Method Article

Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

DOI:

10.3791/59716

⸱

June 5th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 2Division of Cardiovascular Sciences, School of Medical Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 3Lydia Becker Institute of Immunology and Inflammation, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo tego, że jest to najcięższy podtyp udaru o wysokiej śmiertelności globalnej, nie ma specyficznego leczenia dla pacjentów z krwotokiem śródmózgowym (ICH). Przedkliniczne modelowanie ICH okazało się trudne, a obecne modele gryzoni słabo oddają spontaniczną naturę ICH u ludzi. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na alternatywne metodologie przedkliniczne do badania mechanizmów chorobowych w ICH i do potencjalnego odkrywania leków.

Wykorzystanie danio pręgowanego stanowi coraz bardziej popularne podejście do badań translacyjnych, głównie ze względu na szereg zalet, jakie posiadają w stosunku do ssaczych modeli chorób, w tym płodne wskaźniki reprodukcji i przezroczystość larw pozwalającą na obrazowanie na żywo. Inne grupy ustaliły, że larwy danio pręgowanego mogą wykazywać spontaniczne ICH po genetycznym lub chemicznym zakłóceniu rozwoju naczyń mózgowych. Celem tej metodologii jest wykorzystanie takich modeli do badania patologicznych konsekwencji wylewu krwi do mózgu, w kontekście przedklinicznych badań ICH. Korzystając z obrazowania na żywo i testów ruchliwości, można ocenić i określić ilościowo uszkodzenia mózgu, zapalenie nerwów i funkcje lokomotoryczne po ICH.

To badanie pokazuje, że kluczowe patologiczne konsekwencje krwotoku mózgowego u ludzi są zachowane w larwach danio pręgowanego, podkreślając organizm modelowy jako cenny system in vivo do badań przedklinicznych ICH. Celem tej metodologii jest umożliwienie społeczności zajmującej się udarem przedklinicznym zastosowania modelu larwalnego danio pręgowanego jako alternatywnego uzupełniającego systemu modelowego dla gryzoni.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krwotok śródmózgowy (ICH) jest najpoważniejszym podtypem udaru związanym z samoistnym pęknięciem naczynia mózgowego i krwawieniem do miąższu, prowadzącym do uszkodzenia mózgu, niepełnosprawności fizycznej i często śmierci1. Pomimo wysokiej śmiertelności i zachorowalności związanej z ICH2, nadal brakuje zrozumienia etiologii leżącej u podstaw i patologii po krwotoku. W związku z tym nie ma specyficznych metod leczenia, które zapobiegałyby ICH lub poprawiały wyniki leczenia pacjentów. Większość naszej wiedzy na temat biologii chorób pochodzi z przedklinicznych modeli gryzoni ICH3, jednak dotychczasowe badania nad tymi modelami nie przyniosły żadnego skutecznego zastosowania terapeutycznego w klinice4,5. To niepowodzenie może być częściowo spowodowane pewnymi ograniczeniami tych modeli przedklinicznych, w tym niemożnością łatwego podsumowania spontanicznej natury ludzkiej choroby i wymogiem inwazyjnej chirurgii w celu wygenerowania modeli u ssaków6. Ponadto gryzonie stwarzają praktyczne problemy w zakresie obserwacji szybkiego początku odpowiedzi komórkowej na ICH w nienaruszonej tkance. Biorąc pod uwagę brak translacji z modeli gryzoni, opracowanie alternatywnych modeli spontanicznego ICH jest konieczne, jeśli mamy przezwyciężyć te praktyczne problemy i pomóc w identyfikacji nowych celów leków.

Molekularne mechanizmy rozwoju naczyń krwionośnych są dobrze zachowane wśród kręgowców, w tym danio pręgowanego (Danio rerio)7. W związku z tym przyjęcie tego modelowego organizmu staje się coraz bardziej użyteczną strategią mechanistyczną do badania chorób naczyń mózgowych8. Wygenerowano szereg modeli danio pręgowanego, które podsumowują fenotypy związane ze stanami związanymi z udarem9,10,11,12. Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patogenezy choroby oferuje zarówno praktyczne, jak i naukowe korzyści w porównaniu z modelami ssaków8. Obejmuje to wysokie wskaźniki reprodukcji, szybki rozwój i przezroczystość larw, co pozwala na obrazowanie przyżyciowe bez inwazyjnych ograniczeń związanych z gryzoniami. Połączenie tych zalet z szeroką gamą transgenicznych linii reporterowych dostępnych w społeczności badawczej danio pręgowanego stanowi potężne podejście in vivo do badania biologii chorób, które nie jest jeszcze wykorzystywane do badania patologicznych konsekwencji ICH.

Reakcja na uraz krwi w mózgu jest dwufazowa13; Pierwotna zniewaga powoduje śmierć neuronów i martwicę komórek, która następnie inicjuje wtórną falę uszkodzeń, które są indukowane przez wrodzoną aktywację immunologiczną. Druga faza uszkodzenia mózgu, w szczególności komponent neurozapalny, jest uważana za realistyczny cel dla przyszłego leczenia farmakologicznego13. Spontaniczne i specyficzne dla mózgu krwotoki zostały wcześniej opisane u larw danio pręgowanego14,15,16,17,18,19. Dwa takie modele to zastosowanie atorwastatyny (ATV) w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) w celu zahamowania szlaku HMGCR i biosyntezy cholesterolu14 oraz mutant bubblehead (bbh), który wyraża hipomorficzną mutację w genie arhgef7, βpix, a następnie hamuje przebudowę aktyny dla ścisłych połączeń wewnątrznaczyniowych18. Modele te wykazują spontaniczne pęknięcie naczyń krwionośnych specyficzne dla mózgu na początku krążenia (~33 hpf). Ostatnio scharakteryzowaliśmy te modele, aby ujawnić, że kluczowe aspekty reakcji na uszkodzenie mózgu są zachowane między ludźmi a larwami danio pręgowanego20. Badanie to demonstruje metodologię wymaganą do uzyskania i wizualizacji spontanicznych krwotoków mózgowych u larw danio pręgowanego oraz sposobu ilościowego określenia uszkodzenia mózgu oraz fenotypów lokomotorycznych i neurozapalnych, które odnoszą się do stanu ludzkiego. Te dane i techniki przemawiają za wykorzystaniem tego gatunku modelowego jako cennego systemu uzupełniającego dla przedklinicznych badań ICH.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany były hodowane i utrzymywane w Jednostce Usług Biologicznych Uniwersytetu w Manchesterze w standardowych warunkach, jak opisano wcześniej21. Hodowla dorosłych ryb danio pręgowanego została zatwierdzona przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Uniwersytetu w Manchesterze. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (PPL:P132EB6D7).

UWAGA: Linie transgeniczne użyte w tym badaniu obejmują specyficzną dla makrofagów linię mpeg1:mCherry (skonstruowaną wewnętrznie, jak wcześniej opisano22), mpo:GFP23,specyficzna dla erytroidu gata1:dsRed24 i ubiq:secAnnexinV-mVenus, reporter śmierci komórki (re-derived in house25)na wild-type, nacre (mitfaw2/ W2) i zmutowane (BBHM292). Rysunek 1 pokazuje oś czasu eksperymentu.

figure-protocol-1
Figure 1: Grafika przedstawiająca eksperymentalną oś czasu charakteryzującą uszkodzenia mózgu, wyniki lokomotoryczne i neurozapalne. ICH, krwotok śródmózgowy; bbh, bąbelkowa głowa. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Dzień 0: Produkcja i zbiór jaj

  1. Zbieraj zapłodnione zarodki z naturalnego tarła w skrzynkach hodowlanych wyprodukowanych z 1 samca i 1-2 samic dorosłego danio pręgowanego.
    UWAGA: W protokole atorwastatyny można użyć dowolnych zwierząt typu dzikiego/transgenicznego, jednak wskaźniki krwotoków różnią się nieznacznie w zależności od szczepu.
  2. Inkubować 100 zarodków w temperaturze 28 °C w standardowym pożywce dla zarodków E3 na szalkę Petriego i etapować zgodnie ze standardowymi wytycznymi26.
  3. Po ~6 godzinach od zapłodnienia (hpf) usuń martwe i niezapłodnione zarodki z naczynia za pomocą pipety Pasteura.

2. Dzień 1: Leczenie atorwastatyną w dawce 24 hpf

  1. Dekorionate zarodki do leczenia atorwastatyną za pomocą ostrych, ultracienkich kleszczy preparacyjnych27. Liczby wymagane do eksperymentowania można odpowiednio dostosować.
  2. Dodać 30 ml pożywki z zarodków E3 do dwóch czystych szalek Petriego. Użyj jednego naczynia na 100 zarodków.
    UWAGA: Jeśli płytki są przeznaczone do hodowli komórkowych, danio pręgowany z odchorionowaną chorionacją na tym wczesnym etapie często przylega do dna. Aby tego uniknąć, przed użyciem dokładnie opłucz płytki w czystej wodzie.
  3. Usunąć 60 μl wody z zarodków z płytki zabiegowej i dodać 60 μl 0,5 mM atorwastatyny (ATV). Przy stężeniu podstawowym 0,5 mM, powyższe rozcieńczenie spowoduje końcowe stężenie 1 μM, co spowoduje ~20% larw bez krwotoku (ICH-) i ~80% larw krwotoków (ICH+). Drugą płytkę należy stosować do kontroli niepoddanych działaniu środka
    UWAGA: Atorwastatyna jest rozpuszczana w wodzie destylowanej (3 mg w 10 ml) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 0,5 mM. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności z mieszaniem, ponieważ rozpuszczanie zajmuje trochę czasu. Całkowita rozpuszczalność może potrwać do 1 tygodnia. Nie używaj DMSO. Roztwór jest podawany i przechowywany w temperaturze -20°C. Nie zamrażać, nie rozmrażać.
  4. Za pomocą pipety Pasteura przenieś 100 zarodków w jak najmniejszej ilości wody na płytki zabiegowe.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: ICH wystąpi między 33 a 48 hpf. Atorwastatyna nie musi być usuwana, ponieważ inkubacja trwała dłużej niż 24 godziny nie powoduje żadnych dalszych problemów rozwojowych.

3. Dzień 2: Separacja populacji ICH- i ICH+ na poziomie 50 hpf

  1. Oddziel ryby ICH+ od populacji ICH- i przenieś je do nowych potraw dla ułatwienia.
    1. W przypadku stosowania modelu ATV przy stężeniu 1 μM, 75-100% larw będzie wykazywać krwotok (ICH+) w tym punkcie czasowym.
      UWAGA: Reakcja larw różni się w zależności od szczepu, jeśli larwy nie krwotoczą z pożądaną częstotliwością, użyj świeżej partii atorwastatyny lub o wyższym stężeniu. Jeśli larwy nie wykazały krwotoku o 48 hpf, należy je uznać za ICH-.
    2. W przypadku korzystania z modelu bbh, wszystkie homozygotyczne mutanty będą wykazywać krwotok o 48 hpf. W przypadku stosowania heterozygotycznego krzyżówki, rodzeństwo ICH- heterozygotyczne i dzikie może być używane jako zwierzęta kontrolne do eksperymentów.
  2. W razie potrzeby znieczulić larwy, dodając 0,02% MS222 do pożywki E3. Za pomocą pipety Pasteura posortuj larwy pod kątem obecności krwi w głowie na świeże podłoże E3. Zobacz Rysunek 2.
    UWAGA: Krew w głowie może pojawić się w przodomózgowiu, środkowej lub tylnej części mózgowia lub w połączeniu, a objętość krwawienia może się różnić w zależności od zwierzęcia. U mutantów bbh ICH jest często związany z ciężkim obrzękiem rozpoznawalnym po większych głowach, szerszej przestrzeni między oczami i bardziej rozlanym krwawieniu. Jednak nie wszystkie larwy ICH+ bbh wykazują obrzęk
    3. .

figure-protocol-2
Figure 2: ICH+ fenotypy krwotoku mózgowego.Przykłady fenotypów larwalnych ICH utrzymywanych na transgenicznym tle masy perłowej reporterowej gata1:DsRed obserwowane za pomocą stereomikroskopu jasnego pola (górne panele) i fluorescencji (dolny panel) w ~48 godzin po zapłodnieniu. Nie zaobserwowano krwotoków u larw ICH (lewe panele). Wyraźne nagromadzenie czerwonych krwinek w przodomózgowiu i tyłomózgowiu (strzałki) zaobserwowano u larw ICH+ (prawe panele). Podziałka liniowa wynosi 250 μm. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Dzień 3: Śmierć komórki i analiza leukocytów przy 72 hpf

  1. Przebadaj larwy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zapewnić ekspresję białka fluorescencyjnego.
    UWAGA: W tym badaniu transgeniczne larwy ubiq:secAnnexinV-mVenus zostały wykorzystane do zgłoszenia śmierci komórek mózgowych i podwójnej transgenicznej mpo:GFP; mpeg1:mCherry lub ubiq:secAnnexinV-mVenus; mpeg1:mCherry używany do analizy leukocytów.
  2. Napełnij komorę montażową arkusza świetlnego nośnikiem E3 zawierającym 0.02% MS222.
  3. Znieczulić larwy za pomocą 0,02% MS222. Przenieść larwy do montażu (n = 1-6) na suchą powierzchnię płytki Petriego w jednej kropli. Usuń jak najwięcej płynu.
    UWAGA: 1,5% niskotopliwą agarozę przygotowuje się przy użyciu 0,15 g niskotopliwej agarozy rozpuszczonej w 10 ml pożywki E3 bez błękitu metylenowego w kuchence mikrofalowej i przechowywanej w temperaturze 45 °C do momentu użycia.
  4. Dodać kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy (utrzymywanej w postaci ciekłej w bloku grzewczym o temperaturze 45 °C) do larw i za pomocą kapilary montażowej o średnicy 800 μm i wciągnąć larwy głową do przodu. Jeśli pozycjonowanie nie jest dokładne, larwy można wydalić z agarozy i ponownie zamontować. Pozostaw kapilę do ostygnięcia przed włożeniem do komory arkusza świetlnego.
    UWAGA: Alternatywnie do tej procedury można użyć mikroskopu konfokalnego. W tym celu larwy należy zamontować bocznie w agarozie na naczyniu ze szklanym dnem.
  5. Uzyskuj obrazy z-stack głowy między soczewkami oczu (~300 μm) i przetwarzaj obraz projekcyjny o maksymalnej intensywności.
    1. Przeanalizuj obszar mózgu na podstawie zebranych obrazów pod kątem całkowitej liczby komórek fluorescencyjnych i całkowitej intensywności fluorescencji20.
  6. Utwórz film poklatkowy przedstawiający wiele kompozytów projekcyjnych w ciągu 18-24 godzin, aby śledzić ruchliwość leukocytów i interakcję z umierającymi komórkami.
    UWAGA: Jeśli wykonywane jest długoterminowe obrazowanie na żywo, w kapilarze montowana jest tylko jedna larwa.
  7. Po zakończeniu obrazowania należy wydalić larwy z naczynia włosowatego do śmiertelnego przedawkowania 4% MS222 w celu eutanazji.

5. Dzień 3: Selekcja larw do testu ruchliwości przy 72 hpf

  1. Znieczulić larwy na szalkach Petriego za pomocą 0,02% MS222.
  2. Losowo wybrać n = 24 larwy do testu ruchliwości i przenieść do świeżej pożywki E3 i pozwolić zwierzętom wyzdrowieć po znieczuleniu.
    UWAGA: Znieczulenie w tym momencie usuwa błąd selekcji dla powolnych pływaków, którzy są łatwi do złapania.

6. Dzień 3-5: Testowanie lokomocji przy 72, 96 i 120 hpf

  1. Przenieść larwy wyselekcjonowane w temperaturze 72 hpf do podłoża E3 bez błękitu metylenowego.
    UWAGA: W przypadku oznaczania w dawce 3 dpf larwy powinny mieć wystarczająco dużo czasu na regenerację po znieczuleniu (>1 godzina).
  2. Umieścić jedną larwę w 1 ml na zagłębienie 24-dołkowej płytki za pomocą pipety.
    UWAGA: Odetnij koniec końcówki pipety, aby uniknąć uszkodzenia larw. Rozmiar płyty można zmienić zgodnie z projektem eksperymentalnym.
  3. Załaduj płytki do komory kamery i testuj ruch przez 10 minut, używając rutyny ostrzeżenia białym światłem, aby zwiększyć spontaniczne pływanie.
    UWAGA: Zachowanie podczas pływania było śledzone za pomocą komory kamery i oprogramowania śledzącego (patrz Tabela Materiałów).
  4. Powtórz eksperyment z tymi samymi larwami przy 96 i 120 hpf. Przenieść larwy z osobnego pomieszczenia na płytce do oznaczania na płytkę Petriego i inkubować w temperaturze 28 °C pomiędzy badaniami.
  5. Po zakończeniu testu poddać eutanazji larwy w przypadku śmiertelnego przedawkowania 4% MS222.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena śmierci komórek mózgowych za pomocą transgenicznego ubiq:secAnnexinV-mVenus daje wyraźne ostateczne skupiska umierających komórek u larw ICH+ zarówno w modelach ATV, jak i bbh, które są nieobecne u wszystkich larw ICH- (Ryc. 3). Gromady cofają się przed 96 hpf. Poprzez analizę obrazu, krwawienie wiąże się ze znaczącym dwukrotnym wzrostem całkowitej intensywności sygnału fluorescencyjnego w mózgu, co wskazuje na wyraźną śmierć komórki.

Odpowiedź neurozapalna jest identyfikowana u larw ICH+ dzięki znacznie zwiększonej liczbie komórek makrofagów mpeg1 w mózgu. Liczba całkowitej liczby komórek neutrofilowych mpo dodatnich również wzrosła, jednak nie osiągnęła ona istotności statystycznej (Ryc. 4). Można również zaobserwować, że morfologia makrofagów mpeg1 dodatnich zmienia się u larw ICH+, ponieważ komórki przyjmują aktywny, zaokrąglony, ameboidalny kształt. Te aktywowane zaokrąglone komórki mogą być również monitorowane w czasie, aby wykazać zwiększoną odpowiedź fagocytarną ubiq:secAnnexinV-mVenus wyrażającą umierające komórki w larwach ICH+ (Ryc. 5). Makrofagi MPEG1 dodatnie wykazujące rozgałęzione procesy zostały sklasyfikowane jako nieaktywne.

Krwotok mózgowy wiąże się ze znacznym spadkiem ruchliwości przy 72 i 96 hpf w porównaniu do kontroli rodzeństwa ICH- zarówno w modelach bbh, jak i ATV (Rysunek 6). Ruchliwość przy 120 hpf wraca do poziomu zbliżonego do wyjściowego. Często występują różnice w wyjściowej ruchliwości między lęgami jaj a szczepami, dlatego za każdym razem należy dokonywać porównania z kontrolami ICH.

figure-results-1
Rysunek 3: Krwotok śródmózgowy (ICH) u larw danio pręgowanego powoduje wymierne uszkodzenie mózgu. (A) Reprezentatywne obrazy fenotypu uszkodzenia mózgu u larw ICH+ (prawe panele), w porównaniu do rodzeństwa ICH- (lewe panele), przy 72 hpf. Obrazy w jasnym polu (dolne panele, podziałka = 250 μm) pokazują obecność krwawień mózgowych (strzałek) u larw ICH+. Mikroskopię fluorescencyjną przeprowadzono w celu wizualizacji śmierci komórki w linii reporterowej ubiq:secAnnexinV-mVenus (górne panele, podziałka = 100 μm). Skupiska umierających komórek obserwowano w obszarach okołokrwiakowych. Obrazy zostały przycięte do obszarów tylko mózgu i przeanalizowane pod kątem całkowitej intensywności zielonej fluorescencji w okrągłych cząstkach o średnicy większej niż 30 pikseli (biała linia) przy użyciu makra w pliku uzupełniającym 1. (B) Kwantyfikacja sygnału fluorescencyjnego w mózgach nieleczonych larw ICH i ICH+ uzyskanych za pomocą modelu ATV (n = 12 na grupę; 3 niezależne kontrpróby) przy 72 hpf. Istotne różnice zaobserwowano podczas porównywania ICH+ z nieleczonym (**p = 0,004) i z rodzeństwem ICH- (*p = 0,03). (C) Kwantyfikacja sygnału fluorescencji jako odczyt wiązania aneksyny V w mózgach larw ICH i ICH+ uzyskanych za pomocą modelu bąbelkowego (bbh) (n = 12 na grupę; 2 niezależne kontrpróby) przy 72 hpf. Wykresy pokazują SD od średniej. Zaobserwowano istotną różnicę we fluorescencji mVenus między rodzeństwem ICH+ i ICH- w tym samym wieku (**p = 0,002). Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Krwotok śródmózgowy (ICH) inicjuje wrodzoną komórkową odpowiedź immunologiczną w mózgu larwy danio pręgowanego. Liczba leukocytów określona ilościowo w regionach mózgu wcześniej opisanych dla mpo:GFP; mpeg1:dsCzerwone podwójnie transgeniczne larwy (n = 8 na grupę; 2 niezależne kontrpróby) w 72 hpf ujawniają znaczny wzrost makrofagów (*p = 0,01), ale nie neutrofili (p = 0,5), w odpowiedzi na ICH. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 5: Aktywowane komórki makrofagów wykazują reakcję fagocytarną na uszkodzenie mózgu. (A) Reprezentatywne zdjęcia poklatkowe 20 przedstawiające rozgałęzione patrolujące makrofagi migrujące w kierunku komórki dodatniej aneksyny V (i - vi). Zdjęcia uzyskuje się z serii zdjęć całego mózgu wykonanych przy użyciu obiektywu 20x. Podziałka skali reprezentuje 50 μm. Makrofag uzyskał morfologię ameboidalną (v) przed fagocytozowaniem komórki anekcynyV-dodatniej (vi, vii). Po fagocytozie makrofag wznawia rozgałęzioną morfologię i migruje, a komórki anekcyny V-dodatniej nie można już zobaczyć (viii). Wskazywane są rozgałęzione makrofagi (#), dodatnia komórka aneksyny (strzałka), makrofagi ameboidalne (*). (B) Reprezentatywne obrazy komórek mpeg1-dodatnich w mózgu larw ICH i ICH+ wykazujących morfologię ameboidalną i rozgałęzioną. Paski skali reprezentują 50 μm. (C) W mózgach ICH+ zaobserwowano zwiększony udział ameboidalnych (fagocytarnych) i zmniejszony odsetek rozgałęzionych (nieaktywnych) makrofagów w porównaniu z rodzeństwem ICH. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 6: Uszkodzenie mózgu wywołane przez ICH powoduje wymierny deficyt lokomotoryczny u larw danio pręgowanego. (A) Reprezentatywne przykłady śladów pływania u larw ICH- i ICH+ bbh o sile 72, 96 i 120 hpf. (B) Larwy ICH+ wykazywały znaczne skrócenie skumulowanego czasu spędzonego w ruchu mobilnym podczas 10-minutowego okresu rejestracji zarówno przy 72, jak i 96 hpf. Znaczenie zostało utracone w punkcie czasowym 120 hpf, potencjalnie nawiązującym do powrotu do zdrowia po urazie mózgu (n = 24 larwy w grupie; 3 niezależne powtórzenia; ****p = 0,00006; **p = 0,003; ns: p = 0,08). (C) Kwantyfikacja skumulowanego czasu spędzonego na przemieszczaniu się w larwach ICH i ICH+ nieleczonych i poddanych działaniu ATV przy 120 hpf. Larwy ICH+ wykazały znaczne skrócenie skumulowanego czasu spędzonego w ruchu mobilnym w ciągu 10-minutowego okresu rejestracji. Do obliczenia SD na podstawie średniej wykorzystano trzy kontrpróby techniczne (n = 24 larwy na grupę) (***p = 0,00004, **p = 0,0003). Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to pokazuje, że ICH u larw danio pręgowanego indukuje reakcję na uszkodzenie mózgu, która podsumowuje kluczowe aspekty kondycji ludzkiej, które można systematycznie oznaczać i kwantyfikować. Danio pręgowany oferuje spójny i powtarzalny model spontanicznego ICH, który pomoże w przyszłych badaniach interwencyjnych skoncentrowanych na ukierunkowaniu na uszkodzenie mózgu wywołane krwią, a nie na zapobieganiu pękaniu naczyń krwionośnych17,28. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę szybki charakter początku choroby, zbliżony do sytuacji klinicznej, takie podejście oferuje ekscytujące perspektywy udanego tłumaczenia w przyszłości.

Z wykorzystaniem larw danio pręgowanego wiążą się pewne ograniczenia, takie jak stosowanie systemu rozwijającego się i rangi taksonomicznej, jednak należy wziąć pod uwagę praktyczne i naukowe zalety tego modelu, aby uzyskać nowe informacje na temat ICH. Nie jest wymagana żadna operacja, aby zainicjować krwotok lub monitorować procesy komórkowe przez dłuższy czas po urazie. Wysoka płodność par danio pręgowanego generuje łatwo dostępne i duże rozmiary próbek, a ze względu na szybki rozwój larw czas eksperymentu jest znacznie skrócony w porównaniu z badaniami na gryzoniach29,30.

Obecnie modele te nadają się do wykorzystania do wyjaśnienia natychmiastowej patologicznej i immunologicznej odpowiedzi na spontaniczną ICH w mózgu żywych, nienaruszonych zwierząt. Potencjalnie model ten może zostać zaadaptowany do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w terapiach ICH, zarówno prewencyjnych, jak i wspomagających powrót do zdrowia. W związku z tym patologie po ICH przedstawione w tym badaniu stanowią alternatywną, uzupełniającą platformę dla przedklinicznych badań nad ICH.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr Davidowi Spillerowi i University of Manchester Systems Microscopy Core Facility za korzystanie z urządzenia, Prof. Richardowi Bainesowi za korzystanie z DanioVision oraz Dr. Jackowi Rivers-Auty za konsultacje statystyczne. Linia bbh została uprzejmie udostępniona przez Nicole Munsie z laboratorium dr Sarah Child na Uniwersytecie w Calgary. Dziękujemy również prof. Stephenowi Renshawowi, dr. Adamowi Hurlstone'owi, dr. Andrew Badrockowi i dr Helen Young za żyłki i sprzęt.

To badanie było wspierane przez NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) i The British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Jesteśmy również szczególnie wdzięczni The Natalie Kate Moss Trust oraz Wydziałowi Biologii, Medycyny i Zdrowia Uniwersytetu w Manchesterze za ich nieustające wsparcie finansowe.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytki 24-dołkoweSigma-AldrichCLS3527
28 ° C inkubatorLMS210
AtorwastatynaSigma-AldrichPZ0001-5mg
Pudełka hodowlaneThoren Aquatics systems10011
Komora obserwacyjna DaniovisionNoldusn/a
E3 medium 1x4% Instant Ocean, 500 µ L błękit metylenowy w 1 L dH2O
Oprogramowanie EthoVision XTNolduswersja 11
Blok grzewczyGrant-BioPHMT-PSC18
Natychmiastowy oceanNatychmiastowySS15-10
Mikroskop LightsheetZeissZ.1
Kapilara montażowa mikroskopu LightsheetZeiss402100-9320-000
Niskotopliwa agarozaPromegaV2111
Błękit metylenowySigma-Aldrich319112-100ML
Mikroskop Mikroskop preparacyjnyLeicaMZ95
MikroskopfluorescencyjnyLeicaM165FC
MS2224g trikainy w proszku, 500 ml dH2O, 10 ml 1 M Tris (pH 9). Dostosuj pH do ~7
Pipeta P1000Końcówki
P1000StarlabS1122-1830
PasteurStarlabE1414-0300
Szalki Petriego Corning101VR20
PipetboyIntegra BiosciencesPIPETBOY
Stripette 25mlCorningCLS3527
Trikaina w proszkuSigma-AldrichA5040-25G
Tris BaseFisher BioReagentsBP152-1
Ultra drobne kleszczyki preparacyjneAgar scientificAGT502
OprogramowanieZen Zeissw wersji 2.3
ocean do pipet Gilson F144059M Pipety

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3(2017).
  2. WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  3. Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
  4. Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
  5. Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
  6. ASPA. 1986 amendments. , (2012).
  7. Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
  8. Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
  9. Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
  10. Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
  11. Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
  12. Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
  13. Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388(2014).
  14. Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
  15. Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
  16. Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
  17. Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051(2017).
  18. Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
  19. ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
  20. Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
  21. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  24. Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238(2003).
  25. Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
  26. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  27. Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
  28. Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
  29. Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
  30. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeHemorrhagic StrokeIntracerebral HemorrhageLive ImagingMotility AssayBrain HemorrhageNeuroinflammationFluorescent MicroscopyAtorvastatin TreatmentEthoVision XT

Related Articles