Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

28.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

16 czerwca 2019

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Streszczenie

Trójwymiarowe sferoidy komórek nowotworowych są ważnymi narzędziami zarówno do badań przesiewowych leków na raka, jak i do uzyskania mechanistycznego wglądu w biologię komórek nowotworowych. Siła tego preparatu polega na jego zdolności do naśladowania wielu aspektów warunków in vivo nowotworów, a jednocześnie jest szybki, tani i wystarczająco wszechstronny, aby umożliwić stosunkowo wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Warunki hodowli sferoidów mogą podsumować gradienty fizykochemiczne w guzie, w tym rosnącą kwasowość zewnątrzkomórkową, zwiększoną mleczan oraz zmniejszającą się dostępność glukozy i tlenu, od obrzeża sferoidu do jego rdzenia. Również właściwości mechaniczne i interakcje komórka-komórka nowotworów in vivo są częściowo naśladowane przez ten model. Specyficzne właściwości, a co za tym idzie optymalne warunki wzrostu sferoid 3D, różnią się znacznie między różnymi typami komórek nowotworowych. Co więcej, ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidach 3D wymaga metod, które różnią się częściowo od tych stosowanych w przypadku kultur 2D. W tym miejscu opisujemy kilka protokołów przygotowania sferoid 3D komórek nowotworowych oraz wykorzystania takich kultur do oceny żywotności i śmierci komórek w kontekście oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych.

Wprowadzenie

Wykorzystanie wielokomórkowych modeli sferoidalnych w biologii nowotworów ma już kilkadziesiąt lat1,2, ale w ostatnich latach nabrało znacznego rozpędu. W dużej mierze odzwierciedla to zwiększoną świadomość tego, jak silnie fenotyp komórek nowotworowych jest zależny od ich mikrośrodowiska i określonych warunków wzrostu. Mikrośrodowisko w guzach litych zasadniczo różni się od tego w odpowiadających im normalnych tkankach. Obejmuje to warunki fizykochemiczne, takie jak pH, ciśnienie tlenu, a także ciśnienie śródmiąższowe, gradienty stężeń rozpuszczalnych czynników, takich jak składniki odżywcze, produkty przemiany materii i wydzielane związki sygnałowe (czynniki wzrostu, cytokiny). Ponadto obejmuje organizację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), interakcje komórka-komórka i sygnalizację międzykomórkową, a także inne aspekty szczególnej trójwymiarowej (3D) architektury nowotworu3,4,5,6. Specyficzne warunki mikrośrodowiskowe, w których żyją komórki nowotworowe, głęboko wpływają na ich profil ekspresji genów i właściwości funkcjonalne, i jasne jest, że w porównaniu z komórkami hodowanymi w 2D, fenotyp sferoidów 3D znacznie bardziej naśladuje guzy in vivo7,8,9,10,11. Modele 2D, nawet jeśli wykorzystują niedotlenienie, kwaśne pH i wysokie stężenia mleczanu do naśladowania znanych aspektów mikrośrodowiska guza, nadal nie są w stanie uchwycić gradientów parametrów fizykochemicznych powstających w obrębie guzów, a także ich architektury 3D. Z drugiej strony, modele zwierzęce są kosztowne, powolne i etycznie problematyczne, a także mają braki w swojej zdolności do rekapitulacji ludzkich stanów nowotworowych. W związku z tym sferoidy 3D zostały zastosowane jako model o średniej złożoności w badaniach szerokiego zakresu właściwości większości nowotworów litych9,11,12,13,14,15,16,17.

Szeroko stosowanym zastosowaniem sferoid 3D jest badanie przesiewowe skuteczności terapii przeciwnowotworowej9,18,19,20. Odpowiedzi na leczenie są szczególnie wrażliwe na mikrośrodowisko guza, odzwierciedlając zarówno wpływ krętości, ograniczonej dyfuzji, wysokiego ciśnienia śródmiąższowego i kwaśnego pH środowiska na dostarczanie leku, jak i wpływ niedotlenienia i innych aspektów mikrośrodowiska na odpowiedź na śmierć komórki9,17. Ponieważ środowisko w sferoidach 3D z natury rozwija wszystkie te właściwości7,8,9,10,11, zastosowanie hodowli komórkowych 3D może znacznie poprawić translację wyników na warunki in vivo, umożliwiając jednocześnie wydajne i niedrogie wysokoprzepustowe badania przesiewowe wzrostu netto. Jednak zdecydowana większość badań nad odpowiedzią komórek nowotworowych na leki jest nadal prowadzona w warunkach 2D. Prawdopodobnie odzwierciedla to fakt, że podczas gdy niektóre testy można stosunkowo łatwo wdrożyć w hodowlach komórek 3D, wiele z nich, takich jak testy żywotności, western blotting i analiza immunofluorescencyjna, jest znacznie wygodniej wykonywanych w 2D niż w 3D.

Celem obecnej pracy jest dostarczenie łatwo dostępnych testów i precyzyjnych protokołów do analiz wpływu leczenia lekami przeciwnowotworowymi na żywotność i przeżycie komórek rakowych w warunkach 3D naśladujących guz. W szczególności przedstawiamy i porównujemy trzy różne metody tworzenia sferoidów, a następnie metody jakościowych i ilościowych analiz wzrostu, żywotności i odpowiedzi na leki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generacja sferoid

  1. Przygotowanie zawiesin komórkowych do tworzenia sferoidów
    UWAGA:     Różne linie komórkowe mają bardzo różne właściwości adhezyjne i w każdym przypadku należy ustalić najbardziej odpowiedni protokół tworzenia sferoidów. Odkryliśmy, że komórki MCF-7 i BxPC-3 są odpowiednie do spontanicznego tworzenia sferoidów, podczas gdy MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 i MiaPaCa wymagają dodania odtworzonej błony podstawnej, aby z powodzeniem utworzyć sferoidy. Tylko komórki MDA-MB-231 i BxPC-3 zostały wykorzystane w protokole wiszącej kropli, jednak inne linie komórkowe z pewnością mają zastosowanie.
    1. Hoduj komórki jako monowarstwę aż do 70-80% zgryźnia.
    2. Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS, 5 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 10 ml dla kolby o średnicy 75cm2), dodać enzym dysocjujący komórki (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 1 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotności 95%.
    3. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek, dodając pożywkę wzrostową (6-10% surowicy w zależności od linii komórkowej) do całkowitej objętości 5 ml w kolbie o długości 25 cm2 lub 10 ml w kolbie o długości75 cm 2.
    4. Użyj komory Bürker do policzenia komórek i policz 8 kwadratów w komorze na przygotowanie komórki, aby uzyskać wysoką powtarzalność wielkości sferoidów.
      nuta: Poniżej przedstawiono trzy protokoły, z których każdy opisuje inną metodę tworzenia sferoidów. Protokoły 1.2 i 1.3 mogą być stosowane we wszystkich kolejnych przedstawionych protokołach analitycznych, podczas gdy protokół 1.4 najlepiej nadaje się do zatapiania i przygotowywania lizatu. W zależności od linii komórkowej tworzenie sferoid trwa 2-4 dni, niezależnie od zastosowanej metody.
  2. Spontaniczne tworzenie się sferoidów
    1. Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.
    2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 0,5-2 x 104 komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej) (Rysunek 1A (ii)).
    3. Napełnij zewnętrzny pierścień studzienek 1x PBS lub pożywką wzrostową, aby zmniejszyć parowanie z pozostałych studzienek. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 200 μl / studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych o bardzo niskim nasadce (Rysunek 1A (iii)).
    4. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności 5% CO2 i wilgotności 95%.
    5. Co 2-3 dni uzyskuj świetlne obrazy mikroskopowe sferoidów.
      nuta: Obrazy w tym artykule zostały wykonane w powiększeniu 11,5x, co jest odpowiednie dla większości sferoid przygotowanych przy użyciu tych protokołów.
    6. Co 2-3 dni (po pobraniu obrazów) wymieniaj 100 μl pożywki (usuń 100 μl zużytej pożywki i zastąp 100 μl świeżej pożywki.
      nuta: Aby uniknąć usuwania sferoid podczas wymiany podłoża, zaleca się lekkie przechylenie płytki podczas powolnego wyjmowania pożywki i sprawdzenie zasysanego medium w końcówkach pod kątem widocznych sferoid przed jego wyrzuceniem.
  3. Odtworzona formacja sferoidowa za pośrednictwem błony podstawnej.
    UWAGA:     Zastosowano błonę podstawną odtworzoną przez zredukowany czynnik wzrostu (rBM) wolną od dehydrogenazy laktozy podnoszącej poziom laktozy (LDEV). rBM jest wrażliwy na temperaturę i powinien być zawsze przechowywany na lodzie, ponieważ będzie krzepł, jeśli osiągnie 15 °C. Przed posiewem rozmrozić rBM na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C lub 2-4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
    1. Rozmrozić rBM na lodzie (patrz tabela materiałów).
    2. Talerze i zbiorniki (jeśli są owinięte pojedynczo) należy przechowywać na lodzie przed użyciem.
    3. Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.
    4. Napełnij zewnętrzny pierścień studzienek 1x PBS lub pożywką wzrostową, aby zmniejszyć parowanie z pozostałych studzienek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 0,5-2 x 104 komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej) (Rysunek 1A (ii)).
    5. Umieścić probówkę o pojemności 15 ml zawierającą rozcieńczoną zawiesinę komórek na lodzie (np. w szklanej zlewce) (Rysunek 1A (iia)).
    6. Przenieś schłodzone płyty i zbiorniki do okapu. Opłucz plastikowe pojemniki, napełnij je lodem i przenieś do okapu, aby umożliwić umieszczenie płytek i zbiorników na lodzie podczas całej procedury.
    7. Delikatnie zawiesić rBM, aby uzyskać jednorodny żel.
    8. Dodaj 1-2% rBM (optymalne stężenie należy określić dla każdej linii komórkowej) do schłodzonych zawiesin komórkowych (Rysunek 1A (iib)).
    9. Odwrócić probówkę o pojemności 15 ml, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie rBM i zawiesiny komórek przed dozowaniem zawiesiny do płytki.
    10. Przenieś zawiesinę komórek zawierającą rBM do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do schłodzonych 96-dołkowych płytek o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 1A (iii)).
      nuta: W przypadku pracy z kilkoma zawiesinami komórkowymi (np. więcej niż jedną linią komórkową) konieczne jest dozowanie każdej zawiesiny komórkowej natychmiast po dodaniu rBM, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.
    11. Odwirować płytkę przez 15 minut przy stężeniu 750 x g, stosując "miękkie hamowanie" (jeśli to możliwe, odwirować w temperaturze 4 °C, aby utrzymać płyn rBM dłużej, ale nie jest to wymagane do pomyślnego wytworzenia sferoidy), aby zapewnić, że komórki są zgrupowane razem, gdy rBM stwardnieje, ułatwiając tworzenie jednej pojedynczej sferoidy.
    12. Inkubować płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
    13. Co 2-3 dni pobieraj świetlne obrazy mikroskopowe w celu oceny wzrostu sferoidów.
    14. Co 2-3 dni wymieniaj 100 μl pożywki (usuń 100 μl i zastąp 100 μl świeżej pożywki).
  4. Wiszące sferoidy kroplowe.
    1. Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.
    2. Rozcieńczyć komórki w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia. Praktyczne rozcieńczenie to 50 000 komórek/ml.
    3. Zdejmij pokrywkę naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 10 cmi umieść je tak, aby było skierowane do góry. Dodaj 6 ml 1x PBS do naczynia (Rysunek 1B (i)).
    4. Wlej zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika i ostrożnie umieść do 30 kropli po 40 μl zawiesiny komórkowej na pokrywie naczynia do hodowli komórkowej za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 1B (ii)), co daje stężenie 2 000 komórek / kroplę. Unikaj umieszczania kropli zbyt blisko krawędzi pokrywki, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że krople te stracą napięcie powierzchniowe podczas odwracania pokrywki w następnym kroku.
    5. Odwróć pokrywkę szybkim, ale kontrolowanym ruchem i umieść ją na wierzchu 1x naczynia do hodowli komórkowych zawierającego PBS (Rysunek 1B (iii)).
    6. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% bez naruszania kropli i pozostaw je do wyrośnięcia na 4-6 dni.
    7. Jeśli mają być używane do lizatów białkowych lub zatapiania, należy zebrać sferoidy, zdejmując pokrywkę i przechylając ją, aby zmyć krople 1 ml podgrzanego podłoża. Przenieś otrzymaną pożywkę zawierającą sferoidy do probówki o pojemności 1,5 ml i pozwól im osiąść na dnie probówki. Postępować zgodnie z opisem w ppkt 4.4 i 6.2.2 odpowiednio dla lizatów białkowych i zatapiania.

2. Leczenie farmakologiczne sferoid

UWAGA: Długotrwałe leczenie farmakologiczne może być stosowane do sferoid w celu sprawdzenia efektów działania interesującego leku. Przed rozpoczęciem leczenia farmakologicznego zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z reakcją na dawkę leku (leków) w celu znalezienia odpowiedniej dawki dla leczenia eksperymentalnego. Dawki powinny być oparte na ustalonym IC50/Ki leku i wynosić od około 0,2x-10x tej wartości.

  1. Ustaw 6-12 sferoid na żądany stan, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieść w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 2 dni.
  2. W dniu 2 wykonaj zdjęcia sferoid w mikroskopie.
  3. Przygotować pierwsze dawki lecznicze (po uzyskaniu obrazów).
    nuta: Pierwsze stężenie poddane działaniu środka musi być dwukrotnie większe od pożądanego stężenia końcowego, ponieważ roztwór zostanie rozcieńczony w stosunku 1:2 po dodaniu do studzienki zawierającej 100 μl pożywki. Sugerowane odstępy między leczeniem (zależy od okresu półtrwania leku): Dzień 2, 4 i 7.
  4. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usuń 100 μl pożywki i zastąp ją 100 μl pożywki zawierającej lek.
  5. Umieścić 96-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% i powtórzyć 2,3 i 2,4 w wybranych dniach leczenia, ale teraz bez podwajania dawki w celu uzyskania prawidłowej dawki końcowej.
  6. W ostatnim dniu protokołu/harmonogramu leczenia można wykonać jeden lub kilka z poniższych testów.

3. Test żywotności komórek dla sferoidów

  1. Ustawić 4-6 sferoid na żądany warunek, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.
    nuta: W tym przypadku test żywotności komórek przeprowadzono w 7 lub 9 dniu, po monitorowaniu wzrostu sferoidów co 2-3 dni za pomocą mikroskopii świetlnej, jak opisano powyżej (pkt 1.2.5 i 1.3.13).
  2. Rozmrozić odczynnik do oznaczania żywotności (patrz tabela materiałów) i pozostawić go do zrównoważenia z RT przed użyciem.
  3. Delikatnie wymieszać, odwracając do uzyskania jednorodnego roztworu.
  4. Przed wykonaniem testu należy usunąć 50% pożywki hodowlanej ze sferoid (100 μl).
  5. Dodaj odczynnik żywotności komórek do każdej studzienki w stosunku 1:3 do ilości pożywki obecnej w studzience (Rysunek 2A (i)) W przypadku płytki 96-dołkowej dodaj 50 μl odczynnika do 100 μl pożywki.
  6. Mieszaj zawartość energicznie przez 5 minut, aby wywołać lizę komórek (Rysunek 2A (ii)).
  7. Inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej, aby ustabilizować sygnał luminescencyjny (Rysunek 2A (iii)).
  8. Nagraj sygnał luminescencyjny (Rysunek 2A (iv)).

4. Przygotowanie lizatów białkowych do Western Blotting z kultur sferoidalnych 3D

UWAGA: Podczas zbierania sferoid zaleca się użycie pipety P200 i odcięcie końcówki końcówki, aby umożliwić większy otwór, a tym samym łatwiejsze uchwycenie sferoid bez naruszania ich struktury.

  1. Dla każdego warunku zbierz co najmniej 12, najlepiej 18-24 sferoidy (w zależności od wielkości sferoidy) w probówce o pojemności 1,5 ml (unikaj probówek o pojemności 2 ml, ponieważ kolejne kroki staną się trudniejsze ze względu na ich mniej spiczaste dno).
    UWAGA: Jeśli ilość pożywki przekracza 1,5 ml przed zebraniem wszystkich sferoid, pozwól zebranym sferoidom osiąść na dnie (dzieje się to bardzo szybko, wirowanie nie jest konieczne) i wyrzuć połowę objętości probówki przed kontynuowaniem zbierania pozostałych sferoidów.
  2. Umieść probówki na lodzie i pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Przenieś się z laboratorium komórek sterylnych do zwykłego laboratorium.
  4. Umyj sferoidy dwukrotnie w 1 ml lodowatego 1x PBS. Pozwól sferoidom osiąść przed wyjęciem 1x PBS między każdym etapem prania.
  5. Zassać jak najwięcej 1x PBS, nie naruszając ani nie usuwając sferoid.
  6. Dodać 5 μl podgrzanego buforu do lizy (LB) z inhibitorami fosfatazy i proteazy na sferoidę (np. 10 sferoidów = 50 μL LB).
  7. Powtarzaj interwały wiru, a następnie wirowanie w dół, aż sferoidy się rozpuszczą. Wykonuj cykl wirowania przez 30 s, a następnie wirowanie (wystarczy szybkie wirowanie za pomocą wirówki stołowej) przez 10 s przez ok. 5-10 minut, w zależności od wielkości i zwartości sferoid.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Utrzymuj lizaty w temperaturze -20 °C do czasu przystąpienia do sonikacji, homogenizacji i oznaczania białka, jak w standardowym protokole lizatu białkowego 2D, a następnie Western blot przy użyciu standardowych protokołów.

5. Barwienie sferoidów jodkiem propidyny (PI)

  1. Ustawić 3-6 sferoid na żądany stan, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.
  2. W sterylnym laboratorium hodowli komórkowych podgrzać 1x PBS do temperatury 37 °C.
  3. Przygotować roztwór PI o objętości 4 μM, rozcieńczając roztwór podstawowy w 1x PBS: Rozcieńczyć 1 mg/ml wodnego roztworu PI 1:350 w 1x PBS.
    nuta: Stężenie to zostanie zmniejszone o połowę po dodaniu roztworu do studzienek, co da końcowe stężenie 2 μM. Na każdą studzienkę zawierającą sferoidę potrzeba 100 μl tego roztworu.
    ostrożność: Z jodkiem propidu (PI) należy obchodzić się pod wyciągiem i w rękawicach. PI jest światłoczuły. Chronić przed światłem podczas obsługi.
  4. Usunąć 100 μl pożywki z każdego dołka w płytce 96-dołkowej bez usuwania sferoid.
  5. Wypłukać pozostałą pożywkę, dodając 100 μl podgrzanego 1x PBS do wszystkich studzienek, a następnie usuwając 100 μl cieczy z dołków. Powtórz ten krok prania 3 razy.
  6. Dodać 100 μl roztworu PI do każdej studzienki, przykryć płytkę folią aluminiową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% na 10-15 min.
  7. Powtórzyć 3 etapy płukania opisane w ppkt 4.5 w celu wypłukania roztworu PI, w celu zmniejszenia sygnału tła podczas obrazowania.
  8. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby zobrazować sferoidy. Aby ocenić żywotność komórek w rdzeniu sferoidalnym, należy użyć stosów z, aby uzyskać obrazy o różnej głębokości sferoidy.
    nuta: Zalecany jest odstęp około 18-35 μm między każdym plasterkiem w zależności od wielkości sferoidy, co daje około 11-18 stosów na sferoidę. Stosy Z mogą być przetwarzane w ImageJ za pomocą funkcji projekcji z, która może połączyć wszystkie stosy Z w jeden ostateczny obraz, dając przegląd barwienia w całej sferoidzie (dalsze wskazówki dotyczące stosowania ImageJ w tym celu znajdują się w (https://imagej.net/Z-functions).

6. Osadzanie sferoid 3D

  1. Przygotuj żel agarozowy, w którym zanurzone są sferoidy (konieczne tylko przy pierwszym wykonywaniu protokołu).
    1. Wymieszaj 1 g baktoagaru z 50 ml ddH2O.
    2. Podgrzewaj powoli w kuchence mikrofalowej, aż baktoagar się rozpuści i utworzy się jednorodny żel. Nie dopuścić do wrzenia żelu.
    3. Utrzymuj baktoagar w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
    4. Przechowywać w temperaturze 4 °C pomiędzy eksperymentami.
  2. Osadzanie sferoid.
    1. W dniu 1, dla każdego stanu, zbierz co najmniej 12 sferoid w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Umyj raz 1 ml lodowatego 1x PBS.
    3. Aby utrwalić sferoidy, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu.
      nuta: Obchodzenie się z paraformaldehydem powinno odbywać się pod wyciągiem.
    4. Pozwól im inkubować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. W dniu 2 ostrożnie podgrzej żel agarozowy, umieszczając go w zlewce wypełnionej wodą w kuchence mikrofalowej. Upewnij się, że żel się nie zagotuje! Przechowywać w cieple na stołowej płycie grzewczej w temperaturze 60 °C do momentu użycia.
    6. Umyj sferoidy dwukrotnie 1 ml lodowatego 1x PBS.
    7. Zassać większość 1x PBS (pozostawienie około 100 μl w tym miejscu jest praktyczne do obsługi sferoid).
    8. Przygotuj pipetę o pojemności 20 μl, przecinając końcówkę pipety pod kątem, aby uzyskać bardziej spiczastą końcówkę z większym otworem (patrz ilustracja).
      nuta: Następna część musi być wykonana szybko, aby zapewnić optymalny transfer sferoidów i uniknąć zestalenia kropli żelu. Jeżeli blok grzewczy nie jest dostępny, zaleca się najpierw złapanie sferoid, a następnie spowodowanie spadku agarozy (tj. zamiana kolejności punktów 6.2.9 i 6.2.10).
    9. Zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko na ciepłym bloku grzewczym, aby zapobiec zestaleniu się agarozy.
    10. Używając zmodyfikowanej końcówki pipety (patrz ppkt 6.2.8), złapać jak najwięcej sferoidów w objętości 15-20 μl.
    11. Ostrożnie wstrzyknąć 15-20 μl sferoidy zawierającej 1x PBS do środka kropli żelu agarozowego, nie dotykając szkiełka mikroskopowego.
      nuta: Jest to nieco trudna kwestia. Sferoidy zostaną utracone, jeśli końcówka pipety dotknie szkiełka mikroskopowego podczas wstrzykiwania sferoid do kropli żelu. Wskazane jest przećwiczenie całego procesu wytwarzania kropli agarozy i wstrzykiwania sferoid poprzez wstrzykiwanie kolorowego płynu do kropli. Umożliwi to wizualizację potencjalnej penetracji przez kroplę, ponieważ kolorowa ciecz będzie wyciekać na szkiełko.
    12. Pozwól, aby kropla żelu agarozowego stwardniała, inkubując przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C. Gdy kropla żelu nieco zastygnie (ale nadal jest raczej miękka), ostrożnie wepchnij kroplę żelu ze szkiełka mikroskopowego do plastikowej kasety na chusteczki za pomocą skalpela.
    13. Przykryj plastikowe kasety na chusteczki higieniczne 70% etanolem.
      nuta: W tym momencie sferoidy mogą być używane bezpośrednio lub przechowywane przez wiele miesięcy.
    14. Sferoidę zatopioną w agarozie zatopić w parafinie, podzielić na szkiełka warstwowe o grubości 2-3 μm i wybarwić hematoksyliną i eozyną lub poddać barwieniu immunohistologicznemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Testy wzrostu sferoidów, oparte na protokole tworzenia sferoidów przedstawionym schematycznie na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B, posłużyły jako punkt wyjścia do analizy wpływu leków przeciwnowotworowych w środowisku imitującym trójwymiarowy guzy. Łatwość tworzenia sferoidów zależy od linii komórkowej, a niektóre linie wymagają suplementacji rBM w celu uformowania spójnych sferoidów22. Stężenie dodanego rBM mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie sferoid 3D komórek rakowych okazało się cennym i wszechstronnym narzędziem nie tylko do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych, ale także do uzyskania mechanistycznego wglądu w regulację śmierci i żywotności komórek rakowych w warunkach naśladujących te w mikrośrodowisku guza. Jest to szczególnie istotne, ponieważ na dostępność, wychwyt komórkowy i wewnątrzkomórkowe efekty leków chemioterapeutycznych głęboki wpływ mają warunki fizykochemiczne w guzie, w tym pH, napięcie tlenu, krętość oraz fizyczne i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Katrine Franklin, Mark i Annette Bartels za doskonałą pomoc techniczną oraz Asbjørn Nøhr-Nielsen za przeprowadzenie eksperymentów na rysunku 1D. Praca ta została sfinansowana przez Fundację Einara Willumsena, Fundację Novo Nordisk i Fundację Juchum (wszystkie na rzecz SFP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-(4-amidinofenylo)-1H-indolo-6-karboksyamidyna (DAPI)Witrogen# C10595 Do barwienia jąder
5-Fluorouracyl (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Składnik chemioterapii
5-(N-etylo-izopropylo)amiloryd (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibitor przeciwciała NHE1
przeciwko PARP i cPARPSygnalizacja komórkowa#9542Stosowany w western blot
Przeciwciało przeciwko sygnalizacji komórkowej Ki-67#9449Używany do IHC
Przeciwciało przeciwko sygnalizacji komórkowej p53 #2524 Używany do IHC
Przeciwciało przeciwko β-aktynieSigma A5441Stosowany w western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Używany do przygotowania żelu agarozowego
Wzorcowa drabinka białkowaInvitrogen#10747-012Używany do SDS-PAGE
Bio-Rad DC Zestaw do oznaczania białekBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115   Służy do oznaczania białek z lizatów
Bü Komora rycerskaMarienfeld610311Do liczenia komórek 
Mikroskop epifluorescencyjny BX63OlympusUżywany do obrazowania fluorescencyjnego
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3DPromega#G9681Używany do oznaczania żywotności komórek
CisplatynaSigma-Aldrich#P4394 Składnik w leczeniu chemioterapeutycznym
Mikropłytka sferoidalna Corning, 96 dołków, z przezroczystym okrągłym dnem,  Bardzo niska nasadka, z pokrywką, sterylnaCorning#4520Używana do uprawy sferoid z pomiarami luminescencji jako punkt końcowy
Corning 96 dobrze, przezroczyste okrągłe dno,  Mikropłytka o bardzo niskim mocowaniu, z pokrywką, sterylnaCorning#7007Wystarczająca do wzrostu sferoidalnego bez pomiarów luminescencji jako punktu końcowego
Kryterium TGX Prefabrykowane żeleBio-Rad5671025Stosowany do SDS-PAGE
DoksorubicynaAbcam#120629Składnik w leczeniu chemioterapeutycznym
FLUOStar Optima Czytnik mikropłytekBMG LabtechSłuży do rejestracji luminescencji 
Formaldehyd Chemikalia VWR #9713.1000 Służy do utrwalania komórek
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A1413202Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, aby zapobiec krzepnięciu. Określany w protokole jako rBM.
Inaktywowany termicznie FBSSigma#F9665Surowica do pożywek wzrostowych
ImageJNIHScientific Analiza obrazu
Kaseta Medim Uni-safeMedim Histotechnologie10-0114Służy do przechowywania osadzonych sferoid
Mini inhibitory proteazy w tabletkach koktajlowychRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Służy do przygotowania buforu do lizy
Mikroskop MZ16LeicaSłuży do lekkich obrazów mikroskopowych
NuPAGE LDS 4x Bufor próbki Invitrogen#NP0007Używany do western blotting
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Używany do western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUżywany do barwienia pasm białkowych
Prism 6.0GraphpadNaukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk
Jodek propidyny (1 mg/ml roztwór w wodzie)Invitrogen P3566Światłoczuły 
Zbiorniki sterylne, wielokanałoweSPL lifesciences21002Służy do wysiewu komórek do tworzenia sferoidów
Szkiełko adhezyjne Superfrost Ultra-Plus Menzel-Glä ser#J3800AMNZSzkiełko mikroskopowe używane do zatapiania
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Stosowany jako chemioterapeutyk
Trans-blot Turbo 0,2 µ m membrany nitrocelulozoweBio-Rad#170-4159Stosowany do zachodniego blottingu
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Używany do roztworu SDS-PAGE
Trypsin-EDTASigma#T4174 Enzym dysocjacji komórek

Bibliografia

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039(2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51(2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla sferoid wywotno kom rek nowotworowychocena mierci kom rkowejprzesiewowe badanie lek w przeciwnowotworowychmikro rodowisko guzametoda kropli z r kizatapianie w immunohistochemiibarwienie jodkiem propidiumobrazowanie Z stackwp yw st enia rBM
Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.