Artykuł metodologiczny

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

DOI:

10.3791/59726

⸱

22 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Colby College, 2Division of Evolutionary Developmental Biology, National Institute for Basic Biology, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4Department Biology and Department of Neuroscience, Bowdoin College, 5Department of Organismic and Evolutionary Biology and Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiana funkcji genów w rozwijającym się organizmie jest kluczowa dla różnych rodzajów eksperymentów. Podczas gdy niezwykle potężne narzędzia genetyczne zostały opracowane w tradycyjnych systemach modelowych, trudno jest manipulować genami lub informacyjnym RNA (mRNA) w większości innych organizmów. Jednocześnie podejścia ewolucyjne i porównawcze opierają się na badaniu funkcji genów u wielu różnych gatunków, co wymaga rozwoju i adaptacji technik manipulowania ekspresją poza gatunkami podatnymi na genetykę. Protokół ten opisuje metodę wstrzykiwania odczynników do jaj świerszczy w celu zbadania wpływu danej manipulacji na rozwój embrionalny lub larwalny. Opisano instrukcje dotyczące pobierania i wstrzykiwania jaj za pomocą igieł ze skosem. Ta stosunkowo prosta technika jest elastyczna i potencjalnie można ją dostosować do innych owadów. W jednym eksperymencie można zebrać i wstrzyknąć dziesiątki komórek jajowych, a wskaźniki przeżycia w przypadku zastrzyków tylko buforowych poprawiają się wraz z praktyką i mogą sięgać nawet 80%. Technika ta będzie wspierać kilka rodzajów podejść eksperymentalnych, w tym wstrzykiwanie środków farmakologicznych, mRNA z czapeczką in vitro w celu ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania, dwuniciowego RNA (dsRNA) w celu uzyskania interferencji RNA, zastosowanie zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) w połączeniu z odczynnikami białka 9 (Cas9) związanymi z CRISPR do modyfikacji genomu oraz elementy transpozycyjne do generowania przejściowych lub stabilnych linii transgenicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość modyfikowania genomu lub wpływania na ekspresję genów w organizmach jest podstawą do projektowania wielu rodzajów eksperymentów testujących przyczynowość funkcjonalną. Kluczowe znaczenie dla prac porównawczych i ewolucyjnie istotnych ma również to, aby techniki modyfikacji genomu i niegenomu były dostępne w organizmach poza tradycyjnymi systemami genetycznych laboratoryjnych modeli zwierzęcych (np. Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans). Niezależnie od tego, czy jest to chęć zrozumienia różnorodności organizmów1, czy też przywiązanie do zasady Krogha, że dla każdego pytania biologicznego istnieje organizm najlepiej nadający się do jego rozwiązania2,3, zdolność do modyfikowania genomów lub wpływania na ekspresję genów jest niezbędna dla nowoczesnych projektów eksperymentalnych.

Świerszcz Gryllus bimaculatus to wyłaniający się system modelowy. Używany przez ostatnie stulecie w eksperymentach neuroetologicznych4, w ciągu ostatnich dwóch dekad byliśmy świadkami zwiększonego eksperymentalnego zainteresowania świerszczem, szczególnie skoncentrowanego na ewolucji i rozwoju tego organizmu5. Świerszcz jest hemimetabolicznym owadem, który rozgałęzia się zasadniczo na dobrze zbadane owady holometaboliczne, takie jak D. melanogaster i Tribolium castaneum6. Ze względu na jego użyteczną pozycję na drzewie ewolucyjnym, naukowcy są zainteresowani zadawaniem nowoczesnych, wyrafinowanych pytań eksperymentalnych temu owadowi, co doprowadziło do rosnącego zainteresowania adaptacją narzędzi molekularnych do stosowania u G. bimaculatus.

Wstrzykiwanie odczynników molekularnych do jaj świerszczy może być używane do eksperymentów modyfikacji genomu, jak również do niegenomowych manipulacji ekspresją genów w zarodkach. Na przykład transgeniczny G. bimaculatus przenoszący insercje eGFP został stworzony przy użyciu transpozazy piggyBac7,8. Badaczom udało się stworzyć nokaut G. bimaculatus przy użyciu nukleaz palców cynkowych (ZFN) i nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TAL) (TALENs) w celu wprowadzenia dwuniciowych pęknięć w określonych regionach genomu9. Chociaż ZFN i TALEN-y pozwalają na specyficzne dla danego miejsca celowanie u zwierząt poza systemami modelowymi wielkiej czwórki, odczynniki te szybko zostały prześcignięte przez system CRISPR/Cas9, który jest prostszy w użyciu, bardziej wydajny i wysoce elastyczny10. CRISPR został użyty w G. bimaculatus do wytworzenia knock-out11 oraz linii knock-in12,13 Oprócz modyfikacji genomu, dsRNA może być wstrzykiwane do komórek jajowych w celu obniżenia ekspresji mRNA w rozwijających się zarodkach, co pozwala badaczom zrozumieć rolę określonych transkryptów w całym rozwoju14,15. Niektóre ograniczone szczegóły na temat wstrzykiwania jaj świerszczy zostały opublikowane wcześniej12.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół wstrzykiwania wczesnych jaj G. bimaculatus. Protokół ten jest skuteczny i można go łatwo dostosować do różnych warunków laboratoryjnych, materiałów iniekcyjnych i ewentualnie do innych owadów. Chociaż dodatkowe szczegóły dotyczące projektowania i wdrażania modyfikacji genomu i eksperymentów z knockdownem zostały opublikowane gdzie indziej12,13, te podejścia będą ostatecznie opierać się na protokole iniekcji opisanym tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja sprzętu i przygotowanie materiałów

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 i Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z przygotowaniem roztworów, odczynników i szczegółów sprzętu.

  1. Ustawić mikroskop preparacyjny, aby zobaczyć jaja i poprowadzić igłę do wstrzykiwań. (Rysunek 1A przedstawia mikroskop preparacyjny wyposażony w fluorescencję.) Zdolność fluorescencji jest korzystna, ale nie jest konieczna.
  2. Ustaw 3-osiowy mikromanipulator, aby manewrować igłą iniekcyjną na miejscu (Rysunek 1A).
  3. Ustaw mikrowstrzykiwacz z rurką i uchwytem na igłę, aby wstrzykiwać niewielkie ilości materiału (Rysunek 1A). Opcjonalnie użyj pedału nożnego, który nie jest pokazany na rysunku.
  4. Zaprojektuj i stwórz stempel, aby stworzyć studzienki na jajka (Rysunek 1C), drukując odwrotność pożądanego wzoru, za pomocą drukarki 3D lub grawera laserowego.
    nuta: Pokazany wydrukowany w 3D przykładowy stempel ma wymiary 4,5 cm x 5 cm z 128 występami o wymiarach 3 cm x 1 cm x 1 mm do tworzenia indywidualnych studzienek. Szczegółowe informacje na temat tworzenia różnych konfigurowalnych form zostały opublikowane w innym miejscu16.
  5. Przygotować 10x bufor do wstrzykiwań, buforowaną sól fizjologiczną HEPES (HBS) i roztwór podstawowy barwnika dekstranu tetrametylorodaminy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotuj eksperymentalne roztwory do wstrzyknięcia, takie jak dsRNA, CRISPR/Cas912, elementy transpozycyjne, mRNA7,8, środki farmakologiczne17, ZFNs, lub TALENS9.
  7. Umieść podwójną taśmę klejącą na kilku warstwach standardowej taśmy laboratoryjnej na szklanym szkiełku mikroskopowym, aby utworzyć platformę około 1 mm nad szkiełkiem, która będzie używana do trzymania igieł do oceny.
  8. Przygotuj pojemnik na świerszcze o wymiarach około 40 cm x 60 cm z pokrywką z otworem pokrytym siatką zapewniającym cyrkulację powietrza.
  9. Dodaj jedzenie, wodę i materiały do schronienia.
  10. Dodaj kilkadziesiąt zdrowych samców i samic dorosłych świerszczy. Zidentyfikuj dorosłego świerszcza po obecności skrzydeł.
    nuta: Szereg wieków post-imaginalnych może zwiększyć wydajność jaj. Zagęszczenie świerszczy powinno być stosunkowo duże, aby móc zebrać wystarczającą ilość jaj do eksperymentu, ale nie tak zatłoczone, aby doszło do kanibalizmu. Na przykład około dwóch tuzinów zdrowych świerszczy, z mniej więcej równym stosunkiem samców do samic, w pojemniku o wielkości podanej powyżej powinno wystarczyć do zebrania około 200 jaj w ciągu jednej do dwóch godzin. Świerszcze można przechowywać w temperaturze pokojowej, ale rozwój i zachowanie będą optymalne, jeśli świerszcze będą trzymane w ciepłym (23,5–26 °C), wilgotnym (40–60% wilgotności względnej) inkubatorze.

2. Wytwarzanie igieł do wstrzykiwań

  1. Używaj kapilar ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (szczegóły dotyczące rozmiaru znajdują się w tabeli materiałów). Igły do ściągania należy przygotować tego samego dnia lub do kilku dni przed zakończeniem wstrzyknięć.
  2. Umieść szklankę kapilarną w ściągaczu, wyśrodkuj szklankę na żarniku i dokręć pokrętła, aby zabezpieczyć szklankę na miejscu.
  3. Ustaw temperaturę ściągacza w pobliżu temperatury rampy szklanej (-5 °C do +10 °C).
  4. Użyj jednoetapowego protokołu wysokiej temperatury, aby pociągnąć długi stożek z małym otworem, ale unikaj topienia zamkniętych końców.
    nuta: Na przykład, w przypadku korzystania ze ściągacza do mikropipet wyszczególnionego w Tabeli Materiałów, wyposażonego w żarnik pudełkowy, należy użyć następujących parametrów dla szkła o temperaturze rampy 478: Ciepło 478; Pociągnij 45; Vel 75; Del 120. Optymalne warunki do wyprodukowania igły o kształcie pokazanym w Rysunek 2B powinny być określone empirycznie przez każdego użytkownika.
  5. Skośne końcówki igieł w ramach przygotowań do wstrzyknięć.
  6. Zwilż obracającą się płaszczyznę młynka ukosownika (Rysunek 2A) kapiącą wodą. Używaj wody destylowanej uzdatnionej metodą odwróconej osmozy (RO) lub dietylopirowęglanu (DEPC).
  7. Umieść wciągniętą igłę w ukosowarce i obróć pod kątem 20°.
  8. Opuść igłę, aż dotknie płaszczyzny szlifowania i ukosuj przez 2 do 3 minut.
  9. Oceń skos, umieszczając skośną igłę na podwójnej taśmie samoprzylepnej, która została przyklejona do szklanego szkiełka mikroskopowego.
  10. Umieść szkiełko z igłą na stoliku mikroskopu złożonego wyposażonego w kamerę i oprogramowanie do akwizycji obrazu.
  11. Uzyskaj obraz końcówki igły za pomocą obiektywu 20x.
  12. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zmierzyć wewnętrzną średnicę światła igły tuż proksymalnie do fazowanego otworu (Rysunek 2C). Optymalny rozmiar to 10 μm + 2 μm.
  13. Wyrzuć igły, które mają otwór poniżej 8 μm i powyżej 12 μm.
  14. Przechowuj igły w pojemniku z pokrywką, aby uniknąć zakurzenia. Użyj paska wosku lub podobnego materiału, aby podnieść igły z dna pojemnika, aby zapobiec złamaniu końcówek (Rysunek 2D).

3. Zbieranie i przygotowanie jaj

  1. Zmaksymalizuj liczbę składanych jaj, pozbawiając świerszcze wilgotnego materiału do składania jaj (fiolki z wodą, naczynia z jajkami) przez noc lub przez co najmniej 8–10 godzin przed próbą zbierania jaj.
    nuta: Ponieważ samice mają zdolność do wewnętrznego przechowywania plemników, procedura w innym czasie może być konieczna, jeśli starannie zapłodnienie w czasie jest niezbędne eksperymentalnie18.
  2. Przygotuj 40 ml 1% agarozy w wodzie i wlej do 10 cm szalki Petriego.
  3. Umieść stempel na jajku na powierzchni agarozy, zanim zastygnie.
  4. Usuń stempel, gdy agaroza zastygnie, aby odsłonić dołki (Rysunek 1C).
  5. Napełnij płytkę dołka agarozowego HBS zawierającym 1% penicyliny/streptomycyny.
  6. Przykryć naczynie pokrywką, zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Naczynia można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem należy je podgrzać do temperatury pokojowej, aby uniknąć kondensacji.
  7. Przygotuj naczynie do zbierania jaj dla świerszczy, w którym świerszcze mogą składać jaja, wypełniając szalkę Petriego o średnicy 35 mm białym piaskiem z placu zabaw (Rysunek 1B).
    nuta: Piasek określony w Tabeli Materiałów ma odpowiednią wielkość ziarna. Jeśli ziarna piasku są zbyt duże, piasek uszkodzi jaja.
  8. Przykryj naczynie na jajka kwadratem ręcznika papierowego o wymiarach około 18 cm x 18 cm i ułóż na wierzchu naczynia z piaskiem. Przez ten ręcznik papierowy przykryj napełnione naczynie wodą z kranu.
  9. Przechyl szalkę Petriego i delikatnie ściśnij górną część, aby usunąć nadmiar wody.
  10. Wsuń rogi ręcznika papierowego pod kwadrat pod naczynie i umieść naczynie na jajka w odwróconej pokrywce, co pomoże utrzymać pokrowiec na ręcznik papierowy na miejscu.
  11. Umieść naczynie na jajka w pojemniku na świerszcze i pozwól dorosłym samicom złożyć jaja przez jeden do dwóch h.
    nuta: Stosunkowo krótki czas w tym miejscu gwarantuje, że wszystkie jaja będą podobne w fazie rozwoju w momencie wstrzyknięcia. Jeśli iniekcja przed komórkowaniem jest ważna, wstrzyknięcia powinny nastąpić w ciągu 14 godzin od złożenia jaj19.
  12. W międzyczasie pozwól naczyniu z agarozą (z kroku 3.6) ogrzać się do temperatury pokojowej, przygotowując się do trzymania jaj do wstrzykiwań.
  13. Wyjmij naczynie do zbierania jaj, zawierające teraz świeżo złożone jaja, z pojemnika na świerszcze i zdejmij pokrowiec na ręcznik papierowy. Umieść sitko o wielkości porów 0,5–1 mm na zlewce o pojemności co najmniej 500 ml (Rysunek 1B).
  14. Wypłucz zawartość naczynia do składania jaj (piasek i jajka) do sitka pod delikatnie płynącą wodą z kranu, pozwalając ziarnom piasku spaść przez siatkę sitka do wody w zlewce poniżej, ale pozostawiając jaja świerszczy w koszyku sitka.
  15. Napełnij pojemnik wodą RO i umieść go na tacy. Odwróć sitko nad pojemnikiem i postukaj nim o naczynie, aby usunąć jajka z wody. Jajka opadną na dno pojemnika.
  16. Odetnij końcówkę pipety P1000 nożyczkami, aby zrobić otwór o średnicy około 3 mm. Umieść tę końcówkę na pipetorze P1000 i użyj jej do przeniesienia jaj z pojemnika do naczynia z foremki na jajka z agarozy, przenosząc jak najmniej wody.
  17. Użyj plastikowej pęsety, aby ułożyć jajka w studzienkach agarozowych wypełnionych HBS plus 1% penicyliny/streptomycyny. Każde jajko opadnie na dno pojedynczej studni. Przykryj pokrywką szalki Petriego, aż będzie gotowa do wstrzyknięcia.

4. Przygotuj mikrowtryskiwacz

  1. Podłącz mikrowtryskiwacz do źródła sprężonego powietrza lub gazu (ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu sprężonego powietrza lub N2).
    nuta: Jeśli używasz przenośnego zbiornika powietrza, napełnij go do co najmniej 75 psi. Zbiornik będzie tracił ciśnienie powietrza podczas wstrzykiwań i może być konieczne jego ponowne napełnienie; Zastrzyki stają się trudne poniżej 40 psi.
  2. Włącz mikrowtryskiwacz. Ustaw czas wtrysku na 0,17 s, a ciśnienie na 10–15 psi.
    nuta: Dokładny wymagany nacisk zależy od otwarcia igły i musi być określony empirycznie dla każdej serii wstrzyknięć i (lub) nowej używanej igły.
  3. Upewnij się, że pokrętło BALANCE mikrowtryskiwacza jest przekręcone na 0 (zwykle całkowicie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) i że mikrowtryskiwacz jest pod ciśnieniem i jest w trybie wtrysku.

5. Zastrzyki

  1. Przefiltruj około 500 μl 10x buforu iniekcyjnego za pomocą strzykawki 1 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  2. Wymieszaj odczynniki do wstrzykiwań (szczegóły, które znajdują się poniżej, są przeznaczone do wstrzykiwania dsRNA przygotowanego zgodnie z opisem w12).
    nuta: Wskazane może być zaprojektowanie i wykonanie kilku elementów sterujących, zwłaszcza gdy po raz pierwszy uczy się tej techniki. Szturchanie jaj bez wstrzykiwania, wstrzykiwanie samego buforu + barwnika lub wstrzykiwanie buforu + barwnika + odczynnika kontrolnego (takiego jak eGFP dsRNA) są dobrymi testami na to, jak destrukcyjne mogą być różne elementy protokołu iniekcji. Zobacz Rysunek 3, aby zobaczyć przeżywalność wielu różnych kontroli.
  3. Zacznij od 4 μl porcji dsRNA.
  4. Dodać 0,5 μl przefiltrowanego 10-krotnego buforu iniekcyjnego do podwielokrotności dsRNA.
  5. Dodać 0,5 μl 50 mg/ml roztworu podstawowego barwnika dekstranu tetrametylorodaminy. Jeśli pracujesz na lunecie sekcyjnej bez fluorescencji, zamiast tego użyj czerwieni fenolowej.
  6. Wszystkie materiały należy przechowywać na lodzie przez cały okres wstrzykiwania.
  7. Załadować roztwór do wstrzykiwań do igły iniekcyjnej za pomocą końcówek nasycających o pojemności 20 μl i pipety p10.
  8. Pobrać 1,5 μl roztworu do wstrzykiwań i umieścić końcówkę ładującą w szerokim końcu igły do wstrzykiwań.
  9. Wysunąć roztwór jak najgłębiej w igłę i usunąć pęcherzyki powietrza, delikatnie trzepając; należy uważać, aby nie złamać igły.
  10. Umieść miskę z jajkami pod mikroskopem preparacyjnym i wybierz małe powiększenie około 10x (powiększenie 1x widziane przez obiektywy 10x).
  11. Włożyć igłę do obudowy wtrysku i dokręcić.
    nuta: Należy upewnić się, że igła jest prawidłowo i mocno włożona do obudowy. Aby to zrobić, wyciągnij szeroki koniec igły z powrotem z metalowej obudowy, zabierając ze sobą silikonową rurkę w obudowie. Wyreguluj silikonową rurkę tak, aby szklany koniec igły wystawał tuż poza krzem. Jeśli nie zostanie to zrobione, silikonowa rurka może zostać ściśnięta między szkłem a metalową obudową, blokując koniec igły.
  12. Ostrożnie włożyć obudowę wtrysku z dołączoną igłą do mikromanipulatora. Należy zwrócić uwagę na ostry koniec igły i uważać, aby nie wpadła na powierzchnię i nie została złamana.
  13. Patrząc zarówno na jajka, jak i igłę przez mikroskop, przesuń igłę w pobliże jajek w lewym górnym rogu siatki naczynia.
  14. Opuść igłę, aż końcówka wejdzie do HBS plus 1% roztworu buforowanego penicyliny/streptomycyny w naczyniu.
  15. Wyśrodkuj igłę w polu widzenia i przesuń naczynie na jajka tak, aby igła znajdowała się kilka mm bliżej krawędzi naczynia niż jajka.
  16. Nie zasłaniaj igły widoku siatki jaj.
  17. Ustaw mikroskop na filtr odpowiedni dla rodaminy, aby można było zaobserwować fluorescencję w igle i skupić się na końcówce igły.
  18. Na mikrowstrzykiwaczu powoli obracać pokrętło BALANCE zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wyciekać z igły do roztworu zawiesiny. Liczba salda na ekranie mikrowtryskiwacza zacznie rosnąć, chociaż wartość liczbowa nie jest ważna. Następnie lekko przekręć pokrętło z powrotem w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż barwnik przestanie wyciekać z igły.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby ustawić tę równowagę za każdym razem, gdy używana jest nowa igła. Bez odpowiednio ustawionej równowagi, mikrowtryskiwacz będzie kontynuował wstrzykiwanie przez jakiś czas po uruchomieniu iniekcji. Możliwe jest nawet, że pojedyncze naciśnięcie przycisku iniekcyjnego za pomocą niewyważonej igły spowoduje wydalenie całej zawartości załadowanej igły.
  19. Trzymając igłę wyśrodkowaną w polu view, przesuń miskę na jajka tak, aby igła była skierowana na jajko, które ma być wstrzyknięte jako pierwsze. Zaleca się, aby wstrzyknięcia rozpoczynać się w jednym rogu siatki ułożonych jaj, na przykład w lewym górnym rogu.
  20. Ustaw powiększenie na około 50x; przy tym powiększeniu pojedyncze jajko wypełni większość pola widzenia.
  21. Za pomocą mikromanipulatora i dłoni należy przyłożyć miskę do jajek, aby przesunąć igłę na miejsce do wstrzyknięcia.
  22. Przesunąć igłę za pomocą mikromanipulatora i włożyć końcówkę igły do pierwszego jaja, które ma zostać wstrzyknięte.
  23. Wbij igłę na 20–30% długości jaja od tylnego () końca jaja (Rysunek 1E), prostopadle do długiej osi jaja.
  24. Wstrzykiwać roztwór za pomocą pedału nożnego do wstrzykiwań lub przycisku wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu. Mały bolus materiału fluorescencyjnego wewnątrz jaja będzie wskazywał na udane wstrzyknięcie (Rysunek 1D).
    nuta: Nierzadko zdarza się, że część żółtka zostaje wyrzucona z jaja podczas wstrzykiwania (Ryc. 1F), co niekoniecznie oznacza, że wstrzyknięte jajo będzie niezdolne do życia.
  25. Wycofać igłę z jaja. Jeśli jajo zostanie przypadkowo wyjęte z dołka po wycofaniu igły, użyj małych kleszczy, aby wepchnąć jajko z powrotem do dołka, jednocześnie chowając igłę.
  26. Jeśli igła zatka się podczas wstrzyknięcia, należy wyjąć igłę z komórki jajowej i, trzymając igłę zanurzoną w HBS plus 1% roztworze penicyliny/streptomycyny pokrywającym jaja, usunąć zatkaną igłę za pomocą funkcji Clear lub naciskając przycisk wstrzyknięcia.
  27. Kontynuując używanie tej samej igły, powtórzyć procedurę wstrzykiwania dla jak największej liczby komórek jajowych. Na początku może to być tylko około 20 lub 30 jaj, ale z czasem wzrośnie do ponad 100
    28. .
  28. Jeśli igła zostanie zatkana i nie można jej usunąć, wyrzuć igłę, napełnij nową igłę i zacznij od nowa (tj. wróć do kroku 5.7).
  29. Naczynie z wstrzykniętymi jajami należy przechowywać w ciepłym inkubatorze (23,5–26 °C), który jest lekko wilgotny (w celu zminimalizowania parowania) do czasu, gdy zarodki osiągną pożądany etap rozwoju do analizy.
  30. Co najmniej co 24 godziny usuwaj jaja, które nie są już zdolne do życia (Rysunek 3A,B) i zastąp roztwór zawiesiny świeżym HBS plus 1% penicyliny/streptomycyny.
  31. Dwa do trzech dni po wstrzyknięciu przenieść jaja za pomocą delikatnego pipetowania lub plastikowych kleszczy na ręczniki papierowe zwilżone HBS plus 1% penicyliny/streptomycyny na szalce Petriego z pokrywką, aby kontynuować rozwój w ciepłym, wilgotnym inkubatorze.
  32. Monitoruj jaja i usuwaj jaja, które nie są już zdolne do życia każdego dnia (Rysunek 3A,B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świerszcze łatwo składają jaja w wilgotnym materiale, a dostarczenie odpowiedniego materiału, takiego jak wilgotny piasek lub ziemia, skłania je do złożenia dużej liczby jaj. Jest to szczególnie skuteczne, jeśli świerszcze są najpierw pozbawione materiału do składania jaj przez 8–10 godzin. Jaja złożone w czystym piasku można łatwo oddzielić, zebrać (Ryc. 1B) i umieścić w specjalnie zaprojektowanych studniach na jaja do wstrzykiwania (Ryc. 1C). Mikr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa główne wyzwania związane z tą techniką to związane z optymalnym rozmiarem igły i przeżywalnością. Chociaż mniejsze igły poprawiają przeżywalność, igły o węższych prześwitach mają większy stopień działania sił kapilarnych, co zwiększa prawdopodobieństwo, że żółtko wsunie się do igły, powodując jej zatkanie. W najlepszym przypadku zatory można usunąć po prostu przez wstrzyknięcie kolejnego jaja lub oczyszczenie igły, jak opisano powyżej. Można również próbować zwiększyć ciśnienie balansujące na mikrowtryskiwaczu, aż żó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zgłoszone w tym projekcie były wspierane przez Institutional Development Award (IDeA) od National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM10342 dla HH3 oraz przez nagrodę NSF o numerze IOS-1257217 dla CGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjnyLeicaM165 FCz fluorescencją
Zewnętrzne źródło światła do fluorescencjiLeicaEL 6000
NarishigeIM-300-Akcesoriamogą obejmować uchwyt na igły iniekcyjne, wąż wejściowy (ze złączem węża), przewód zasilający AC, przełącznik nożny, uszczelkę z gumy silikonowej-mKostka
filtra wiśniowegoKostka filtra LeicaM205FA/M165FCdo mCherry lub podobnego czerwonego barwnika będzie działać
MicromanipulatorWorld Precision Instruments, Inc.M3301RUżywany ze stojakiem magnetycznym (Narishige, typ GJ-8)
Stojak magnetycznyNarishigeMMO-202ND
Uchwyt na pipety (uchwyt na igłę)NarishigeHD-21
Rurka do podłączenia źródła powietrza do mikrowtryskiwacza
Stempel do studzienek na jajkawydrukowany w 3Dzamówieniewydrukowany w 3D na Lulzbot Taz 5 przy użyciu tworzywa termoplastycznego
Mikrofaleróżne
inkubatory lub pomieszczenia z kontrolowaną temperaturąróżnetemperatury 23,5-26 i stopni; C są potrzebne.
Karma dla świerszczyróżnekarmy dla kotów lub płatki rybne są odpowiednim pokarmem.
Woda do świerszczyróżnaWoda może być przechowywana w fiolkach i podawana świerszczom przez waciki
Schronienie dla krykietaariousMateriały schronienia mogą obejmować pogniecione ręczniki papierowe lub kartony po jajkach
Szklane rurki kapilarneWorld Precision Instruments, Inc.Nr kat. 1B100F-4Kwik-Fil™ Kapilary ze szkła borokrzemianowego, długość 100 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm, ze ściągaczem do
mikropipetFlaming/BrownModel P-97Dystrybuowane przez Sutter Instrument Co.
Młynek do ukosów/mikroNarishigeModel EG-45/EG-400EG-400 zawiera głowicę mikroskopu
szalki PetriegoCellTreatKod produktu 229693średnicy 90 mm
do zabawySandtastik Products Ltd.B003U6QLVSBiały piasek do zabawy
Agaroza AmerykańskiAB000972 BioanalitycznyAgaroza GPG/LE ultraczyste
sitko do jajek: Bardzo drobne sitka stożkowe ze stali nierdzewnej o skośnej siatceZaopatrzenie kuchni USAModel SS-C123Wielkość porów powinna wynosić od 0,5 do 1,0 mm
Penicylina StreptomycynaGibco firmy Life TechnologiesNr ref. 15070-063Pęseta plastikowa Pen Strep
Sipel Electronic SAP3C-STDrozpraszający ładunki elektrostatyczne, 118 mm
Filtry strzykawkowe, średnica 25 mm, 0,45 µ mNalgene725-2545Używaj ze strzykawką 1
ml Strzykawka 1 ml, z końcówką tuberkulinowąBecton Dickinson309602Używaj z filtrem strzykawkowym do filtrowania bufora iniekcyjnego, strzykawki z końcówką Luer-Lok również będą działać
Zbiornik powietrza (opcjonalnie)Midwest ProductsAir Works®Przenośny zbiornik powietrza
Barwnik rodaminyThermofisherD-1817dekstran, tetrametylorodamina 10 000MW,
20 ml końcówki ładująceEppendorfNr kat. 5242 956.003epT.I.P.S. 20 μ L Mikroładowarka
Mikroskop złożonyZeissAxioskope 2 plus
obiektyw 20xZiessPlan-Apochromat 20x/0.75 M27
AparatLeicaDMC 5400
Pakiet aplikacji Leica  oprogramowanieLeicaLASw wersji 4.6.2 używane tutaj
Mikroskop stereoskopowy Mikrowtryskiwacz na z polikwasu mlekowego, z filamentem Piasek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
  2. Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
  3. Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
  4. Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
  5. Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
  6. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  7. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
  8. Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
  9. Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017(2012).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  11. Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885(2015).
  12. Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
  13. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
  14. Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
  15. Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
  16. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).
  17. Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
  18. Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).
  19. Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
  20. Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
  21. Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
  22. Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja jaj wierszczyinterferencja RNAmanipulacja genomicznaprzygotowanie ig y ci tejforma do do k w agarozowychobs uga mikromanipulatoraledzenie za pomoc barwnika fluorescencyjnegoocena prze ywalno ciroztw r buforu HBStest rozwoju embrionalnego

Powiązane artykuły