Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59716

⸱

5 czerwca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 2Division of Cardiovascular Sciences, School of Medical Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 3Lydia Becker Institute of Immunology and Inflammation, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).

Streszczenie

Pomimo tego, że jest to najcięższy podtyp udaru o wysokiej śmiertelności globalnej, nie ma specyficznego leczenia dla pacjentów z krwotokiem śródmózgowym (ICH). Przedkliniczne modelowanie ICH okazało się trudne, a obecne modele gryzoni słabo oddają spontaniczną naturę ICH u ludzi. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na alternatywne metodologie przedkliniczne do badania mechanizmów chorobowych w ICH i do potencjalnego odkrywania leków.

Wykorzystanie danio pręgowanego stanowi coraz bardziej popularne podejście do badań translacyjnych, głównie ze względu na szereg zalet, jakie posiadają w stosunku do ssaczych modeli chorób, w tym płodne wskaźniki reprodukcji i przezroczystość larw pozwalającą na obrazowanie na żywo. Inne grupy ustaliły, że larwy danio pręgowanego mogą wykazywać spontaniczne ICH po genetycznym lub chemicznym zakłóceniu rozwoju naczyń mózgowych. Celem tej metodologii jest wykorzystanie takich modeli do badania patologicznych konsekwencji wylewu krwi do mózgu, w kontekście przedklinicznych badań ICH. Korzystając z obrazowania na żywo i testów ruchliwości, można ocenić i określić ilościowo uszkodzenia mózgu, zapalenie nerwów i funkcje lokomotoryczne po ICH.

To badanie pokazuje, że kluczowe patologiczne konsekwencje krwotoku mózgowego u ludzi są zachowane w larwach danio pręgowanego, podkreślając organizm modelowy jako cenny system in vivo do badań przedklinicznych ICH. Celem tej metodologii jest umożliwienie społeczności zajmującej się udarem przedklinicznym zastosowania modelu larwalnego danio pręgowanego jako alternatywnego uzupełniającego systemu modelowego dla gryzoni.

Wprowadzenie

Krwotok śródmózgowy (ICH) jest najpoważniejszym podtypem udaru związanym z samoistnym pęknięciem naczynia mózgowego i krwawieniem do miąższu, prowadzącym do uszkodzenia mózgu, niepełnosprawności fizycznej i często śmierci1. Pomimo wysokiej śmiertelności i zachorowalności związanej z ICH2, nadal brakuje zrozumienia etiologii leżącej u podstaw i patologii po krwotoku. W związku z tym nie ma specyficznych metod leczenia, które zapobiegałyby ICH lub poprawiały wyniki leczenia pacjentów. Większość naszej wiedzy na temat biologii chorób pochodzi z przedklinicznych modeli gryzoni ICH3, jednak dotychczasowe badania nad tymi modelami nie przyniosły żadnego skutecznego zastosowania terapeutycznego w klinice4,5. To niepowodzenie może być częściowo spowodowane pewnymi ograniczeniami tych modeli przedklinicznych, w tym niemożnością łatwego podsumowania spontanicznej natury ludzkiej choroby i wymogiem inwazyjnej chirurgii w celu wygenerowania modeli u ssaków6. Ponadto gryzonie stwarzają praktyczne problemy w zakresie obserwacji szybkiego początku odpowiedzi komórkowej na ICH w nienaruszonej tkance. Biorąc pod uwagę brak translacji z modeli gryzoni, opracowanie alternatywnych modeli spontanicznego ICH jest konieczne, jeśli mamy przezwyciężyć te praktyczne problemy i pomóc w identyfikacji nowych celów leków.

Molekularne mechanizmy rozwoju naczyń krwionośnych są dobrze zachowane wśród kręgowców, w tym danio pręgowanego (Danio rerio)7. W związku z tym przyjęcie tego modelowego organizmu staje się coraz bardziej użyteczną strategią mechanistyczną do badania chorób naczyń mózgowych8. Wygenerowano szereg modeli danio pręgowanego, które podsumowują fenotypy związane ze stanami związanymi z udarem9,10,11,12. Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patogenezy choroby oferuje zarówno praktyczne, jak i naukowe korzyści w porównaniu z modelami ssaków8. Obejmuje to wysokie wskaźniki reprodukcji, szybki rozwój i przezroczystość larw, co pozwala na obrazowanie przyżyciowe bez inwazyjnych ograniczeń związanych z gryzoniami. Połączenie tych zalet z szeroką gamą transgenicznych linii reporterowych dostępnych w społeczności badawczej danio pręgowanego stanowi potężne podejście in vivo do badania biologii chorób, które nie jest jeszcze wykorzystywane do badania patologicznych konsekwencji ICH.

Reakcja na uraz krwi w mózgu jest dwufazowa13; Pierwotna zniewaga powoduje śmierć neuronów i martwicę komórek, która następnie inicjuje wtórną falę uszkodzeń, które są indukowane przez wrodzoną aktywację immunologiczną. Druga faza uszkodzenia mózgu, w szczególności komponent neurozapalny, jest uważana za realistyczny cel dla przyszłego leczenia farmakologicznego13. Spontaniczne i specyficzne dla mózgu krwotoki zostały wcześniej opisane u larw danio pręgowanego14,15,16,17,18,19. Dwa takie modele to zastosowanie atorwastatyny (ATV) w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) w celu zahamowania szlaku HMGCR i biosyntezy cholesterolu14 oraz mutant bubblehead (bbh), który wyraża hipomorficzną mutację w genie arhgef7, βpix, a następnie hamuje przebudowę aktyny dla ścisłych połączeń wewnątrznaczyniowych18. Modele te wykazują spontaniczne pęknięcie naczyń krwionośnych specyficzne dla mózgu na początku krążenia (~33 hpf). Ostatnio scharakteryzowaliśmy te modele, aby ujawnić, że kluczowe aspekty reakcji na uszkodzenie mózgu są zachowane między ludźmi a larwami danio pręgowanego20. Badanie to demonstruje metodologię wymaganą do uzyskania i wizualizacji spontanicznych krwotoków mózgowych u larw danio pręgowanego oraz sposobu ilościowego określenia uszkodzenia mózgu oraz fenotypów lokomotorycznych i neurozapalnych, które odnoszą się do stanu ludzkiego. Te dane i techniki przemawiają za wykorzystaniem tego gatunku modelowego jako cennego systemu uzupełniającego dla przedklinicznych badań ICH.

Protokół

Rybki danio zostały wyhodowane i utrzymywane w jednostce usług biologicznych Uniwersytetu w Manchesterze (The University of Manchester Biological Services Unit) w standardowych warunkach, zgodnie z wcześniejszym opisem21. Zasady hodowli dorosłych rybek danio zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Manchesterze (University of Manchester Animal Welfare and Ethical Review Board). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (U.K. Home Office) (PPL:P132EB6D7).

UWAGA: Linie transgeniczne wykorzystane w niniejszym badaniu obejmują linie specyficzne dla linii makrofagów mpeg1:mCherry (skonstruowany wewnętrznie zgodnie z wcześniejszym opisem22), specyficzny dla neutrofili mpo:GFP23,erytroidowo-specyficzny gata1:dsRed24 i ubiq:secAnnexinV-mVenus, reporter śmierci komórkowej (wyprodukowany wewnętrznie)25)u typu dzikiego, nacre (mitfaw2/w2) or mutant (bbhm292tła. Rycina 1 przedstawia harmonogram eksperymentu.

Schemat osi czasu rozwoju; ATV w porównaniu z bbh, stadia i reakcje neurozapalne u danio pręgowanego.
Rycina 1: Schemat osi czasu eksperymentu w celu scharakteryzowania uszkodzeń mózgu oraz wyników w zakresie funkcji lokomocyjnych i odpowiedzi neurozapalnej.ICH, krwotok wewnątrzczaszkowy; bbh, bubblehead. Rycina została powielona z pracy Crilly et al.20 za zgodą na podstawie licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Dzień 0: Produkcja i zbiór jaj

  1. Zebra zebrać zapłodnione embriony z naturalnego tarła w inkubatorach, pochodzące od 1 samca i 1-2 samic dorosłych danio prążkowanych.
    UWAGA: W przypadku protokołu z atorwastatyną można użyć dowolnych zwierząt typu dzikiego lub transgenicznych, jednak wskaźniki krwawień różnią się nieco w zależności od szczepu.
  2. Inkubować 100 embrionów na jedną szalkę Petriego w standardowym medium E3 dla embrionów w temperaturze 28 °C i określić stadium rozwoju zgodnie ze standardowymi wytycznymi26.
  3. Około 6 godzin po zapłodnieniu (hpf) usunąć z szalki martwe i niezapłodnione embriony za pomocą pipety Pasteura.

2. Dzień 1: Leczenie atorwastatyną w 24 hpf

  1. Usunąć choriony z embrionów przeznaczonych do traktowania atorwastatyną, używając ostrych, ultrawąskich pęsety do mikrodissekcji27. Liczbę embrionów niezbędną do eksperymentu można dostosować odpowiednio.
  2. Dodać 30 mL pożywki dla embrionów E3 do dwóch czystych szalek Petriego. Jedną szalkę należy wykorzystać dla 100 embrionów.
    UWAGA: Jeśli szalki są przeznaczone do hodowli komórkowej, odchorionione rybki danio pręgowane na tym wczesnym etapie często przywierają do dna. Aby tego uniknąć, należy dokładnie wypłukać szalki w czystej wodzie przed użyciem.
  3. Odać 60 µL wody z embrionami z szalki do traktowania i dodać 60 µL 0,5 mM atorwastatyny (ATV). Przy stężeniu roztworu stokowego 0,5 mM powyższe rozcieńczenie spowoduje uzyskanie stężenia końcowego 1 µM, co zaowocuje tym, że ok. 20% larw nie będzie miało krwawień (ICH-) i ok. 80% larw będzie miało krwawienia (ICH+). Drugą szalkę wykorzystać dla kontroli nietraktowanych
    UWAGA: Atorwastatynę rozpuszcza się w wodzie destylowanej (3 mg w 10 mL), aby przygotować roztwór stokowy 0,5 mM. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, w ciemności, przy mieszaniu, ponieważ rozpuszczanie zajmuje pewien czas. Pełne rozpuszczenie może trwać do 1 tygodnia. Nie stosować DMSO. Roztwór należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C. Nie zamrażać i rozmrażać wielokrotnie.
  4. Za pomocą pipety Pasteura przenieść 100 embrionów w jak najmniejszej ilości wody do szalek do traktowania.
  5. Inkubować szalki w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: ICH występuje między 33 a 48 hpf. Atorwastatyny nie trzeba usuwać, ponieważ inkubacja dłuższa niż 24 h nie powoduje dalszych problemów rozwojowych.

3. Dzień 2: Rozdzielenie populacji ICH- i ICH+ w 50 hpf

  1. Oddziel ryby ICH+ od populacji ICH- i przenieś je do nowych naczyń dla większej wygody.
    1. W przypadku zastosowania modelu ATV w stężeniu 1 µM, w tym punkcie czasowym krwotok (ICH+) wystąpi u 75-100% larw.
      UWAGA: Reakcja larw różni się w zależności od szczepu; jeśli krwotoki nie występują z pożądaną częstotliwością, należy użyć nowej partii atorwastatyny lub wyższego stężenia. Jeśli u larw nie wystąpił krwotok do 48 hpf, należy uznać je za ICH-.
    2. W przypadku zastosowania modelu bbh, u wszystkich mutantów homozygotycznych krwotok wystąpi do 48 hpf. W przypadku krzyżowania wewnątrz heterozygot, rodzeństwo heterozygotyczne i typu dzikiego (ICH-) może służyć jako zwierzęta kontrolne w eksperymentach.
  2. W razie potrzeby znieczul larwy, dodając 0.02% MS222 do pożywki E3. Używając pipety Pasteura, posegreguj larwy pod kątem obecności krwi w głowie i przenieś je do świeżej pożywki E3. Patrz Rysunek 2.
    UWAGA: Krew w głowie może pojawić się w przednim, środkowym lub tylnym mózgu, bądź w kombinacji tych obszarów, a objętość krwawienia może się różnić między osobnikami. U mutantów bbh ICH często wiąże się z ciężkim obrzękiem, rozpoznawalnym po większych głowach, szerszej przestrzeni między oczami i bardziej rozlanym krwawieniu. Jednak nie wszystkie larwy bbh ICH+ wykazują obrzęk.

Obrazy mikroskopowe danio pręgowanego; ICH- vs ICH+; fluorescencja podkreśla krwawienie wewnętrzne; analiza badawcza.
Rysunek 2: Fenotypy krwotoku mózgowego ICH+. Przykłady fenotypów ICH u larw utrzymywanych na linii transgenicznej raportującej gata1:DsRed w tle nacre, obserwowane za pomocą stereomikroskopu w świetle przechodzącym (panele górne) i fluorescencji (panel dolny) około 48 h po zapłodnieniu. W larwach ICH- nie zaobserwowano krwotoków (panele lewe). W larwach ICH+ zaobserwowano wyraźne nagromadzenie erytrocytów w przedmózgowiu i rąbmózgowiu (strzałki) (panele prawe). Paski skali reprezentują 250 µm. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Dzień 3: Analiza śmierci komórek i leukocytów w 72 hpf

  1. Przesiewaj larwy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że białko fluorescencyjne ulega ekspresji.
    UWAGA: W niniejszym badaniu do raportowania śmierci komórek mózgu wykorzystano larwy transgeniczne ubiq:secAnnexinV-mVenus, a do analizy leukocytów larwy podwójnie transgeniczne mpo:GFP;mpeg1:mCherry lub ubiq:secAnnexinV-mVenus;mpeg1:mCherry.
  2. Wypełnij komorę montażową mikroskopu arkuszowego (lightsheet) pożywką E3 zawierającą 0,02% MS222.
  3. Zanurz larwy w 0,02% MS222 w celu znieczulenia. Przenieś larwy do montażu (n = 1-6) na suchą powierzchnię szalki Petriego w jednej kropli. Usuń jak największą ilość cieczy.
    UWAGA: 1,5% agarozę o niskiej temperaturze topnienia przygotowuje się, rozpuszczając 0,15 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 mL pożywki E3 bez błękitu metylenowego w kuchence mikrofalowej i utrzymując w temperaturze 45 °C do momentu użycia.
  4. Dodaj kroplę 1,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (utrzymywanej w stanie ciekłym w bloku grzewczym o temperaturze 45 °C) do larw i za pomocą kapilary montażowej 800 µm wciągnij larwy najpierw głową. Jeśli pozycjonowanie nie jest dokładne, larwy można usunąć z agarozy i zamontować ponownie. Pozostaw kapilarę do ostygnięcia przed włożeniem jej do komory lightsheet.
    UWAGA: Alternatywnie do tej procedury można użyć mikroskopu konfokalnego. W tym przypadku larwy należy zamontować bocznie w agarozie na szalku z szklanym dnem.
  5. Nabyj obrazy z serii z-stack głowy w obszarze między soczewkami ocznymi (~300 µm) i przetwórz je do obrazu maksymalnej projekcji intensywności (maximum intensity projection).
    1. Przeanalizuj region mózgu na podstawie zebranych obrazów w celu określenia całkowitej liczby komórek fluorescencyjnych oraz całkowitej intensywności fluorescencji20.
  6. Utwórz wideo time-lapse z wielu złożonych projekcji w czasie 18-24 h, aby śledzić mobilność leukocytów i ich interakcję z obumierającymi komórkami.
    UWAGA: W przypadku długoterminowego obrazowania na żywo w kapilarze montuje się tylko jedną larwę.
  7. Po zakończeniu obrazowania usuń larwy z kapilary montażowej do letalnej dawki 4% MS222 w celu eutanazji.

5. Dzień 3: Wybór larw do testu motoryczności w 72 hpf

  1. Zanurz larwy w szalkach Petriego w 0,02% MS222 w celu znieczulenia.
  2. Losowo wybierz n = 24 larwy do badania ruchliwości, przenieś je do świeżego medium E3 i odczekaj, aż zwierzęta wybudzą się z narkozy.
    UWAGA: Zastosowanie środka znieczulającego na tym etapie eliminuje błąd selekcji polegający na wybieraniu wolno pływających osobników, które są łatwiejsze do złapania.

6. Dzień 3-5: Ocena lokomocji w 72, 96 i 120 hpf

  1. Przenieść larwy wyselekcjonowane w 72 hpf do medium E3 bez błękitu metylenowego.
    UWAGA: W przypadku przeprowadzania analizy w 3 dpf należy dać larwom wystarczająco dużo czasu na wybudzenie z narkozy (>1 h).
  2. Za pomocą pipety umieścić jedną larwę w 1 mL medium w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
    UWAGA: Odciąć końcówkę tipa do pipety, aby uniknąć uszkodzenia larw. Rozmiar płytki można zmienić zgodnie z planem eksperymentalnym.
  3. Włożyć płytki do komory kamery i analizować ruch przez 10 min, stosując rutynę pobudzenia światłem białym w celu zwiększenia spontanicznego pływania.
    UWAGA: Zachowania pływackie śledzono za pomocą komory kamery i oprogramowania do trackingu (patrz Tabela materiałów).
  4. Powtórzyć eksperyment z tymi samymi larwami w 96 i 120 hpf. Pomiędzy analizami przenieść larwy z indywidualnych dołków w płytce analitycznej do szalki Petriego i inkubować w 28 °C.
  5. Po zakończeniu analizy poddać larwy eutanazji poprzez podanie śmiertelnej dawki 4% MS222.

Wyniki

Ocena śmierci komórek mózgu przy użyciu transgenicznych ubiq:secAnnexinV-mVenus wykazuje wyraźne, zdefiniowane skupiska obumierających komórek w larwach ICH+ w obu modelach (ATV i bbh), które nie występują we wszystkich larwach ICH- (Rysunek 3). Skupiska te zanikają przed 96 hpf. Analiza obrazu wykazała, że krwawienie wiąże się ze znacznym, dwukrotnym wzrostem całkowitej intensywności sygnału fluorescencji w mózgu, co wskazuje na wyraźną śmierć komórek.

Odpowiedź neurozapalną u larw ICH+ zidentyfikowano na podstawie istotnie zwiększonej liczby makrofagów wykazujących ekspresję mpeg1 w mózgu. Liczba wszystkich neutrofili wykazujących ekspresję mpo również wzrosła, jednak nie osiągnęło to poziomu istotności statystycznej (Rycina 4). W larwach ICH+ widoczna jest również zmiana morfologii makrofagów mpeg1+, których komórki przyjmują aktywny, zaokrąglony, ameboidalny kształt. Te aktywowane, zaokrąglone komórki można monitorować w czasie, aby wykazać zwiększoną odpowiedź fagocytarną wobec obumierających komórek wykazujących ekspresję ubiq:secAnnexinV-mVenus w larwach ICH+ (Rycina 5). Makrofagi mpeg1+ wykazujące rozgałęzione wypustki sklasyfikowano jako nieaktywne.

Krwotok do mózgu wiąże się ze znacznym spadkiem ruchliwości w 72. i 96. godzinie po zapłodnieniu (hpf) w porównaniu z kontrolnymi rodzeństwem bez ICH w obu modelach bbh i ATV (Rycina 6). Ruchliwość w 120. hpf powraca do poziomów bliskich wartościom wyjściowym. Często występują różnice w ruchliwości wyjściowej między poszczególnymi partiami ikry a szczepami, dlatego porównanie z kontrolą bez ICH powinno być przeprowadzane za każdym razem.

Mikroskopia fluorescencyjna i wykres słupkowy przedstawiające wpływ ICH na intensywność YFP w mózgu danio pręgowanego.
Rysunek 3: Krwotok wewnątrzczaszkowy (ICH) u larw danio pręgowanego prowadzi do mierzalnego uszkodzenia mózgu. (A) Reprezentatywne obrazy fenotypu uszkodzenia mózgu u larw ICH+ (panele po prawej) w porównaniu do rodzeństwa ICH- (panele po lewej) w 72 hpf. Obrazy w polu jasnym (panele dolne, pasek skali = 250 µm) wykazują obecność krwawień w mózgu (strzałki) u larw ICH+. Wykonano mikroskopię fluorescencyjną w celu wizualizacji śmierci komórek w linii reporterowej ubiq:secAnnexinV-mVenus (panele górne, pasek skali = 100 µm). W obszarach okołohematomalnych zaobserwowano skupiska obumierających komórek. Obrazy przycięto do samych obszarów mózgu i przeanalizowano całkowitą intensywność zielonej fluorescencji w okrągłych cząsteczkach o średnicy większej niż 30 pikseli (biała linia) przy użyciu makra w Pliku uzupełniającym 1. (B) Kwantyfikacja sygnału fluorescencji w mózgach larw nieleczonych, ICH- oraz ICH+ uzyskanych za pomocą modelu ATV (n = 12 na grupę; 3 niezależne powtórzenia) w 72 hpf. Istotne różnice zaobserwowano podczas porównania grupy ICH+ z nieleczoną (**p = 0.004) oraz z rodzeństwem ICH- (*p = 0.03). (C) Kwantyfikacja sygnału fluorescencji jako wskaźnika wiązania annexinV w mózgach larw ICH- i ICH+ uzyskanych za pomocą modelu bubblehead (bbh) (n = 12 na grupę; 2 niezależne powtórzenia) w 72 hpf. Wykresy przedstawiają SD ze średniej. Istotną różnicę w fluorescencji mVenus zaobserwowano między rodzeństwem ICH+ i ICH- w tym samym wieku (**p = 0.002). Rysunek został powielony z pracy Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Liczba neutrofili i makrofagów; porównanie na wykresie słupkowym; analiza w warunkach ICH.
Rycina 4: Krwotok wewnątrzczaszkowy (ICH) inicjuje wrodzoną odpowiedź odpornościową komórkową w mózgu larwy danio pręgowanego. Liczba leukocytów zmierzona w wcześniej opisanych obszarach mózgu u larw podwójnie transgenicznych mpo:GFP;mpeg1:dsRed (n = 8 na grupę; 2 niezależne powtórzenia) w 72 hpf wykazuje istotny wzrost liczby makrofagów (*p = 0.01), ale nie neutrofili (p = 0.5), w odpowiedzi na ICH. Rycina została powielona z pracy Crilly et al.20 za zgodą na licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, zmiany morfologii komórek, ICH-, ICH+, analiza wykresu słupkowego, wyniki eksperymentu.
Rysunek 5: Aktywowane makrofagi wykazują odpowiedź fagocytarną na uszkodzenie mózgu. (A) Reprezentatywne klatki z nagrania time-lapse20 przedstawiające rozgałęziony makrofag patrolujący migrujący w stronę komórki dodatniej pod względem annexinV (i - vi). Klatki zostały uzyskane z serii obrazów całego mózgu wykonanych przy użyciu obiektywu 20x. Pasek skali reprezentuje 50 µm. Makrofag przyjął morfologię ameboidalną (v) przed fagocytozą komórki dodatniej pod względem annexinV (vi, vii). Po fagocytozie makrofag powraca do morfologii rozgałęzionej i migruje dalej, a komórka dodatnia pod względem annexinV nie jest już widoczna (viii). Oznaczono makrofag rozgałęziony (#), komórkę dodatnią pod względem annexinV (strzałka) oraz makrofag ameboidalny (*). (B) Reprezentatywne obrazy komórek dodatnich pod względem mpeg1 w mózgach larwalnych ICH- i ICH+ wykazujące morfologie ameboidalną i rozgałęzioną. Paski skali reprezentują 50 µm. (C) W mózgach ICH+ zaobserwowano zwiększony udział makrofagów ameboidalnych (fagocytujących) i zmniejszony udział makrofagów rozgałęzionych (nieaktywnych) w porównaniu z rodzeństwem ICH-. Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na podstawie licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza behawioralna, schematy śledzenia mobilności oraz wykresy statystyczne podkreślające ruch danio pręgowanych.
Rysunek 6: Uraz mózgu wywołany ICH skutkuje mierzalnym deficytem lokomocyjnym u larw danio pręgowanych. (A) Reprezentatywne przykłady torów pływania w larwach ICH- oraz ICH+ bbh w 72, 96 i 120 hpf. (B) Larwy ICH+ wykazały istotny spadek skumulowanego czasu spędzonego w ruchu podczas 10 min okresu rejestracji zarówno w 72, jak i 96 hpf. Istotność zanikła w punkcie czasowym 120 hpf, co może wskazywać na powrót do sprawności po urazie mózgu (n = 24 larwy na grupę; 3 niezależne powtórzenia; ****p = 0.00006; **p = 0.003; ns: p = 0.08). (C) Ilościowe oznaczenie skumulowanego czasu spędzonego w ruchu u nieleczonych i leczonych ATV larw ICH- oraz ICH+ w 120 hpf. Larwy ICH+ wykazały istotny spadek skumulowanego czasu spędzonego w ruchu podczas 10 min okresu rejestracji. Trzy powtórzenia techniczne (n = 24 larwy na grupę) zostały wykorzystane do obliczenia SD ze średniej (***p = 0.00004, **p = 0.0003). Rysunek został powielony z Crilly et al.20 za zgodą na podstawie licencji Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Badanie to pokazuje, że ICH u larw danio pręgowanego indukuje reakcję na uszkodzenie mózgu, która podsumowuje kluczowe aspekty kondycji ludzkiej, które można systematycznie oznaczać i kwantyfikować. Danio pręgowany oferuje spójny i powtarzalny model spontanicznego ICH, który pomoże w przyszłych badaniach interwencyjnych skoncentrowanych na ukierunkowaniu na uszkodzenie mózgu wywołane krwią, a nie na zapobieganiu pękaniu naczyń krwionośnych17,28. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę szybki charakter początku choroby, zbliżony do sytuacji klinicznej, takie podejście oferuje ekscytujące perspektywy udanego tłumaczenia w przyszłości.

Z wykorzystaniem larw danio pręgowanego wiążą się pewne ograniczenia, takie jak stosowanie systemu rozwijającego się i rangi taksonomicznej, jednak należy wziąć pod uwagę praktyczne i naukowe zalety tego modelu, aby uzyskać nowe informacje na temat ICH. Nie jest wymagana żadna operacja, aby zainicjować krwotok lub monitorować procesy komórkowe przez dłuższy czas po urazie. Wysoka płodność par danio pręgowanego generuje łatwo dostępne i duże rozmiary próbek, a ze względu na szybki rozwój larw czas eksperymentu jest znacznie skrócony w porównaniu z badaniami na gryzoniach29,30.

Obecnie modele te nadają się do wykorzystania do wyjaśnienia natychmiastowej patologicznej i immunologicznej odpowiedzi na spontaniczną ICH w mózgu żywych, nienaruszonych zwierząt. Potencjalnie model ten może zostać zaadaptowany do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w terapiach ICH, zarówno prewencyjnych, jak i wspomagających powrót do zdrowia. W związku z tym patologie po ICH przedstawione w tym badaniu stanowią alternatywną, uzupełniającą platformę dla przedklinicznych badań nad ICH.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr Davidowi Spillerowi i University of Manchester Systems Microscopy Core Facility za korzystanie z urządzenia, Prof. Richardowi Bainesowi za korzystanie z DanioVision oraz Dr. Jackowi Rivers-Auty za konsultacje statystyczne. Linia bbh została uprzejmie udostępniona przez Nicole Munsie z laboratorium dr Sarah Child na Uniwersytecie w Calgary. Dziękujemy również prof. Stephenowi Renshawowi, dr. Adamowi Hurlstone'owi, dr. Andrew Badrockowi i dr Helen Young za żyłki i sprzęt.

To badanie było wspierane przez NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) i The British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Jesteśmy również szczególnie wdzięczni The Natalie Kate Moss Trust oraz Wydziałowi Biologii, Medycyny i Zdrowia Uniwersytetu w Manchesterze za ich nieustające wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweSigma-AldrichCLS3527
28 ° C inkubatorLMS210
AtorwastatynaSigma-AldrichPZ0001-5mg
Pudełka hodowlaneThoren Aquatics systems10011
Komora obserwacyjna DaniovisionNoldusn/a
E3 medium 1x4% Instant Ocean, 500 µ L błękit metylenowy w 1 L dH2O
Oprogramowanie EthoVision XTNolduswersja 11
Blok grzewczyGrant-BioPHMT-PSC18
Natychmiastowy oceanNatychmiastowySS15-10
Mikroskop LightsheetZeissZ.1
Kapilara montażowa mikroskopu LightsheetZeiss402100-9320-000
Niskotopliwa agarozaPromegaV2111
Błękit metylenowySigma-Aldrich319112-100ML
Mikroskop Mikroskop preparacyjnyLeicaMZ95
MikroskopfluorescencyjnyLeicaM165FC
MS2224g trikainy w proszku, 500 ml dH2O, 10 ml 1 M Tris (pH 9). Dostosuj pH do ~7
Pipeta P1000Końcówki
P1000StarlabS1122-1830
PasteurStarlabE1414-0300
Szalki Petriego Corning101VR20
PipetboyIntegra BiosciencesPIPETBOY
Stripette 25mlCorningCLS3527
Trikaina w proszkuSigma-AldrichA5040-25G
Tris BaseFisher BioReagentsBP152-1
Ultra drobne kleszczyki preparacyjneAgar scientificAGT502
OprogramowanieZen Zeissw wersji 2.3
ocean do pipet Gilson F144059M Pipety

Bibliografia

  1. An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3(2017).
  2. WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  3. Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
  4. Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
  5. Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
  6. ASPA. 1986 amendments. , (2012).
  7. Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
  8. Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
  9. Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
  10. Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
  11. Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
  12. Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
  13. Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388(2014).
  14. Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
  15. Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
  16. Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
  17. Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051(2017).
  18. Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
  19. ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
  20. Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
  21. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  24. Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238(2003).
  25. Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
  26. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  27. Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
  28. Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
  29. Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
  30. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krwotok wewn trzczaszkowyobrazowanie na ywotest motorykikrwotok m zgowyneuroinflamacjamikroskopia fluorescencyjnaleczenie atorwastatynEthoVision XT
Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.