Artykuł metodologiczny

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59722

⸱

6 lipca 2019

 ,  , 
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX), Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Streszczenie

Makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX) jest najważniejszą metodą uzyskiwania trójwymiarowej wiedzy o makrocząsteczkach biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Warunkiem wstępnym zastosowania tej metody jest wyhodowanie wysoce uporządkowanej próbki krystalicznej z badanej makrocząsteczki, która następnie musi zostać przygotowana do eksperymentu dyfrakcyjnego. Ta procedura przygotowania zazwyczaj polega na usunięciu kryształu z roztworu, w którym był hodowany, namoczeniu kryształu w roztworze liganda lub roztworze krioprotektantu, a następnie unieruchomieniu kryształu na mocowaniu odpowiednim do eksperymentu. Poważnym problemem dla tej procedury jest to, że kryształy wielkocząsteczkowe są często niestabilne mechanicznie i dość kruche. W związku z tym obchodzenie się z tak delikatnymi kryształami może łatwo stać się wąskim gardłem w próbie określenia struktury. Każda siła mechaniczna przyłożona do tak delikatnych kryształów może zaburzyć regularne upakowanie cząsteczek i może prowadzić do utraty zdolności dyfrakcyjnej kryształów. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski uchwyt na próbki typu "wszystko w jednym", który został opracowany w celu zminimalizowania etapów obsługi kryształów, a tym samym maksymalizacji wskaźnika sukcesu eksperymentu z określaniem struktury. Uchwyt na próbkę wspomaga ustawianie kropli kryształów, zastępując powszechnie używane szkiełka nakrywkowe mikroskopu. Co więcej, umożliwia manipulację kryształami na miejscu, taką jak namaczanie ligandów, krioochrona i tworzenie kompleksów bez otwierania wnęki krystalizacyjnej i bez obsługi kryształów. Wreszcie, uchwyt na próbkę został zaprojektowany w celu umożliwienia zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej. Dzięki zastosowaniu tego uchwytu na próbki, szanse na uszkodzenie kryształu w drodze od krystalizacji do zbierania danych dyfrakcyjnych są znacznie zmniejszone, ponieważ nie jest już wymagana bezpośrednia obsługa kryształów.

Wprowadzenie

Wiedza o trójwymiarowej strukturze makromolekuł biologicznych stanowi ważny kamień węgielny we wszystkich podstawowych badaniach biologicznych, biochemicznych i biomedycznych. Dotyczy to nawet niektórych aspektów translacyjnych takich badań, takich jak na przykład odkrywanie leków. Spośród wszystkich metod uzyskiwania takich trójwymiarowych informacji w rozdzielczości atomowej, krystalografia rentgenowska jest najpotężniejszą i najbardziej znaczącą, o czym świadczy fakt, że 90% wszystkich dostępnych informacji strukturalnych pochodzi z krystalografii rentgenowskiej1. Głównym warunkiem krystalografii rentgenowskiej, który jest jednocześnie jej głównym ograniczeniem, jest to, że kryształy o jakości dyfrakcyjnej muszą zostać wyprodukowane i przygotowane do eksperymentu dyfrakcyjnego. Ten etap nadal stanowi jedno z głównych wąskich gardeł metody.

Historycznie, dane dyfrakcyjne z kryształów białkowych były zbierane w temperaturze otoczenia. Poszczególne kryształy zostały ostrożnie przeniesione do kapilar szklanych lub kwarcowych przed zebraniem danych, ług macierzysty został dodany do kapilarn, aby kryształy nie wyschły, a kapilary zostały uszczelnione2,3,4. Od lat osiemdziesiątych XX wieku stawało się coraz bardziej oczywiste, że ze względu na jonizujące właściwości promieniowania rentgenowskiego i zbliżającą się wrażliwość kryształów wielkocząsteczkowych na promieniowanie, gromadzenie danych w temperaturze otoczenia stanowi poważne ograniczenia dla tej metody. W związku z tym opracowano metody łagodzenia skutków uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem poprzez chłodzenie kryształów wielkocząsteczkowych do temperatury 100 K i zbierania danych dyfrakcyjnych w tak niskiej temperaturze5,6. W przypadku pracy w niskich temperaturach mocowanie próbek w kapilarnach stało się niepraktyczne ze względu na niską szybkość wymiany ciepła. Pomimo tego, trwają wysiłki, aby wykorzystać również kapilary, w szczególności z eksperymentów z krystalizacją przeciwdyfuzyjną, do prac dyfrakcyjnych w niskich temperaturach7,8, ale niezależnie od tego, standardowym podejściem w krystalografii makromolekularnej stało się montowanie kryształów makromolekularnych utrzymywanych przez cienką warstwę ługu macierzystego w cienkiej pętli przewodowej9,10. Mimo że z biegiem czasu wprowadzono szereg ulepszeń (np. wprowadzenie pętli litograficznych i podobnych struktur11) do tego montażu opartego na pętli, podstawowe zasady, które zostały opracowane na początku lat 90., są nadal w użyciu. Można śmiało stwierdzić, że większość zbiorów danych dyfrakcyjnych dotyczących kryształów makromolekularnych nadal opiera się na tym podejściu5.

Z biegiem czasu pojawiło się kilka interesujących nowych rozwiązań i modyfikacji metody montażu opartej na pętli, ale te podejścia do tej pory nie zostały powszechnie przyjęte w społeczności. Jednym z nich jest tak zwane bezpętlowe montowanie kryształów, które zostało opracowane w celu uzyskania mniejszego rozpraszania tła12,13,14. Kolejnym jest zastosowanie osłonek grafenowych do owijania próbek krystalicznych i zabezpieczania ich przed wysychaniem. Grafen jest materiałem dobrze nadającym się pod tym względem ze względu na bardzo niskie tło rozpraszające promieniowanie rentgenowskie15.

Ostatnio, rozwój w dziedzinie mocowań próbek skupiał się głównie na standaryzacji mocowań w celu zwiększenia przepustowości próbek16 lub na projektowaniu mocowań, które mogą pomieścić więcej niż jedną próbkę17, jak na przykład wzorzyste membrany na ramie krzemowej, które są w stanie pomieścić setki małych kryształów, głównie w dziedzinie krystalografii szeregowej18,19,20,21,22.

Wszystkie omówione do tej pory metody montażu próbki nadal wymagają pewnego stopnia ręcznej interwencji, co oznacza, że istnieje nieodłączne niebezpieczeństwo spowodowania mechanicznego uszkodzenia próbki. W związku z tym poszukuje się nowych podejść do inżynierii środowiska próbki w taki sposób, aby dane dyfrakcyjne kryształów mogły być zbierane w ich środowisku wzrostu. Jedna z takich metod jest określana jako in situ lub plate-screening23,24 i jest już zaimplementowana na wielu liniach badawczych krystalografii makromolekularnej w różnych źródłach synchrotronowych na całym świecie25. Zastosowanie tej metody jest jednak ograniczone parametrami geometrycznymi płytki krystalicznej oraz przestrzenią dostępną wokół punktu próbkowania przyrządu.

Jeszcze inne podejście jest realizowane w tak zwanym systemie CrystalDirect26. Tutaj całe krople krystalizacji są zbierane automatycznie. Folie, na których wyhodowano kryształy, są wycinane na zamówienie za pomocą lasera i bezpośrednio używane jako uchwyt na próbkę27.

W opisanej tutaj pracy, celem było opracowanie uchwytu na próbkę, który pozwoliłby użytkownikowi przenieść krystaliczną próbkę z komory wzrostu do urządzenia do zbierania danych bez dotykania jej i który pozwoliłby użytkownikowi łatwo manipulować próbką. Ponieważ wielu badaczy w dziedzinie krystalografii makromolekularnej nadal używa formatu 24-dołkowej krystalizacji do optymalizacji wzrostu kryształów poprzez modyfikację warunków zidentyfikowanych w dużych kampaniach przesiewowych, nowy uchwyt na próbki został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z tym formatem. W dalszej części opisana zostanie konstrukcja nowego uchwytu na próbkę oraz zademonstrowana zostanie obsługa i wydajność uchwytu próbki do zbierania danych in situ i namaczania ligandów. Na koniec omówiona zostanie przydatność tego nowego uchwytu na próbki, a także jego ograniczenia dla różnych etapów pracy.

Protokół

UWAGA: Dla wszystkich późniejszych prac, bardzo ważne jest, aby żółta folia poliimidowa nie była dotykana niezabezpieczonymi palcami, ze względu na możliwe zanieczyszczenie uchwytu próbki. Zaleca się również stosowanie chronionych kleszczy.

1. Posiadacz próbki

  1. Użyj jednego z trzech typów uchwytu na próbki.
    UWAGA: Trzy różne wersje nowo opracowanego uchwytu na próbki są pokazane w Rysunek 1. Wszystkie zawierają czarną plastikową konstrukcję nośną, hermetyczną folię COC na zewnątrz i mikroporowatą strukturalną folię poliimidową od wewnątrz. Typ 1 (Rysunek 1A) zawiera stały zewnętrzny pierścień z tworzywa sztucznego, podczas gdy dla typów 2 i 3 (Rysunek 1B,1C) zewnętrzny pierścień może być odłamywany mechanicznie w wyznaczonych odpowiednich punktach przerwania do stosowania w automatycznych systemach przenoszenia próbek (patrz czerwone strzałki w Rysunek 1B)). Konstrukcja uchwytów na próbki pozwala na ustawienie wielu kropli krystalizacji na żółtej folii poliimidowej. Nie wpływa to negatywnie na monitorowanie eksperymentu z krystalizacją, ponieważ materiał jest wysoce przezroczysty dla światła widzialnego. Folia poliimidowa o grubości 21 μm ma również pory 5 μm, co umożliwia prostą manipulację kryształami poprzez późniejsze nasączanie. Ponieważ transmisja promieniowania rentgenowskiego jest bliska 1,0 we wszystkich powszechnie stosowanych energiach zbierania danych dyfrakcyjnych w krystalografii makromolekularnej, udział folii w rozpraszaniu tła w eksperymencie dyfrakcyjnym jest znikomy28.

2. Ustawianie kropli krystalizacji

  1. Stwórz czystą i wolną od kurzu powierzchnię za pomocą adamp niestrzępiąca się szmatka. Wyjmij jeden uchwyt na próbkę z pudełka i delikatnie umieść go żółtą folią skierowaną do góry na czyszczonej powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia lub niepożądanego przebicia tylnej folii COC.
  2. Krople krystalizacyjne o maksymalnej zalecanej objętości 2 μl należy ustawić na żółtej folii, tak jak miałoby to miejsce na powszechnie stosowanych szkiełkach podstawowych. Krople należy rozmieszczać delikatnie, aby uniknąć pęknięcia lub przebicia folii za pomocą pipety. Na uchwycie próbki typu 1 (Rysunek 2A) można umieścić do trzech kropli, podczas gdy na uchwytach próbek typu 2 i 3 zalecane maksimum to dwie krople (Rysunek 2C).
  3. Odwróć uchwyt na próbkę i umieść go we wstępnie nasmarowanej wnęce 24-dołkowej płytki typu Linbro. Użyj pomocy pozycjonujących (patrz czerwone strzałki w Rysunek 1A) uchwytu na próbkę, aby poprowadzić go do optymalnej pozycji.
  4. Upewnij się, że uchwyt na próbkę jest prawidłowo ustawiony, aby uniknąć niepożądanego parowania (Rysunek 2A).

3. Obserwacja wzrostu kryształów

  1. Umieszczając płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem światła transmisyjnego, z polaryzatorami lub bez, monitoruj wzrost kryształów bez żadnych zakłóceń eksperymentu (Rysunek 4).
  2. W przypadku korzystania z mniejszych, 18-milimetrowych uchwytów na próbki typu 3 (Rysunek 1C), które zostały zaprojektowane do stosowania na płytkach SBS, należy użyć robota obrazującego zdolnego do obsługi płytek SBS, aby monitorować wzrost kryształów w bardziej zautomatyzowany sposób.

4. Manipulacja kryształami

UWAGA: Zaleca się wykonywanie wszystkich kolejnych kroków pod mikroskopem światła transmisyjnego.

  1. Krioochrona
    1. Delikatnie przekłuj zewnętrzną folię COC za pomocą cienkiej kaniuli. Upewnij się, że wewnętrzna żółta folia pozostaje nietknięta. Nakłucie powinno znajdować się tuż obok kropli, która ma być manipulowana (Rysunek 3A,3C).
    2. Użyj cienkiego papierowego i włóż go do wybitego otworu. Ostrożnie popchnij do przodu, aż dotknie żółtej folii poliimidowej. Utrzymuj w kontakcie z perforowaną folią. odessie cały nadmiar roztworu. Czas potrzebny do całkowitego usunięcia cieczy zależy od lepkości roztworów i składu ługu macierzystego (Rysunek 3B).
    3. Po odessaniu całego płynu delikatnie cofnij papierowy. Należy pamiętać o położeniu kropli, ponieważ może ona nie być widoczna po usunięciu ługu macierzystego.
    4. Weź standardową pipetę, aby nałożyć niewielką objętość roztworu krioochronnego, maksymalnie 3 μl, za pomocą wytłaczanej końcówki (np. końcówki do ładowania żelem) przez ten sam otwór. Po dozowaniu płynu wycofaj końcówkę. Porowatość żółtej folii pozwala na dyfuzję po folii. Czas uzyskania krioochrony kryształów w dużym stopniu zależy od zastosowanego roztworu i jego składników.
    5. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około 1 s i przesuń go po nakłuciu. Niewielki nacisk w połączeniu z podwyższoną temperaturą będzie sprzyjał ponownemu uszczelnianiu nakłuć, które nie są zbyt duże.
  2. Moczenie ligandów

    UWAGA: Nadmiar ługu macierzystego można usunąć przed namoczeniem ligandów. W tym celu należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w punktach od 4.1.1 do 4.1.3.
    1. Rozpuścić ligand w ługu macierzystym w pożądanym stężeniu w probówce reakcyjnej.
    2. Wirować roztwór przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. W razie potrzeby użyj wirówki o kontrolowanej temperaturze.
    3. Delikatnie umieścić objętość maksymalnie 3 μl roztworu zawierającego ligand w szczelinie między folią COC a folią poliimidową za pomocą długiej, wytłaczanej końcówki pipety. Schowaj końcówkę.
    4. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około 1 s i przesuń go po nakłuciu (patrz również 4.1.5).
    5. Inkubować eksperyment przez pewien czas, aby umożliwić dyfuzję przez błonę. Czas namaczania w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu dyfuzyjnego i jego składników29.
    6. Powtórzyć kroki 4.2.1 do 4.2.5 wiele razy, aby następnie namoczyć różne ligandy.

5. Zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia

UWAGA: Aby zminimalizować rozproszenie rozpuszczalnika, usuń nadmiar roztworu przed zebraniem danych.

  1. Zapewnij stabilne środowisko linii badawczej o kontrolowanej wilgotności z wcześniej ustalonymi warunkami30.
  2. Delikatnie podnieś przezroczystą folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczy i oderwij ją tak, jak zdejmuje się pokrywkę z kubka po jogurcie ( Rysunek 6B).
  3. Delikatnie wyjmij uchwyt próbki z jego wnęki i natychmiast włóż go do wstępnie przygotowanej magnetycznej podstawy uchwytu na próbkę. Na tym etapie nie jest potrzebny klej (Rysunek 6B).
  4. Zastosuj delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe ustawienie uchwytu próbki w podstawie.
  5. Zamontuj uchwyt próbki na goniometrze linii badawczej i upewnij się, że uchwyt jest prawidłowo ustawiony. W zależności od geometrii goniometru, uchwyt próbki można obracać o maksymalnie 160° bez powodowania zacienienia podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.
  6. Użyj papierowego i delikatnie dotknij żółtej folii poliimidowej od tyłu, aby usunąć nadmiar ługu macierzystego. Należy pamiętać, że na tym etapie można równie dobrze przeprowadzić namaczanie ligandów lub krioochronę. Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych.
  7. W przypadku korzystania z uchwytu na próbkę ze zdejmowanym pierścieniem zewnętrznym, należy delikatnie docisnąć, przytrzymując pierścień zewnętrzny i odłamać go w wyznaczonych punktach przerwania (Rysunek 6C). Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych.

6. Zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze kriogenicznej

UWAGA: Zaleca się usunięcie pozostałości ługu macierzystego z próbki, wykonując kroki od 4.1.1. do 4.1.3. przed przejściem do kolejnych kroków, aby zminimalizować rozpraszanie rozpuszczalnika. Większość próbek można przenieść do ciekłego azotu bez uprzedniej ochrony kriogenicznej31. Jeśli wymagana jest krioochrona, patrz kroki 4.1.1. zgodnie z pkt 4.1.5.

  1. Delikatnie podnieś folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczyków i zdejmij ją (patrz krok 5.1.2) (Rysunek 6A).
  2. Wyjmij uchwyt na próbkę z wnęki i zamontuj go na magnetycznej podstawie uchwytu na próbkę. Można zastosować delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe i szczelne dopasowanie (patrz krok 5.1.5, Rysunek 6B).
    UWAGA: Symetrycznie rozmieszczone wyznaczone punkty przerwania pozwalają na łatwe usunięcie zewnętrznego pierścienia uchwytu próbki poprzez delikatny nacisk (patrz krok 5.1.8., Rysunek 6C). Teraz uchwyt na próbkę jest gotowy i można go zanurzyć w ciekłym azocie. Geometria uchwytów na próbki typu 2 i 3 ( Rysunek 1B,1C) umożliwia ich przeniesienie do standardowych fiolek na próbki SPINE, które mogą być używane do montażu próbek wspomaganych przez robota (Rysunek 6D).

Wyniki

Uchwyt na próbkę typu 1 został zaprojektowany tak, aby pasował do dołka płytki 24-dołkowej typu Linbro. Każdy pojedynczy uchwyt na próbkę posiada elementy pomocnicze po obu stronach zewnętrznej krawędzi, aby zapewnić optymalne ustawienie na krawędzi dołka (Rysunek 1A, Rysunek 2A). Na żółtej folii poliamidowej można umieścić do trzech pojedynczych kropel krystalizacyjnych o maksymalnej objętości 2 µL każda (Rysunek 2B). W przypadku uchwytów na próbki typów 2 i 3 zaleca się naniesienie maksymalnie dwóch kropel o maksymalnej objętości 2 µL każda. Na jednej płytce 24-dołkowej Linbro można umieścić 24 uchwyty na próbki (Rysunek 3D).

Przeprowadzono eksperyment krystalizacji na płytce Linbro z 24 dołkami z zastosowaniem uchwytu na próbki typu 1. 1 µL roztworu lizozymu z białka jaja kurzego (15 mg/mL) zmieszano z 1 µL cieczy macierzystej składającej się z 50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl oraz 25% (w/v) PEG-6000 na żółtej folii polimidowej uchwytu na próbki (Table 1). Kroplę równoważono w temperaturze 293 K względem 500 µL cieczy macierzystej, a po 5 godzinach zaobserwowano kryształy o wielkości 40-50 µm (Figure 4). Wzrost kryształów można obserwować za pomocą transmisyjnego mikroskopu świetlnego (Figure 4) z polaryzatorem lub bez niego. Wysoka przejrzystość folii zapewnia optymalną obserwację i monitorowanie warunków wzrostu kryształów przy użyciu zarówno konwencjonalnego mikroskopu świetlnego, jak i zautomatyzowanego systemu obrazowania kryształów. Nie testowano obserwacji wzrostu kryształów przy użyciu światła UV.

Po usunięciu cieczy macierzystej z otoczenia kryształów, uchwyt z kryształami lysozymu z białka jaja kurzego wyjęto z płytki krystalizacyjnej i umieszczono w strumieniu powietrza o kontrolowanej wilgotności na linii wiązki 14.3 w HZB-MX.32Dane dyfrakcyjne zebrano w temperaturze otoczenia w 1°-przyrosty przy użyciu a 150 μm wiązka o energii 13,8 keV z natężeniem 4 x 1010 fotonów/s oraz czasie ekspozycji wynoszącym 5 s na obraz. Typowy obraz dyfrakcyjny przedstawiono na Rycina 5Na obrazie dyfrakcyjnym nie stwierdzono podwyższonego rozproszenia tła. Dalsze szczegóły eksperymentalne, jak również powiązane statystyki przetwarzania danych, wykazano w Tabela 2.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny widok nowych uchwytów na próbki. Uchwyty na próbki składają się z czarnego plastikowego wspornika, który od zewnętrznej strony pokryty jest folią z amorficznego cyklicznego kopolimeru olefinowego (COC). Folia ta (kolor niebieski) jest wysoce przezroczysta i samonaprawialna. Zapewnia ona również szczelność gazową eksperymentu. Wewnętrzna folia (kolor żółty) wykonana jest z bioobojętnego poliimidu, który jest wysoce przezroczysty dla promieni rentgenowskich. Na tej folii można umieścić krople krystalizacyjne. Zewnętrzny obramowanie uchwytu na próbkę zawiera dwa elementy pozycjonujące wskazane czerwoną strzałką (panel A), które umożliwiają precyzyjne umieszczenie uchwytu na poszczególnych, uprzednio nasmarowanych wgłębieniach płytki krystalizacyjnej. (A) Uchwyt na próbki (typ 1) o średnicy 22 mm ze stałym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. (B) Uchwyt na próbki (typ 2) o średnicy 22 mm z demontowalnym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. (C) Uchwyt na próbki (typ 3) o średnicy 18 mm z demontowalnym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. Dwa ostatnie zostały opracowane do zastosowań wysokoprzepustowych z automatycznymi robotami do montażu próbek w standardzie SPINE. Wyznaczone punkty łamania zaznaczono czerwonymi strzałkami w panelu B. Czarna strzałka w panelu C wskazuje marker pozycjonujący. Wystające piny na zewnętrznym obwodzie żółtej folii są niezbędne do wyrównania folii poliimidowej podczas procesu produkcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Uchwyt do próbek można stosować na 24-dołkowej płytce Linbro w ten sam sposób, co powszechnie używane szkiełka nakrywki do mikroskopu. Uszczelnia on jamkę w sposób hermetyczny. Pomoce pozycjonujące zapewniają prawidłowe umieszczenie uchwytu do próbek na jamce (czerwone strzałki na panelu A). Na uchwycie do próbek typu 1 można umieścić do trzech pojedynczych kropli (panel B), natomiast zalecana maksymalna liczba kropli na uchwycie typu 2 lub 3 wynosi dwie. Maksymalna zalecana objętość każdej kropli to 2 µL. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rycina 3: 24 uchwyty na próbki typu 1 dopasowane do płytki 24-dołkowej. Uchwyty na próbki można umieścić na płytce 24-dołkowej w dwóch orientacjach, jak wskazano (panel D). Do przebicia tylnej folii COC używa się kaniuli, aby usunąć nadmiar cieczy z kropli krystalizacyjnej (panele A i C), wykorzystując w tym celu knot papierowy delikatnie włożony w ten sam otwór (panel B). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Obraz kryształów lysozymu z białka jaja kurzego obserwowane przez mikroskop transmisyjny wyposażony w polaryzator. Pojedyncze kryształy są łatwo odróżnialne od wytrąconego roztworu białka. Kryształy na tym obrazie mają średni rozmiar 40 µm x 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Typowy obraz dyfrakcji rentgenowskiej kryształu lizozymu wyhodowanego na uchwycie do próbek. Przed naświetlaniem promieniami rentgenowskimi z okolic kryształu usunięto cały nadmiar roztworu macierzystego. Dane dyfrakcyjne zebrały na BL14.3 w magazynie elektronów BESSY II32 w temperaturze otoczenia, wykorzystując środowisko próbki z kontrolowaną wilgotnością względną na poziomie 97.5%. Nie obserwuje się podwyższonego tła wynikającego z zastosowania uchwytów do próbek. Linie przerywane na obrazie wskazują pierścienie rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Przygotowanie uchwytu próbki do zbierania danych dyfrakcyjnych. Najpierw folia COC jest delikatnie podnoszona za pomocą pęsety, a następnie odklejana (panel A). Następnie uchwyt próbki zostaje wyjęty z otworu i wstawiony w centralny otwór podstawy magnetycznej aż do oznacznika (panel B). Przytrzymując część centralną, wywiera się lekki nacisk na zewnętrzny pierścień, aby odłączyć część centralną, wykorzystując symetrycznie rozmieszczone punkty przerwania (panel C). Po wyjęciu uchwyt próbki może zostać zanurzony w ciekłym azocie i przeniesiony do standardowych fiolek SPINE. Umieszczone na przykład w puckach, mogą być transportowane do ośrodków synchrotronowych, gdzie zautomatyzowane roboty montujące próbki rozpoznają je jako zwykłe próbki (panel D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Szczegóły krystalizacji
MetodaMetoda dyfuzji pary w kropli wiszącej
Typ płytkiPłytki SuperClear
Temperatura (K)293
Stężenie białka (mg/ml)-1)15
Skład roztworu w zbiorniku50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25% (w/v) PEG-6000
Objętość i stosunek kropli2 µL łącznie, stosunek 1:1 (białko : ługa macierzystego)
Objętość zbiornika500 µL
Czas inkubacji12 godzin

Tabela 1: Szczegóły eksperymentalne opisanego doświadczenia krystalizacji.

Gromadzenie i przetwarzanie danych
Długość fali (Å)0.89429
Temperatura (K)293
DetektorRayonix MX225 CCD 
Odległość kryształu od detektora (mm)120
Zakres rotacji na obraz (°)0.5
Całkowity zakres obrotu (°)120
Czas naświetlania na obraz (s)5
Grupa przestrzenna P43212
Parametry komórki elementarnej (Å)a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95
Mozaikowość (°)0.07
Zakres rozdzielczości (Å)39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)
Całkowita liczba odbić191940 (8932)
Liczba unikalnych refleksów27020 (1292)
Stopień kompletności (%)99.88 (99.20)
Wielokrotność7.1 (6.9)
Średnie I/σ(I)15.0 (1.9)
Rpomiar35 (%)6.3 (107.0)
Rpim36 (%)2.4 (40.4)
CC1/237 99.9 (68.5)
ISa38 16.1
czynnik Wilsona B (Å2)17.0

Tabela 2: Statystyki zbierania i przetwarzania danych dyfrakcyjnych.

Dyskusja

Przydatność do eksperymentów z krystalizacją. Nowe uchwyty na próbki mogą być używane do standardowych eksperymentów krystalizacji kropli w zawieszeniu przy użyciu 24-dołkowych płytek typu Linbro (typy 1 i 2) lub 24-dołkowych płytek SBS, w których każda studzienka ma średnicę 18 mm (typ 3). Można je stosować zamiast standardowych szkiełek nakrywkowych do mikroskopu. Amorficzna folia COC zapewnia szczelność systemu. Monitorowanie eksperymentu krystalizacji jest możliwe przy użyciu mikroskopu światła transmisyjnego, dzięki zastosowaniu folii o wysokiej przezroczystości. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie istnieją żadne inne uchwyty na próbki dla 24-dołkowych płytek krystalizacyjnych, które pozwoliłyby na manipulację kryształami lub eksperymenty dyfrakcyjne, bez mechanicznego usuwania kryształu z kropli, w której jest hodowany. Ma to szczególne znaczenie, ponieważ wielu badaczy w tej dziedzinie nadal polega na takich płytkach do optymalizacji kryształów, ze względu na fakt, że można stosować większe objętości kropli w porównaniu z 96-dołkowymi płytkami z kroplą siedzącą. Przy tych większych objętościach kropli można uzyskać większe kryształy.

Przydatność do manipulacji kryształami. Ze względu na właściwości samoregenerujące zewnętrznej folii COC i mikroporowatą strukturę wewnętrznej żółtej folii poliimidowej, środowisko kryształów jest dostępne, a kryształami można manipulować bez mechanicznego przenoszenia ich do innych pojemników. To sprawia, że uchwyty na próbki są bardzo wygodne. Jedynym znanym nam systemem, który umożliwia ten pośredni i delikatny dostęp do kryształu, jest system CrystalDirect26. Jednak CrystalDirect jest mniej elastyczny, ponieważ konieczne jest użycie specjalnych 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych. Folia, na której rosną kryształy, jest tą samą, która uszczelnia eksperyment krystalizacji i nie jest samonaprawiająca. Oznacza to, że otwór, który został przebity w folii przez ablację laserową w celu dostarczenia ligandu lub krioprotektoru do kryształów, pozostanie otwarty, zwiększając szansę na odparowanie cieczy. Jest to przeciwieństwo naszego projektu, w którym kryształy nie będą bezpośrednio narażone na działanie środowiska, nawet jeśli folia COC zostanie kilkakrotnie przebita.

Przydatność do eksperymentów dyfrakcji in situ w temperaturze otoczenia. Uchwyt na próbkę można w prosty sposób zdjąć z płytki krystalizacyjnej, przykleić do podstawy magnetycznej i umieścić na goniometrze linii badawczej. W przypadku eksperymentu dyfrakcyjnego w temperaturze pokojowej zaleca się umieszczenie próbki w strumieniu powietrza o określonej wilgotności33. Ług macierzysty wokół kryształu może zostać usunięty przed umieszczeniem uchwytu próbki na goniometrze w celu zmniejszenia rozpraszania tła. Taka konfiguracja jest stabilna przez wiele godzin.

Przydatność użytego materiału do pracy i przechowywania w temperaturze 100 K. Schłodzenie do niskich temperatur nie ma negatywnego wpływu na materiał użyty do produkcji uchwytu na próbkę ani na folię poliimidową34. W związku z tym praca z uchwytem próbki w niskiej temperaturze (np. 100 K) nie stanowi poważnego problemu.

Przydatność do eksperymentów dyfrakcji in situ w temperaturze 100 K. W celu zebrania danych w temperaturze 100 K w strumieniu azotu, uchwyt próbki należy wyjąć z płytki krystalizacyjnej, jak w poprzednim akapicie, nakleić na podłoże magnetyczne i umieścić w strumieniu azotu gazowego w temperaturze 100 K na goniometrze badawczym. W razie potrzeby próbka może być również zabezpieczona przed krioizolacją, chociaż jest prawdopodobne, że w większości przypadków może to nie być konieczne w przypadku próbeknagich 31. Do eksperymentów w temperaturze 100 K lepiej nadają się uchwyty na próbki typu 2 i 3, ponieważ zewnętrzny pierścień z tworzywa sztucznego można zdjąć. W związku z tym mają mniejsze rozmiary i dlatego powinny być mniej podatne na oblodzenie. Można jednak użyć nawet uchwytu na próbkę typu 1. Biorąc pod uwagę niezbyt wysoką wilgotność w eksperymentalnej klatce i odpowiednio ustawione oblodzenie kriosystemu uchwytu, nie stanowi to większego problemu.

Ograniczenia. Geometria uchwytu próbki pozwala na niezakłócone zbieranie danych dyfrakcyjnych metodą rotacji w całkowitym zakresie obrotu 160°. Jest to wystarczające, aby można było uzyskać kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych dla większości układów krystalicznych. W przypadkach, gdy nie jest to możliwe, dane z więcej niż kryształu muszą zostać połączone ze sobą. Kiedy kryształy są hodowane razem, możliwe jest dostosowanie wielkości padającej wiązki promieniowania rentgenowskiego tak, aby odsłonięte były tylko części pojedynczych kryształów. W skrajnych przypadkach konieczne może być zastosowanie strategii gromadzenia danych podobnej do podejścia MeshAndCollect35. Podsumowując, chociaż istnieją pewne ograniczenia związane z uchwytami próbek, w większości przypadków można je przezwyciężyć. Oczywiście zawsze można napotkać sytuacje, w których nic z tego nie jest możliwe. W takich przypadkach może być konieczne skorzystanie z innych metod montażu kryształów.

Opisaliśmy nowy typ uchwytu na próbki do krystalografii makromolekularnej i wykazaliśmy przydatność uchwytów na próbki do różnych zastosowań. Biorąc pod uwagę prostą i powtarzalną obsługę kryształów białkowych, a także unikalne właściwości uchwytów na próbki, uważamy, że te uchwyty na próbki okażą się cennym dodatkiem do arsenału uchwytów na próbki do krystalografii makromolekularnej.

Oświadczenia

Zgłoszenia patentowe dotyczące zgłoszonego posiadacza próbki zostały złożone przez Helmholtz-Zentrum Berlin z następującymi numerami rejestracyjnymi i datami rejestracji w Niemieckim Urzędzie Patentów i Znaków Towarowych: DE 10 2018 129 125.6, data rejestracji 20 listopada 2018r.; DE 10 2018 125 129.7, data rejestracji 11 października 2018r.; DE 10 2017 129 761.8, data rejestracji 13 grudnia 2017r. Kolejny międzynarodowy wniosek patentowy w ramach PCT, z pierwszeństwem DE 10 2017 129 761.8, został złożony PCT/DE2018/101007. Rejestracja wzoru użytkowego o numerze DE 20 2018 106 955.1 została dokonana w dniu 6 grudnia 2018r. Uchwyt na próbkę został udostępniony na rynku pod nazwami handlowymi XtalTool i XtalTool/HT przez Jena Bioscience, Jena, Niemcy.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować BESSY II, obsługiwanemu przez Helmholtz-Zentrum Berlin za dostęp i wsparcie w zakresie czasu wiązki, a także działom Sample Environment i Technical Design za pomoc w projektowaniu i budowie oraz dostęp do urządzeń drukarki 3D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AF SatetissRS Components101-5738niestrzępiący się papier, wielu sprzedawców
CannulaDispomed Neoject25 G 5/8" 0,5 x 16, Ref:10026wielu sprzedawców
Folia COCHJ-Bioanalytik GmbH900360
ComboPlateGreiner Bio-one / Jena Bioscience662050 / CPL-131wstępnie nasmarowana płytka, wielu sprzedawców
detalicznych Cryo FiolkiJena BioscienceCV-100
Eppendorf Research Plus Eppendorf31230000120,1 - 2,5 &mikro; L objętość
Eppendorf ProbówkiEppendorf301251501,5 mL g-Safe Eppendorf Quality, numer referencyjny producenta
Kleszcze UsbeckFisherScientific10750313
GELoader Eppendorf QualityEppendorf30001222końcówki wytłaczane  (0,2 - 20 &mikro; L), numer referencyjny producenta
Kriofiolki magnetyczneWymiar molekularnyMD7-402
Microfuge ThermoThermoFisher ScientificR21
papierowedental200064460Zestaw papierowych, wielu sprzedawców
Rotiprotect Nitril-eco Carl RothTC14.1bezpudrowy, wielu sprzedawców
SuperClear PlatesJena BioscienceCPL-132wstępnie nasmarowana płyta
UHU super glueUHU GmbH & Co KG45545numer referencyjny producenta, wielu sprzedawców
VeroBlackPlusAlphacamOBJ-40963numer referencyjny producenta
XtalTool Zestaw uchwytów na próbkiJena BioscienceX-XT-101
XtalTool HTJena BioscienceX-XT-103 / X-XT-104Zestaw uchwytów na próbki kompatybilny ze
SPINE XtalToolBasesJena BioscienceX-XT-105Zestaw magnetycznych podstaw do uchwytów na próbki

Bibliografia

  1. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  2. Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
  3. Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
  4. Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
  5. Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
  6. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  7. Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
  8. Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
  9. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  10. Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  11. Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
  12. Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601(2010).
  13. Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002(2008).
  14. Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
  15. Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
  16. Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
  17. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  18. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451(2015).
  19. Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
  20. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
  21. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302(2015).
  22. Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
  23. le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
  24. Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
  25. Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
  26. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
  27. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  28. Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F(2015).
  29. McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
  30. Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
  31. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
  32. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).
  33. Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
  34. Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
  35. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja kryszta aminas czanie ligandemkrioprotekcjadyfrakcja in situp ytka 24 do kowafolia COCfolia polimidowa

Powiązane artykuły