po trzech tygodniach kości zostaną przeniesione do 70% etanolu.
   11. Po usunięciu tylnych kończyn należy wykonać cięcie ucha lub ogona w celu przyszłego genotypowania. Odrzucić tuszę myszy i wszystkie tkanki, które nie mogą być utrwalone lub użyte do wytworzenia organoidów.  
5. Rozwarstwienie guza gruczołu krokowego
   nuta: Analizę płatów prostaty myszy można przeprowadzić tylko za pomocą mikroskopu preparacyjnego¹⁹. Jednak obciążenie guzem prostaty może być tak wysokie, że nie można rozróżnić poszczególnych płatów, a sekcję można przeprowadzić bez mikroskopu. Niemniej jednak pełny protokół rozwarstwiania poszczególnych płatów prostaty został opisany poniżej.
   1. Umieść obszar moczowo-płciowy w 10-centymetrowym naczyniu PBS pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw brzuszną stronę do góry z pęcherzem moczowym i pęcherzykami nasiennymi skierowanymi w stronę przeciwną do badacza. Wszystkie manipulacje okolicy moczowo-płciowej powinny być wykonywane za pomocą sterylnych narzędzi.
   2. Oceń ogólny fenotyp guza gruczołu krokowego - najprawdopodobniej w PCa GEMM zostanie zaobserwowany guz wypełniony płynem lub lity (Rysunek 2A, B).
      nuta: Guzy wypełnione płynem są często zlokalizowane w przedniej części prostaty (Rysunek 2A). Guzy wypełnione płynem składają się głównie z tkanki łącznej ze skąpymi składnikami nabłonkowymi - dlatego guzy te nie są optymalne do generowania organoidów ze względu na małą liczbę komórek nabłonka guza, co zostanie omówione w sekcji wyników reprezentatywnych.
   3. Jeśli obecne są guzy wypełnione płynem, zrób mały otwór w guzie. Umieść okolicę moczowo-płciową w nowym 10 cm naczyniu PBS.
   4. Weź parę prostych kleszczy w ręce niedominującej i zakrzywionych kleszczy w ręce dominującej. Odwróć obszar moczowo-płciowy do jego grzbietowej powierzchni. Poszukaj bliższego obszaru prostaty (Rysunek 1B), który można zidentyfikować po różowo-czerwonym kolorze cewki moczowej. Chwyć cewkę moczową i przytrzymaj mocno, aby manipulować tkanką moczowo-płciową za pomocą zakrzywionych kleszczy.
      nuta: Podczas rozwarstwiania prostaty zawsze zwracaj uwagę na położenie pęcherza, ponieważ jest to najprostszy sposób na zlokalizowanie poszczególnych płatów prostaty (Rysunek 1B).
6. Usunięcie tkanki innej niż prostata z okolicy moczowo-płciowej
   1. Będąc jeszcze na grzbietowej powierzchni okolicy moczowo-płciowej, znajdź podstawę pęcherzyka nasiennego. Ostrożnie usuń pęcherzyk nasienny i wyrzuć. Wykonaj tę samą procedurę po przeciwnej stronie.
      nuta: Unikaj nakłuwania pęcherzyka nasiennego, ponieważ spowoduje to uwolnienie lepkiego i nieprzezroczystego płynu wydzielniczego, który zakłóca rozwarstwienie prostaty. Jeśli pęcherzyk nasienny zostanie przebity, przenieś pozostały obszar moczowo-płciowy do nowego 10-centymetrowego naczynia ze świeżym PBS.
   2. Usuń i wyrzuć nasieniowody oraz jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej, używając zakrzywionej strony kleszczy.
   3. Nadal mocno trzymając cewkę moczową/proksymalny obszar prostaty, użyj cienkich, spiczastych nożyczek, aby usunąć pęcherz moczowy z cewki moczowej.
7. Izolacja poszczególnych płatów prostaty
   1. Zlokalizuj przednią część prostaty (Rysunek 1B). Upewnij się, że mocno trzymasz bliższy obszar prostaty/cewkę moczową za pomocą prostych kleszczy. Usuń przedni obszar prostaty, bezpośrednio chwytając tkankę zakrzywioną stroną kleszczy i mocno odciągając ją od pęcherza moczowego i reszty prostaty. Umieść tkankę w PBS.
      nuta: W przypadku wszystkich obszarów prostaty mogą być wymagane nożyczki preparujące w celu usunięcia tkanki, w zależności od wielkości guza.
   2. Zlokalizuj brzuszny obszar prostaty (Rysunek 1B). Usuń brzuszną okolicę prostaty w taki sam sposób, jak w kroku 1.5.7.
   3. W tym momencie sekcji powinny być obecne tylko boczne i grzbietowe obszary prostaty, podczas gdy bliższy obszar prostaty jest nadal chwytany przez proste kleszcze. Oceń boczne i grzbietowe obszary prostaty (Rysunek 1B). Jeśli obszar boczny można odróżnić od obszaru grzbietowego, usuń boczny obszar prostaty zgodnie z opisem w kroku 1.5.7. Wykonaj tę samą procedurę po przeciwnej stronie.
   4. Usuń grzbietowy obszar prostaty zgodnie z opisem w kroku 1.5.7. Umieść proksymalny obszar prostaty w 4% PFA, ponieważ jego struktura w tkance mięśniowej cewki moczowej sprawia, że nie nadaje się do wytwarzania organoidów.

2. Generowanie organoidów 3D z tkanki guza prostaty

UWAGA: Rysunek 3 przedstawia obrazkowy opis procedury generowania organoidów nowotworowych.

1. preparat
   1. Przygotuj pożywkę organoidową dla prostaty myszy zgodnie z Drost et al.¹⁸ z następującymi zmianami. Użyj kondycjonowanej pożywki zamiast rekombinowanych białek dla Noggin i R-Spondin i użyj końcowego stężenia 1% (v/v) zamiast 10%, zarówno dla pożywki kondycjonowanej Noggin, jak i R-Spondin.
      nuta: Komórki HEK293 stabilnie transfekowane HA-mysim Noggin-Fc lub HA-mysim Rspo1-Fc są używane odpowiednio do produkcji pożywki kondycjonowanej Noggin- lub R-spondyną. Te linie komórkowe były darem od Laboratorium Calvina Kuo na Uniwersytecie Stanforda.
   2. Przygotować roztwór wytrawiający w probówce o pojemności 15 ml, rozcieńczając 20 mg/ml kolagenazy II z pożywką Advanced DMEM/F12(+++) do końcowego stężenia 5 mg/ml. Dodać inhibitor skał Y-27632 do roztworu kolagenazy II w końcowym stężeniu 10 μM.
      nuta: Stosunek buforu trawiennego do tkanki wynosi od 1 ml do 50 mg, którego używamy zgodnie z Drost et al.¹⁸.
2. Mielenie i trawienie tkanki nowotworowej
   1. W kapturze do hodowli komórkowej umieść tkankę guza gruczołu krokowego w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm, wypreparuj i odrzuć tkankę martwiczą.
   2. Zmiel pozostałą tkankę guza prostaty w kostkę o wielkości 1 mm³, przytrzymując kawałki tkanki sterylnymi zakrzywionymi kleszczami i tnąc nożyczkami do wypreparowania.
   3. Umieść zmielone kawałki guza w probówce o pojemności 15 ml z buforem do wytrawiania, nabierając je zakrzywioną stroną kleszczy. Trawić tkankę nowotworową w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 1,5 do 2 godzin. Sprawdzaj postęp trawienia co 20 min.
      nuta: W tym czasie wyjąć co najmniej 2 ml matrycy z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Rozmrożenie 1 ml podwielokrotności matrycy zajmie około 3 godzin.
   4. Po wytrawieniu tkanek odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby utworzyć osad komórkowy.
   5. Usuń supernatant, przesuń probówkę, aby poluzować osad komórkowy i ponownie zawieś osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
   6. Po inkubacji pipetować w górę i w dół 5 razy za pomocą standardowej końcówki P1000. Ponownie umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na kolejne 5 minut i powtórzyć krok 2.2.6.
      nuta: Na tym etapie procedury należy ogrzać sterylne 6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 55 °C.
3. Zliczanie komórek i ponowne zawieszenie w matrycy
   1. Przemyć komórki, dodając 9 ml zimnego AdDMEM/F12 (+++) i odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Po odwirowaniu usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad i ponownie umyć komórki, dodając 10 ml zimnego AdDMEM/F12 (+++). Odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Po odwirowaniu usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad, ponownie zawiesić komórki w 1 ml AdDMEM/F12 (+++) i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru zgodnie ze standardową procedurą.
   4. Siedem do ośmiu kopuł mieści się w jednej studzience z 6 dołków, gdy organoidy są platerowane w matrycy w sposób kroplowy. Około 200 μl matrycy pozwoli na wyprodukowanie 7-8 kopuł. Zdecyduj, ile studzienek organoidów jest potrzebnych do przyszłych celów eksperymentalnych i oblicz wymaganą objętość matrycy. Następnie oblicz objętość roztworu zawierającego komórkę potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 1,0 x 10⁶ komórek/ml matrycy.
   5. Po zliczeniu komórek odwirować przy 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad i ponownie zawiesić komórki w objętości matrycy obliczonej w kroku 2.3.4.
      nuta: Matryca pozostaje w postaci ciekłej tylko w temperaturze 4 °C; Probówki podstawowe Matrix i roztwory Matrix-Cell należy zawsze trzymać na lodzie.
4. Kopułki matrycowe do powlekania i zastosowanie mediów
   1. Wymieszaj roztwór komórki matrycowej z pipetą P200, aby równomiernie rozprowadzić komórki bez wprowadzania pęcherzyków. Wyjąć 6-dołkową naczynie do hodowli z inkubatora o temperaturze 55 °C.
   2. Ostrożnie odpipetuj 200 μl roztworu z matrycą i szybko wrzuć roztwór do studzienki, aby utworzyć kopuły.
   3. Powtarzać krok 2.4.2 aż do wyczerpania objętości roztworu komórki matrycowej. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   4. Odwróć 6-dołkową szalkę do góry nogami i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby kontynuować krzepnięcie przez 20 minut.
   5. Po inkubacji dodaj 2 ml pożywki z organoidów prostaty myszy do każdej studzienki. Dodać syntetyczny androgen R1881 do każdej studzienki dla końcowego stężenia 1 nM i inhibitora skał Y-27632 do końcowego stężenia 10 μM. Dokładnie wymieszać i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C do hodowli.
      nuta: Pożywki do hodowli organoidów należy suplementować inhibitorem skał 10 μM Y-27632 tylko przez 1 tydzień po wytworzeniu organoidów.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy z sekcji zwłok myszy z dużym, wypełnionym płynem pierwotnym guzem prostaty w przedniej części prostaty są pokazane w Rysunek 2A. Dla kontrastu, Rysunek 2B, pokazuje reprezentatywne obrazy z sekcji zwłok myszy z dużym litym pierwotnym guzem prostaty, dla którego poszczególne obszary prostaty są nie do odróżnienia. Fluorescencyjne obrazy preparacyjne pokazują ten sam lity guz gruczołu krokowego z Rysunek ...

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole rozwarstwienia guza prostaty i generowania organoidów
Usunięcie tkanki innej niż prostata i dokładne rozwarstwienie guza prostaty myszy ma kluczowe znaczenie dla optymalnego generowania organoidów nowotworowych, ponieważ zarówno komórki nabłonkowe niezwiązane z prostatą, jak i normalne komórki nabłonka prostaty będą wytwarzać organoidy. W przypadku litych guzów gruczołu krokowego kluczowe znaczenie ma wyizolowanie obszarów żywotnego guza w celu usunięcia zanieczyszczenia ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% trypsyna + 2,21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 cala, 23 G, jednorazowe igły do strzykawek	Becton Dickinson	Z192430
10% neutralna buforowana formalina	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyd	Usługi mikroskopii elektronowej	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Zaawansowana waga analityczna DMEM/F12+++	Gibco	12634
Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Tablica sekcyjna	Thermo-Fisher	36-1
EHS Matryca mięsaka, Pathclear Lot#19814A10	Wyprodukowana przez Trevigen	Zarekwirowany w National Cancer Institute w Frederick National Laboratory	Posiadacz grantów z National Cancer Institute może wnioskować o matrycę
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamina (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetylo-L-Cysteina	Sigma	A9165
Penicylina-Streptomycyna	Sigma	P4333
Waga precyzyjna	Skalpel Mettler Toledo	30216561
#23	World Precision Instruments	504176
Rękojeść skalpela #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Jednokrawędziowa żyletka z włókna węglowego	Fisherbrand	12-640
Nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej, 10 cm, proste	World Precision Instruments	14393
Kleszczyki do przysłony ze stali nierdzewnej, 10 cm, zakrzywiona końcówka, ząbkowana	World Precision Instruments	15915
Kleszczyki narzędziowe Nugent ze stali nierdzewnej, końcówka prosta, ząbkowana	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (inhibitor skał)	APExBIO	Samolot A3008