Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Summary

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Abstract

Białka zawierające domenę hydrolazy hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAH) są zidentyfikowanymi członkami nadrodziny FAH u eukariontów. Enzymy z tej nadrodziny na ogół wykazują wielofunkcyjność, obejmującą głównie mechanizmy hydrolazy i dekarboksylazy. W artykule przedstawiono szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania białek FAHD, głównie ortologów białka FAHD 1 (FAHD1) wśród gatunków (człowiek, mysz, nicienie, rośliny itp.). Omówione metody obejmują ekspresję białek w E. coli, chromatografię powinowactwa, chromatografię jonowymienną, preparatywną i analityczną filtrację żelową, krystalizację, dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego i testy fotometryczne. Skoncentrowane białko o wysokim poziomie czystości (>98%) może być wykorzystane do krystalizacji lub produkcji przeciwciał. Białka o podobnej lub gorszej jakości mogą być stosowane w testach enzymatycznych lub wykorzystywane jako antygeny w systemach detekcji (Western-Blot, ELISA). W omówieniu tej pracy przedstawiono zidentyfikowane mechanizmy enzymatyczne FAHD1 w celu bardziej szczegółowego opisania jego dwufunkcyjności hydrolazy i dekarboksylazy.

Introduction

Hydrolaza fumaryloacetooctanu (FAH)^1,2 nadrodzina enzymów opisuje grupę enzymów, które dzielą wysoce konserwatywną katalityczną domenę FAH3^,4,5,6,7^,8,9,10. Pomimo wspólnego centrum katalitycznego, enzymy te są wielofunkcyjne, a większość z nich znajduje się u prokariontów, gdzie są używane do rozkładania związków pobranych ze złożonych źródeł węgla³. Do tej pory u eukariontów zidentyfikowano tylko trzech członków tej rodziny: nazwę dającą FAH², a także białko 1 zawierające domenę FAH (FAHD1)^{11,12,13,14,15} i białko zawierające domenę FAH 2 (FAHD2). Wyczerpanie FAHD1 wiąże się z upośledzeniem oddychania mitochondrialnego^13,16 i wiąże się z odwracalnym typem fenenotypu starzenia się komórek¹⁴, który jest związany z pośrednimi potencjalnymi brakami w systemie transportu elektronów. Ludzki FAHD1 i jego ortologie w układach modelowych (myszy, nicienie, linie komórkowe raka, rośliny itp.), a także wybrane warianty mutacji punktowych, stały się potencjalnymi celami terapeutycznymi. Do tych badań niezbędne jest rekombinowane białko o wysokim poziomie czystości, a także informacje na temat mechanizmów katalitycznych kierowanych przez struktury krystaliczne i selektywne przeciwciała.

Ten manuskrypt opisuje metody ekspresji białka FAHD u E. coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia jonowymienna, wytrącanie siarczanu amonu, preparatywna i analityczna filtracja żelowa, krystalizacja, dyfrakcja rentgenowska i testy fotometryczne. Celem opisanych tutaj metod i protokołów jest dostarczenie wskazówek dla naukowców pracujących w różnych dziedzinach, takich jak bakteriologia, biologia roślin, a także badania na zwierzętach i ludziach, w celu scharakteryzowania członków nadrodziny FAH, w tym niescharakteryzowanych członków nadrodziny, jeśli staną się oni istotni w określonej dziedzinie. Opisane tutaj protokoły mogą stanowić cenne wsparcie dla projektów mających na celu scharakteryzowanie innych prokariotycznych lub eukariotycznych członków nadrodziny FAH.

Uzasadnieniem dla opisanych tutaj metod jest fakt, że do charakterystyki słabo opisanych białek (w szczególności enzymów metabolicznych o nieznanym znaczeniu fizjologicznym), podejście polegające na rozpoczęciu od oczyszczonych białek rekombinowanych pozwala na opracowanie bezcennych, wysokiej jakości narzędzi badawczych, takich jak aktywne preparaty enzymatyczne in vitro, wysokiej jakości przeciwciała oraz silne i specyficzne inhibitory farmakologiczne dla wybranych enzymów. Opisane metody wymagają szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i krystalografii rentgenowskiej. Alternatywne metody (np. do ekspresji białka bez indukcji chemicznej lub do przedstawienia oczyszczania białka przez odwirowanie po obróbce cieplnej, a następnie odsalanie i chromatografię wykluczania wielkości) można znaleźć gdzie indziej¹⁷. Chociaż dostępne jest szersze spektrum metod ekspresji i oczyszczania enzymów z nadrodziny FAH^2,7,9,17,18, niniejsza praca koncentruje się w szczególności na ekspresji i oczyszczaniu białek FAHD.

W sekcji dyskusji tego manuskryptu, mechanizmy katalityczne zidentyfikowane dla białka FAHD1 (hydrolaza, dekarboksylaza)¹⁵ są opisane bardziej szczegółowo, aby zademonstrować chemiczny charakter katalizowanych reakcji. Dane uzyskane na podstawie poprzednich prac^7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) implikują trzecią aktywność enzymu jako izomerazę keto-enolową.

Protocol

1. Ekspresja białek FAHD u kompetentnych E. coli

1. Transformacja E. Coli z wektorami do ekspresji białka FAHD
   UWAGA: Kroki omówione w poniższej sekcji są podsumowane na szkicu w Rysunek 1A,B. Ten sam protokół dotyczy każdego białka FAHD, w tym wariantów z mutacją punktową. Takie warianty można uzyskać za pomocą techniki mutagenezy ukierunkowanej i PCR¹⁹ (takich jak dwustronna SOE PCR²⁰) z cDNA typu dzikiego.
   
   Rysunek 1: Amplifikacja kompetentnej E. coli i indukcja ekspresji białka.
   (A) Wprowadzenie wektora pET do kompetentnych bakterii BL21(DE3) pLysS E. coli, opisanych w sekcji 1. (B) Protokół szoku cieplnego i posiew bakterii E. coli przekształconych w pET, opisane w kroku 1 protokołu. Przekształcone bakterie są umieszczane na płytkach agarowych LB z antybiotykami do selekcji. (C) Amplifikacja bakterii E. coli przekształconych w pET, opisana w sekcji 1. Kolonie są wybierane z płytki agarowej LB i amplifikowane w pożywce odżywczej (LB lub NZCYM), aż gęstość bakterii osiągnie empiryczny próg 0,4. (D) Indukcja ekspresji białek za pomocą systemu DE3-IPTG-pET, opisanego w sekcji 1 i naszkicowanego w Rysunek 2. Produkcja białka rozpoczyna się poprzez zastosowanie substancji chemicznej IPTG. Na końcu sekcji 1 zbiera się osad bakteryjny zawierający białko. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   1. Uzyskać kompetentne BL21(DE3) pLysS E. coli bakterie i wektor ekspresyjny pET (patrz tabela materiałów). Najlepiej wybrać wektor pET, który koduje również N-końcowy znacznik Hisa lub powiązany znacznik przechwytywania dla wygody, aby uprościć następujące kroki oczyszczania.
   2. Uzyskaj cDNA wybranego białka FAHD i wstaw je do aktywnego miejsca klonowania wektora ekspresyjnego pET, odpowiednio pomiędzy miejscami promotora T7 i terminatora T7.
   3. Po udanej amplifikacji plazmidu i weryfikacji [poprzez sekwencjonowanie przez komercyjnego dostawcę (startery T7 mogą być używane z systemem pET dla wygody: promotor T7, starter do przodu: TAATACGACTCACTATAGGG; Terminator T7, starter odwrotny: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], wstawić 5–10 ng plazmidu do 100 μl kompetentnych bakterii BL21(DE3) pLysS E. coli na lodzie. Nie zasysaj w górę iw dół, ale lekko postukaj w rurkę, aby wymieszać zawartość.
   4. Trzymaj bakterie na lodzie przez 30 minut, delikatnie stukając w rurkę co kilka minut.
   5. Podgrzej urządzenie grzewcze lub łaźnię wodną do temperatury 42 °C (dokładnie). Włóż probówkę zawierającą bakterie do aparatu i trzymaj ją przez 90 sekund (dokładnie). Natychmiast połóż je na lodzie (Rysunek 1A).
   6. Po 5–10 minutach na lodzie dodaj 600 μl pożywki NCZYM (patrz tabela materiałów) i umieść probówkę w inkubatorze bakterii. Potrząsać probówką ze średnią prędkością zorientowaną zgodnie z kierunkiem wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   7. Płytka 200 μl kultury bakteryjnej na 10-centymetrowej płytce agarowej LB (patrz Tabela Materiałów), zawierająca wybrane antybiotyki z wyboru [np. jeden specyficzny dla oporności BL21(DE3) pLysS (chloramfenikol) i jeden dla oporności kodowanej na wektorze pET (kanamycyna lub ampicylina, Rysunek 1B)].
   8. Hodować bakterie na płytce LB-agar w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Ekspresja białek FAHD przez indukcję IPTG
   UWAGA: Pierwsze kroki omówione w poniższej sekcji są podsumowane jako szkic w Rysunek 1C,D. System ekspresji T7 poprzez połączenie bakteryjnej kasety DE3 i systemu wektorów pET jest podsumowany w Rysunek 2.
   
   Rysunek 2: Wyjaśnienie systemu dualnego kaseta/wektor pET DE3.
   (A) Naszkicowany genom wektora pET transformowanego BL21(DE3) pLysS bakterii E. coli. Natywny genom bakteryjny zawiera kasetę DE3 (patrz panel B), a także gen lac, który stale wyraża jednostki represorowe lac. Nienatywny wektor pET przenosi gen białkowy wstawiony między sekwencję promotora polimerazy T7 a sekwencją terminatora. Więcej szczegółów w panelu B. (B) Kaseta DE3 natywnego genomu bakteryjnego koduje informacje dla polimerazy T7 w postaci operonu polimerazy RNA E. coli. Białko to nie ulega jednak ekspresji, ponieważ jednostka represorowa lac zapobiega wiązaniu się białka polimerazy RNA. W związku z tym nie ulega ekspresji polimerazy T7 i nie ulega ekspresji białka egzogennego. (C) Zastosowanie substancji chemicznej IPTG (Tabela Materiałów) zniekształca strukturę jednostek represora lac i zapobiega ich wiązaniu z kasetą DE3. W rezultacie polimeraza RNA może teraz wiązać się z kasetą, dla której polimeraza T7 ulega ekspresji, podobnie jak ostatecznie białko egzogenne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   1. Po udanym utworzeniu kolonii należy wybrać jedną pojedynczą rodzinę (bez żadnych kolonii satelitarnych) i rozprowadzić ją w 5 ml pożywki NZCYM lub LB z antybiotykami, wybranymi jak poprzednio (krok 1.1.7). Hodowla w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C przez noc (Rysunek 1C).
   2. Po pomyślnym wzroście bakterii należy je namnażać w partiach 250 ml, 500 ml lub 1 l pożywki, w zależności od zapotrzebowania na ilość białka.
      1. W zależności od objętości należy zastosować antybiotyki wybrane w kroku 1.1.7 i dodać około 1%–2% gęstej wstępnej kultury bakteryjnej (tj. 2,5–5,0 ml do 250 ml objętości pożywki itp.). Pobrać próbkę do użycia w kroku 1.2.5 (1 ml lub więcej) i sprawdzić gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Hodowla bakterii w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C przez 2–3 godziny (Rysunek 1C).
   3. Po 2–3 godzinach należy pobrać próbkę do analizy fotometrycznej. Jeżeli średnica zewnętrzna przy długości fali 600 nm osiągnęła 0,4, należy zastosować od 200 μM do 1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG, patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Rzeczywista wartość jest empiryczna dla każdego wariantu białka FAHD lub mutacji punktowej, gdzie 1 mM IPTG to maksimum, które należy zastosować. To indukuje ekspresję białka (Rysunek 1D, Rysunek 2C).
   4. Po kolejnych 3–5 godzinach w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C ekspresja białka jest wyczerpana.
      UWAGA: Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać komentarze na temat kontroli temperatury. Nie zaleca się wytrząsania dłuższego niż 5 godzin po indukcji. Pobrać próbkę do użycia w kroku 1.2.5 (1 ml lub więcej) i sprawdzić gęstość optyczną (OD) przy 600 nm.
      1. Zebrać osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -80 °C w przypadku dłuższego przechowywania lub -20 °C w przypadku krótkiego przechowywania (Rysunek 1D).
   5. Sprawdź indukcję za pomocą dwóch pobranych próbek fotometrycznych, które są oznaczone "-I" (przed indukcją) i "+I" (po indukcji). Po odwirowaniu i ponownym zawieszeniu osadu bakteryjnego, przeanalizować dwie próbki za pomocą SDS-PAGE, ładując tę samą ilość białka całkowitego.
      UWAGA: Próbka "+I" powinna wykazywać silne prążki związane z masą cząsteczkową wybranego białka, podczas gdy próbka "-I" nie powinna zawierać tego prążka. Niski poziom indukcji jest częstym problemem w produkcji białek, jednak poziom ekspresji białka jest często wystarczający dla kolejnych etapów. Wysoki poziom indukcji jest zaletą, ale nie jest obowiązkowy.

2. Liza granulek bakteryjnych i filtracja zanieczyszczeń

1. W zależności od tego, czy wybrane białko jest znakowane His, czy nie, wybierz bufor do pracy Ni-NTA (His-tagged, patrz Tabela materiałów) lub lodowaty bufor do pracy HIC (nietagowany).
2. Na każde 250 ml oryginalnej zawiesiny bakteryjnej nałóż 5 ml wybranego buforu na osad bakteryjny (5 ml na 250 ml, 10 ml na 500 ml itd.). Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu (β-ME) na 5 ml zastosowanego buforu. Użyj pipety Pasteura o pojemności 10 ml, aby mechanicznie wcisnąć granulkę w zawiesinę poprzez drapanie i pipetowanie (unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania). Ostatecznie przenieść całą zawiesinę do jednej probówki o pojemności 50 ml.
3. Najlepiej poddać zawiesinę działaniu sonikacji (6x przez 15 s przy średniej sile).
4. Wirować przez 30 minut na wysokich obrotach (10 000 x g) w temperaturze 4 °C. Filtrować supernatant kolejno za pomocą jednostek filtrujących (np. 0,45 μm, 0,22 μm) na lodzie.
   UWAGA: W zależności od poprzedniego etapu wirowania, filtracja bezpośrednio przez mały rozmiar porów filtra może być żmudny i zwykle wymaga wstępnej filtracji przez większy rozmiar porów. W celu uzyskania lepszych wyników można dodać DNAzę.
5. Przechowywać próbkę na lodzie i natychmiast przejść do sekcji 3 lub 4, w zależności od tego, czy białko jest znakowane His, czy nie.

3. Oczyszczanie białek FAHD znakowanych przez Hisa za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA

UWAGA: Jony Ni²⁺ są wiązane przez kwas nitrylotrioctowy (NTA) z żywicą agarozową, która jest używana w chromatografii powinowactwa (chromatografia jonów metali immobilizowanych, IMAC, Rysunek 3A). Znaczniki aminokwasowe polihistydyny silnie wiążą się z tym chelatem Ni, a białka znakowane Hisem można oddzielić od większości pozostałych białek. Alternatywą dla opisywanego przygotowania kolumn Ni-NTA jest zastosowanie wstępnie upakowanych kolumn Ni-NTA oraz systemu FPLC.

Rysunek 3: Szkice ilustracji popularnych typów chromatografii.
(A) Żywica kolumny Ni-NTA. NTA zawiera dwuwartościowe jony niklu, które są używane w chromatografii powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC). Znaczniki polihistydynowe wiążą się korzystnie z tym motywem i mogą być eluowane przez imidazol. (B) Typowa powłoka cząstek krzemionki w chromatografii oddziaływań hydrofobowych na bazie fenylu (HIC-fenyl). Białka hydrofobowe oddziałują z materiałem powlekającym i są opóźnione w migracji, podczas gdy inne nie. (C) Typowe powlekanie cząstek krzemionki w chromatografii oddziaływań jonowych. Spolaryzowane i naładowane białka oddziałują z materiałem powlekającym i są opóźnione w swojej migracji, podczas gdy inne nie. (D) Żywica żelu krzemionkowego w chromatografii wykluczania wielkości (SEC). Na podstawie zdefiniowanych porów w materiale krzemionkowym białka można rozdzielić ze względu na ich wielkość (w pierwszym przybliżeniu odpowiadającym ich masie cząsteczkowej). Małe białka przenikają przez porowaty materiał kolumny i są opóźnione, podczas gdy duże białka szybciej migrują wokół porowatych cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przejdź od kroku 2.5 (tj. białko znajduje się w buforze Ni-NTA i jest filtrowane przez jednostki filtrujące 0,22 μm na lodzie).
2. Przygotuj pustą plastikową lub szklaną kolumnę, myjąc pustą kolumnę i mocując ją do stabilnego elementu ustalającego. Wybierz rozmiar kolumny w zależności od objętości zawiesiny białkowej.
3. Na każde 10 ml zawiesiny białkowej nanieść 500 μl zawiesiny agarozy Ni-NTA do kolumny (przed użyciem mocno wstrząsnąć). Nanosić gnojowicę powoli i kroplami na dolny filtr kolumny za pomocą pipety. Pozwól kolumnie się ustabilizować, co zajmie kilka sekund.
4. Całkowicie napełnij kolumnę buforem Ni-NTA, upewniając się, że nie zakłócisz działania żywicy agarozowej. Pozwól, aby bufor przepływał przez grawitację. Proces ten można przyspieszyć, wywierając nacisk kciukiem na płyn (za pomocą pokrywki lub rękawicy i nacisku kciuka), ale należy uważać, aby nie zniekształcić żywicy agarozowej.
5. Nałożyć zawiesinę białkową. Tak jak poprzednio, pozwól próbce przepłynąć grawitacyjnie. Przyspieszanie tego kroku za pomocą nacisku kciuka nie jest zalecane, ponieważ wiązanie białek z kolumną jest wzmocnione, jeśli natężenie przepływu jest niskie. Zbierz przepływ w rurce (tabela materiałów).
6. Po przejściu próbki ponownie napełnij całą kolumnę uruchomionym buforem Ni-NTA. Uważaj, aby nie zakłócić żywicy agarozowej. Pozwól próbce przejść grawitacyjnie, ale w przeciwieństwie do poprzedniego kroku, zaleca się przyspieszenie procesu poprzez nacisk kciuka, ponieważ potencjalne zanieczyszczenia spowodowane niespecyficznymi interakcjami mogą zostać w ten sposób zakłócone. Zbierz roztwór myjący do probówki. Powtórz ten krok.
7. Umieść przezroczystą w promieniowaniu UV kuwetę pod kolumną i nałóż 1 ml buforu elucyjnego Ni-NTA. Pobrać próbkę bez wywierania nacisku kciukiem na żywicę.
8. Sprawdzić gęstość optyczną (OD) próbki o długości fali 280 nm w porównaniu z próbką ślepą (tj. buforem elucyjnym Ni-NTA). Optymalnie, próbka wykazuje OD większy niż 2,5. OD poniżej 0,5 oznacza, że w próbce nie ma znaczącej ilości białka.
   UWAGA: Jak opisano w sekcji dyskusji, może być konieczne dostosowanie stężenia soli i imidazolu w buforze elucyjnym dla każdego białka FAHD indywidualnie.
9. Powtarzaj kroki 3.1.7 i 3.1.8, aż OD spadnie poniżej 0,5. Zebrać wszystkie próbki o wyższym OD w probówce na lodzie.
10. Zacznij ponownie od kroku 3.1.4, używając przepływu z kroku 3.1.5 jako nowych danych wejściowych dla tego powtórzenia kroku 3.1.5. Powtarzaj ten proces do momentu, gdy pierwsza próbka pobrana w kroku 3.1.6 wykaże OD poniżej 0,5.
    UWAGA: Jak opisano w części dotyczącej rozwiązywania problemów w sekcji dyskusji, białka znakowane przez Hisa mogą niewystarczająco wiązać się z żywicą Ni²⁺. W takich przypadkach wymagane jest powtórzenie tego etapu lub metod alternatywnych (np. chromatografii jonowymiennej).
11. Pobrać próbki wszystkich frakcji pośrednich do analizy SDS-PAGE.
12. Białka FAHD w buforze elucyjnym Ni-NTA wytrącają się po zamrożeniu i rozmrożeniu. W związku z tym należy dializować białko w innym buforze (przez noc na lodzie, używając 1 μl DTT na 100 ml buforu do dializy). Należy użyć buforu o niskiej zawartości soli w zależności od rodzaju chromatografii jonowymiennej, którą należy przeprowadzić po tym etapie. Stosować zwykłe rurki celulozowe o typowym odcięciu masy cząsteczkowej 14 kDa (tabela materiałów).
13. Po całonocnej dializie opcjonalnie zagęścić białko za pomocą jednostek filtrujących do ultrawirowania. Wykonaj analizę SDS-PAGE (12,5% żel do biegania, 4% żel do układania w stosy), aby sprawdzić potencjalną utratę białka, niewystarczającą elucję i ogólną czystość białka. Jeśli wszystko jest w porządku, przejdź do sekcji 5.

4. Oczyszczanie nieoznakowanych białek FAHD za pomocą hydrofobowej chromatografii oddziaływań (HIC)

UWAGA: Grupy fenylowe na powierzchni powłoki żelu krzemionkowego w kolumnie HIC dla FPLC (Rysunek 3B) umożliwiają separację białek zgodnie z charakterem hydrofobowym. Opisane czynności należy wykonać za pomocą systemu FPLC wyposażonego w 5 ml kolumny HIC-fenylowej. Kolumny można przemywać 1 M NaOH w celu ponownego użycia dla różnych białek. Jednak kolumny raz użyte dla jednego rodzaju białka FAHD powinny być ponownie wykorzystane tylko dla tego typu białka.

1. Wytrącanie siarczanu amonu (AS)
   1. Przejdź od kroku 2.5. Białko znajduje się w lodowatym buforze do pracy HIC (Tabela Materiałów).
   2. Ocenić objętość przygotowanego roztworu białkowego z dokładnością do mikrolitra (_początkowy V). Powoli i kroplami dodawać wstępnie schłodzony roztwór bufora HIC do pracy AS, aż do osiągnięcia nasycenia AS 35% objętościowo: dodano V_AS =_początkowe V * 0,538. Delikatnie mieszaj roztwór przez 30 minut. Wirować przez 15 minut na wysokich obrotach (≥10 000 x g) w temperaturze 4 °C.
   3. Przefiltrować supernatant za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm na lodzie. Opcjonalnie pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE: rozcieńczyć w stosunku 1:4 i natychmiast podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, w przeciwnym razie próbka ulegnie zbryleniu. W tym miejscu (-20 °C) próbkę można zamrozić w celu kontynuowania pracy przez kolejny dzień.
2. FPLC przy użyciu kolumny HIC
   1. Ustawić system FPLC i zrównoważyć 5 ml kolumny HIC-fenylowej z 5 objętościami kolumny (CV) 20% EtOH (w H₂O), a następnie 5 CV H₂O.
   2. Wymieszaj 260 ml buforu do biegania HIC (dokładnie) ze 140 ml buforu do biegania HIC AS (dokładnie). W ten sposób uzyskuje się roztwór AS o stężeniu 35% objętości. Sprawdzić pH (7,0); to jest bufor A. Bufor B to 250 ml działającego buforu. Dodaj 1 mM DTT do obu A i B, a następnie trzymaj je na lodzie.
   3. Zrównoważyć kolumnę z 8 ml buforu A, 8 ml buforu B i 8 ml buforu A w tej kolejności. Zastosować próbkę przygotowaną w kroku 4.1 protokołu. Przemywać buforem A, aż podstawowa absorpcja optyczna przy 280 nm osiągnie 1000–500 mAU.
   4. Zastosować mieszaninę A i B, tak aby stężenie AS wynosiło 33 % (w/v). Przemyć za pomocą 1 CV, co powoduje plateau na chromatogramie. Ustaw gradient buforu B (do 100% buforu B w czasie): 1,5 ml buforu B w 3,8 minuty (tj. 5,7% buforu B z nachyleniem 1% B/ml). Gdy sygnał UV o długości fali 280 nm wzrośnie, zacznij zbierać frakcję i natychmiast umieść ją na lodzie.
   5. Na koniec umyj kolumnę buforem B. Pobrać próbki wszystkich frakcji do analizy SDS-PAGE. Zamrozić wszystkie próbki przy użyciu ciekłego azotu i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
   6. Wykonaj analizę SDS-PAGE (i western blot), aby wykryć białko FAHD w pobranych frakcjach. Frakcje zawierające białko są łączone i poddawane dalszemu oczyszczaniu, zgodnie z opisem w poniższych krokach protokołu. Przemyć kolumnę_H2Oi 20% EtOH (w_H2O).

5. Oczyszczanie białek FAHD za pomocą chromatografii jonowymiennej

UWAGA: Cząsteczki z naładowanymi grupami funkcyjnymi są powiązane z kolumną cząstek krzemionki dla FPLC (Rysunek 3C). Umożliwia to różnicowanie białek w zależności od ich charakteru jonowego, takiego jak ładunek powierzchniowy. Opisane kroki powinny być wykonywane odpowiednio za pomocą maszyny FPLC i związanego z nią know-how. Opisana metoda jest taka sama dla chromatografii kationowej lub anionowej, ale, które należy zastosować, są nieco inne.

1. Wybierz system chromatografii kationowej lub anionowej. Ten wybór jest empiryczny i może się różnić w zależności od białek FAHD. Optymalnie obie metody mogą być stosowane kolejno.
2. Ustawić system FPLC i przepłukać kolumnę 5 CV 20% EtOH (w H₂O), a następnie 5 CV H₂O. Zrównoważyć kolumnę 1 CV buforu o niskiej zawartości soli, buforu o wysokiej zawartości soli i ponownie buforu o niskiej zawartości soli w tej sekwencji.
3. Nanieść próbkę (dializowaną w stosunku do właściwego buforu o niskiej zawartości soli z kroku 3.1.11) na kolumnę. Zbierz przepływ. Przemyć kolumnę przez 1 CV buforem o niskiej zawartości soli.
4. Ustaw elucję gradientową: 100% bufor o wysokiej zawartości soli w 30 minut przy natężeniu przepływu 1 ml/min lub 60 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Może to być ponownie wybrane na podstawie znanego już chromatogramu FPLC, w celu optymalizacji oczyszczania. Zbierz wszystkie ułamki pików.
   UWAGA: Warunki wysokiej zawartości soli mogą się różnić w zależności od białek FAHD, jak opisano w sekcji dyskusji.
5. Po zakończeniu gradientu należy uruchomić z buforem o wysokiej zawartości soli, aż nie zostaną wykryte żadne piki w zakresie 1 CV (zebrać frakcje).
6. Pobrać próbki wszystkich pobranych frakcji i przeprowadzić analizę SDS-PAGE (12,5% żel do biegania, 4% żel do układania). Zamrozić poszczególne próbki w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
7. Po zakończeniu analizy SDS-PAGE zebrać próbki zawierające białko FAHD i odrzucić pozostałe. Opcjonalnie należy zagęścić białko za pomocą ultra-wirujących jednostek filtrujących.
8. Nałóż 1 ml 25% SDS w 0,5 M NaOH (lub innych detergentach) w celu oczyszczenia kolumny. Przemyć kolumnę_H2Oi 20% EtOH (w_H2O).
9. Opcjonalnie powtórzyć sekcję 5 z alternatywną kolumną (chromatografia kationowa lub anionowa). Białko uzyskane tą metodą jest wystarczająco czyste, aby przeprowadzić testy aktywności podstawowej lub może być stosowane w testach przesiewowych do krystalografii. W przypadku zaawansowanych aplikacji przejdź do sekcji 6.

6. Oczyszczanie białek FAHD za pomocą chromatografii wykluczającej (SEC)

UWAGA: Porowate cząstki w kolumnie z żelu krzemionkowego dla FPLC umożliwiają różnicowanie białek w zależności od wielkości cząsteczki, takiej jak promień hydrodynamiczny (Rysunek 3D). Opisane kroki należy wykonać za pomocą systemu FPLC, z wykorzystaniem kolumn SEC.

1. Wybierz kolumnę SEC, w zależności od masy cząsteczkowej nadal obecnych zanieczyszczeń, wykrytych za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem. Przedstawiona metoda jest odpowiednia dla obu kolumn. Przemyć kolumnę przez noc 400 ml_H2Oi zrównoważyć z buforem do pracy SEC. Zaleca się napisanie programu dla systemu FPLC, aby zautomatyzować ten krok.
2. Dodaj 1 mM DTT do 300 ml buforu do biegania SEC i umieść go na lodzie. To jest uruchomiony bufor. Nanieść 60 ml tego buforu na kolumnę.
3. Odwirować próbkę białka (10 000 x g przez 10 minut) w celu usunięcia wszelkich mikrowytrąceń. Nałożyć supernatant na kolumnę. Ogólnie zaleca się filtrowanie supernatantu przed FPLC.
4. Zastosuj uruchomiony bufor do kolumny, aż całe białko zostanie wymyte. Zebrać wszystkie piki we frakcjach o odpowiedniej objętości (np. 2 ml). Pobrać próbki do SDS-PAGE i zamrozić wszystkie frakcje za pomocą ciekłego azotu. Zamrożone frakcje przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Po analizie SDS-PAGE (i western blot) zebrać i połączyć wszystkie frakcje zawierające białko FAHD. Barwienie srebrem jest zalecane w celu wykrycia drobnych zanieczyszczeń, które mogą być nadal obecne.
6. Użyj jednostek filtrujących do ultrawirowania w celu zagęszczenia białka. Chociaż nie jest to obowiązkowe w przypadku białek FAHD, ogólnie rzecz biorąc, etap odsalania (np. przez dializę) jest zalecany w przypadku testów enzymatycznych i krystalizacji.
7. Powtórz kroki 6.3–6.6 kilka razy z różnymi prędkościami przepływu i stężeniami soli (empirycznie) w celu zwiększenia czystości białka FAHD. Przemyć kolumnę przez noc_H2Oi 20% EtOH (w_H2O).

7. Podstawowe testy aktywności FAHD z substratami szczawiooctanu i acetylopirogronianu

UWAGA: Białko FAHD 1 (FAHD1) wykazuje aktywność dekarboksylazy szczawalooctanu (ODx) i hydrolazy acylopirogronianu (ApH). Jest to opisane bardziej szczegółowo w sekcji dyskusji. Ze względu na destabilizację przez tautomeryzację keto-enolu w roztworze wodnym (tj. Enolizację), szczawiooctan rozpada się samoistnie w czasie (autodekarboksylacja) w funkcji stężenia kofaktora i pH. Przy pH około 7 i temperaturze 25 °C efekt ten nie jest dramatyczny, ale testy muszą być ślepe, aby uwzględnić zarówno autodekarboksylację, jak i stężenie enzymu. Schemat pipetowania jest opisany w Rysunek 4A. Ogólnie rzecz biorąc, do tego testu zaleca się używanie dobrze skalibrowanych pipet, ponieważ są one dość wrażliwe na drobne błędy pipetowania.

Rysunek 4: Szkic schematu pipetowania do testów enzymatycznych.
(A) Naszkicowany schemat pipetowania dla podstawowych testów enzymatycznych białkowych FAHD opartych na substratach. Ślepa próba podłoża: -S/-E; próbka podłoża: +S/-E; ślepa próba enzymatyczna: -S/+E; próbka enzymu: +S/+E (S: substrat, E: enzym). Aby uzyskać więcej informacji, zobacz krok 7 protokołu. (B) Szkicowany schemat pipetowania do oceny kinetyki Michaelisa-Mentena białka FAHD. Ślepa próba podłoża: -S/-E; próbka podłoża: +S/-E; ślepa próba enzymatyczna: -S/+E; próbka enzymu: +S/+E (S: substrat, E: enzym). Więcej informacji można znaleźć w sekcji 8 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Uruchomić czytnik mikropłytek i równoważyć przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Ustawić program do odczytu 12 dołków (zgodnie z opisem w Rysunek 4A) przy długości fali 255 nm. Zaleca się stosowanie 25 wielokrotnych odczytów z opóźnieniem czasowym 5 ms. Ustaw cykl tak, aby mierzył 15 razy co 2 minuty (łącznie 30 minut).
2. Domyślnie należy przygotować bufor do oznaczania enzymów (patrz tabela materiałów) z 1 mM MgCl₂ przy pH 7,4. Wariant białek FAHD może wymagać różnych kofaktorów lub poziomów pH. Mg²⁺ i Mn²⁺ są znanymi kofaktorami dla FAHD1^3,11,12,21.
3. Utworzyć roztwór białkowy o stężeniu 1 μg/μl, rozcieńczając go buforem do oznaczania enzymów (tabela materiałów).
4. Ustawić 1 ml 20 mM roztworu substratu, który ma być badany (do tej pory zidentyfikowane substraty białek FAHD są wymienione gdzie indziej³) w buforze do testów enzymatycznych.
5. Zgodnie ze schematem pipetowania wyświetlanym w Rysunek 4A, przygotuj ślepą próbę enzymu i dołki na próbki: odpipetuj 90 μl buforu do oznaczania enzymów (tabela materiałów) do studzienek z 5 μl (5 μg) roztworu enzymu.
6. Zgodnie ze schematem pipetowania wyświetlanym w Rysunek 4A, przygotuj ślepą próbę substratu i studzienki na próbki: odpipetuj 95 μl buforu do testu enzymatycznego do studzienek.
7. Tuż przed pomiarem nanieść 5 μl buforu do oznaczania enzymów do sześciu ślepych studzienek. Nanieść 5 μl roztworu substratu o stężeniu 20 mM na dołki na próbki. Zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej.
8. Użyj pipety wielokanałowej o natężeniu 50 μl, aby delikatnie wymieszać wszystkie dołki. Zacznij od półfabrykatów i kontynuuj z dołkami na próbki. Uważaj, aby nie tworzyć żadnych bąbelków. Włóż płytkę do czytnika mikropłytek i zmierz każdą studzienkę przy długości fali 255 nm (zgodnie z opisem w kroku 7.1).
9. Wykonaj analizę w arkuszu kalkulacyjnym. Skopiuj surowe dane z fotometru do arkusza kalkulacyjnego i zapisz wszystkie ustawienia (tj. całą dokumentację) w innym arkuszu. Uśrednić dane z trzech dołków każdego z czterech preparatów. Odjąć ślepą próbę od próbki. Oblicza się również odchylenia standardowe i sumuje odchylenia ślepej próby i próbki.
10. Wykreśl te dane (y: gęstość optyczna, x: czas w min). Powinna zostać wyświetlona krzywa malejąca wykładniczo. W zależności od rodzaju używanego podłoża można zaobserwować początkowy wzrost w ciągu pierwszych 10 minut, po którym sygnał słabnie. Przypisuje się to tautomeryzacji keto-enolu substratu, jak opisano bardziej szczegółowo w sekcji dyskusji.
11. Podziel dane sygnału optycznego w czasie przez maksymalną wartość wykresu, aby przeskalować dane w dół do zakresu [0, 1] (przykład znajduje się w Rysunek 5A). Zidentyfikuj zakres liniowy krzywej, zaczynając od początkowego spadku, i oblicz ujemne nachylenie (1/min).
12. Przebieg w czasie spadku OD jest związany z substratem poprzez jego początkowe stężenie: 100 nmol/studzienkę * nachylenie. Na podstawie oszacowanego stężenia białka c₀ oblicza się aktywność właściwą: 100 nmol/studzienkę * nachylenie * 1/c₀. Wyrażając c₀ w μg/basenie, obliczona w ten sposób aktywność właściwa jest wyrażona za pomocą jednostki nmol/min/μg, która jest równa μmol/min/mg.

8. Ocena kinetyki Michaelisa-Mentena białek FAHD

UWAGA: Ocena kinetyki Michaelisa-Mentena białek FAHD jest żmudna, ponieważ specyficzna aktywność białka zależy zarówno od względnego stężenia białka-substratu, jak i od objętości fizycznej, w której zachodzi reakcja. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy ustalić kinetykę stanu ustalonego. Przetestowany protokół na 96-dołkowej przezroczystej płycie UV jest opisany w poniższych krokach. Każdy krok musi być wykonany z dużą starannością, ponieważ drobne błędy zwykle psują eksperyment. Zaleca się opanowanie testów opisanych w sekcji 7 przed przystąpieniem do bardziej skomplikowanego testu opisanego poniżej.

Rysunek 5: Przykładowe wyniki testów enzymatycznych.
(A) Przykładowa krzywa absorpcji UV uzyskana dla podstawowych testów enzymatycznych białek FAHD opartych na substratach (znormalizowanych w zakresie od 0 do 1) z odchyleniem standardowym. Stosunek gęstości optycznej (OD) [OD(t)/OD(0)] w dowolnym momencie t [OD(t)] jest normalizowany do początkowej średnicy zewnętrznej [t = 0; OD(0)]. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 7 protokołu. (B) Przykładowa kinetyka Michaelisa-Mentena ludzkiego białka FAHD1 z odchyleniem standardowym. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 8 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Uruchomić czytnik mikropłytek i równoważyć przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Ustawić program do odczytu 72 dołków (zgodnie z opisem w Rysunek 4B) przy długości fali 255 nm. Zaleca się stosowanie 25 wielokrotnych odczytów z opóźnieniem czasowym 5 ms. Ustaw cykl tak, aby mierzył 15 razy co 2 minuty (łącznie 30 minut).
2. Wykonaj kroki 7.2 i 7.3. Następnie umieść 1 ml 100 mM roztworu substratu w buforze do testów enzymatycznych.
3. Przygotować rozcieńczenia roztworu substratu w buforze do oznaczania enzymów: 40 mM, 20 mM, 10 mM, 6 mM, 4 mM, 2 mM. Test przeprowadza się z parami ("dostosowanymi") stężeniami enzymu/substratu. W tym celu należy przygotować następujące rozcieńczenia roztworu enzymatycznego w buforze do oznaczania enzymów: 0,5 μg/μL, 0,4 μg/μL, 2,5 μg/μL, 2 μg/μL, 1,5 μg/μL, 1 μg/μL.
4. Do wszystkich studzienek przedstawionych w Rysunek 4B nałóż 180 μl buforu do oznaczania enzymów. Nałożyć 10 μl buforu do oznaczania enzymów do wszystkich studzienek dla substratu (ślepa próba i próbka). Nałożyć 10 μl przygotowanej serii rozcieńczeń białka do studzienek dla enzymu (ślepa próba i próbka). Nałożyć 10 μl buforu do oznaczania enzymów do wszystkich studzienek dla studzienek dla ślepej próby substratowej i ślepej próby enzymatycznej.
5. Bezpośrednio przed pomiarem należy nanieść 10 μl przygotowanej serii rozcieńczeń substratu do studzienek dla próbki substratu i próbki enzymu.
6. Użyj pipety wielokanałowej o nastawach 50 μl, aby delikatnie wymieszać wszystkie dołki, zaczynając od ślepych próbek, przechodząc do dołków na próbki. Uważaj, aby nie tworzyć żadnych bąbelków.
7. Włożyć płytkę do czytnika mikropłytek i zmierzyć każdą studzienkę przy długości fali 255 nm, jak opisano w kroku 8.1. Wykonaj analizę w arkuszu kalkulacyjnym. Skopiuj surowe dane z fotometru do arkusza kalkulacyjnego, zapisz wszystkie ustawienia (tj. całą dokumentację) w innym arkuszu.
8. Przeprowadzić indywidualną analizę danych dla każdego punktu w serii rozcieńczeń, jak opisano w krokach 7.11–7.14. Ostatecznie uzyskaj wszystkie określone działania i wykreśl w stosunku do początkowego stężenia substratu: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM.
9. Wyświetla wszystkie punkty danych z indywidualnymi odchyleniami standardowymi. Komputerowa kinetyka Michaelisa-Mentena za pomocą nieliniowego dopasowania krzywej lub za pomocą analizy Lineweavera-Burka. Może być konieczne ponowne zmierzenie poszczególnych punktów i dostosowanie indywidualnych stosunków par stężenie białka/substratu w krokach 8.5 i 8.6. Diagram Michaelisa-Mentena dla ludzkiego FAHD1 znajduje się w Rysunek 5B.

9. Krystalizacja białek FAHD

UWAGA: Krystalizacja białek FAHD (ludzki FAHD1 opisany wcześniej¹⁵) może być osiągnięta metodą dyfuzji pary w formacie 24-dołkowym (Rysunek 6A). Protokół krok po kroku dotyczący krystalizacji ludzkiego FAHD1 przy użyciu tej techniki jest przedstawiony poniżej¹⁵. Bardziej szczegółowy opis znajduje się w sekcji dyskusji.

Rysunek 6: Krystalizacja białek FAHD.
(A) Płytki krystalizacyjne w standardowym 24-dołkowym lub 96-dołkowym śladzie SBS. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 9. (B) Podstawowy proces ustawiania płytki w krystalizacji białek FAHD. Ten rysunek został przerysowany za zgodą²³. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 9. (C) Ludzkie kryształy FAHD1 i odpowiadające im wzory dyfrakcyjne (małe wstawki). Najbliższy odstęp między sieciami jest wskazany we wkładkach jako miara jakości dyfrakcyjnej kryształów. Niższe liczby oznaczają wyższą rozdzielczość, a tym samym więcej informacji. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 9 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Upewnij się, że białko jest dializowane w buforze działającym SEC. Białko FAHD1 powinno być dostępne w wysokich stężeniach (2-5 mg/ml). W niższych stężeniach białko może nie krystalizować z powodu braku spontanicznego zarodkowania.
2. Przygotować ≥20 ml roztworu zbiornika do krystalizacji. Przygotować trzy roztwory podstawowe, używając wody destylowanej lub dejonizowanej jako rozpuszczalnika: 1 M Na-HEPES (minimum 25 ml, dostosowany do pH 7,5), 50% (w/v) glikolu polietylenowego 4000 (PEG4k) (minimum 65 ml) i 1 M MgCl₂ (10 ml).
3. Ustaw siatkę 4 x 6 (łącznie 24) różnych probówek o pojemności 15 ml. Oznacz je zgodnie z odpowiednimi pozycjami na tabliczce (np. rząd (A, B, C, D) vs. kolumna (1–6), np. "A1", "B5", "D6" itp.). Odpipetować 1 ml 1 M Na-HEPES do każdej probówki.
4. Odpipetować 1 ml 50% (w/v) PEG4k do rzędu A probówek, 2 ml do rzędu B, 3 ml do rzędu C i 4 ml do rzędu D. Odpipetować 100 μL 1 M MgCl₂ do kolumny 1 probówek, 250 μL do kolumny 2, 500 μL do kolumny 3, 1,0 ml do kolumny 4, 1,5 ml do kolumny 5 i 2,0 ml do kolumny 6.
5. Napełnij wszystkie probówki do objętości 10 ml wodą destylowaną lub dejonizowaną, jeśli skala na probówkach jest wystarczająco dokładna.
6. Pobrać ludzką próbkę białka FAHD1 (~5 mg/ml) z lodówki (lub z lodu) i odwirować z maksymalną prędkością za pomocą wirówki stołowej w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut. Jeżeli pożądana jest kokrystalizacja ze szczawianami, należy dodać szczawian z roztworu podstawowego, tak aby próbka białka zawierała końcowe stężenie szczawianów wynoszące 2 mM. Nałożyć 1 mM DTT i przechowywać na lodzie.
7. W międzyczasie rozpakuj 24-dołkową płytkę krystalizacyjną, najlepiej w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 18 °C. Rozprowadź cienką warstwę oleju parafinowego na krawędzi każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą cienkiego szklanego lub plastikowego pręta. Dodać 800 μl przygotowanych koktajli krystalizacyjnych (A1 do D6) do każdego odpowiedniego dołka płytki krystalizacyjnej.
8. Umieść świeże szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm na czystej powierzchni. Unikaj zanieczyszczania szkiełek nakrywkowych brudem lub kurzem. W razie potrzeby usuń wszelkie zanieczyszczenia z szkiełka nakrywkowego za pomocą sprężonego powietrza lub sprayu do kurzu.
9. Po zakończeniu wirowania należy unikać potrząsania próbką białka, aby odwirowane agregaty i zanieczyszczenia na dnie probówki nie unosiły się ponownie na powierzchni. W kolejnych krokach należy odpipetować próbkę białka znajdującą się tuż pod powierzchnią roztworu, aby uniknąć mieszania agregatów i osadów od dołu.
10. Dla każdej studzienki (patrz Rysunek 6B) odpipetować 1 μl roztworu białka na środek szkiełka nakrywkowego i dodać 1 μl odpowiedniego koktajlu z zbiornika do kropli białka, unikając pęcherzyków. Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i umieść je na górze studzienki, tak aby olej uszczelnił studnię z szkiełkiem nakrywkowym szczelnie. Powtarzaj tę czynność, aż płytka 24-dołkowa zostanie ukończona.
11. Przechowywać płytkę w temperaturze 18 °C i obserwować krople zgodnie z harmonogramem progresywnym za pomocą odpowiedniego mikroskopu. Ludzkie kryształy FAHD1 zwykle pojawiają się z dnia na dzień (patrz Rysunek 6C).

Results

Zaczynając od przygotowanego wektora klonowania i zakupionego BL21(DE3) pLysS E. coli, plazmid jest wprowadzany do bakterii za pomocą szoku termicznego lub innej odpowiedniej alternatywnej metody (Rysunek 1). Po krótkim okresie amplifikacji przekształcone bakterie są umieszczane na płytkach agarowych LB, aby rosły przez noc. Tablice w tym momencie mogą wyglądać inaczej, w zależności od różnych potencjalnych źródeł błędów. Płytki mogą być puste (tj. bez kolonii), całkowicie zarośnięte bakteriami lub czymś pomiędzy. Dwa przykłady płytek agarowych LB po optymalnej i nieoptymalnej transformacji przedstawiono na Rysunek 7A. Zbyt wiele kolonii bakteryjnych wskazuje, że albo zbyt wiele bakterii zostało posianych (prawdopodobnie), albo że stosowane antybiotyki mogą być przeterminowane (mało prawdopodobne). Zbyt mała liczba kolonii bakteryjnych może wskazywać, że albo do transformacji nie użyto wystarczającej ilości plazmidu (następnym razem użyj więcej), albo że do selekcji bakterii użyto zbyt dużej ilości antybiotyków. W każdym razie, jeśli kolonie są obecne, powinny być w porządku, ponieważ użycie dwóch selektywnych antybiotyków oznacza raczej znikomą szansę na wzrost nieprzekształconych bakterii. Brak kolonii w ogóle wskazuje, że albo bakterie utraciły swoją zdolność do transformacji (z powodu niewłaściwego przechowywania lub przechowywania przez dłuższy czas, powtarzającego się zamrażania i rozmrażania itp.), szok cieplny nie powiódł się (brak wychwytu plazmidu lub śmierć bakterii z powodu zbyt dużej temperatury), wektor klonowania jest uszkodzony lub przez pomyłkę zastosowano niewłaściwy zestaw selektywnych antybiotyków (sprawdź gen oporności na wektorze plazmidowym).

Rysunek 7: Reprezentatywne wyniki dla transformacji bakterii i IMAC.
(A) Reprezentatywne płytki agarowe LB z przekształconym BL21(DE3) E. coli, otrzymane zgodnie z krokiem 1.1 protokołu. Po lewej: Talerz z dobrze rozmieszczonymi koloniami (przykład pozytywny). Po prawej: Płytka z tylko jedną pojedynczą kolonią (przykład negatywny). Białe kółka oznaczają dobre kolonie. Czerwonym kółkiem oznaczono kolonie, które rosną zbyt blisko siebie i nie powinny być zbierane, o ile dostępne są izolowane kolonie. (B) 12,5% analiza SDS-PAGE akryloamidu w serii kontroli indukcyjnych ("-" oznacza przed indukcją IPTG; "+" oznacza po indukcji IPTG, przed zbiorem granulek), dostosowana do równych ilości białka całkowitego. Jest to opisane w kroku 1.2. (C) Przykładowa analiza 12,5% akrylamidu SDS-PAGE oczyszczania Ni-NTA z białka FAHD1 znakowanego His. Jest to opisane w sekcji 3 protokołu. W chromatografii powinowactwa uzyskuje się białko o wysokiej czystości (>70%, strzałka), jednak obserwuje się również kilka niewielkich zanieczyszczeń (czerwone strzałki). Zanieczyszczenia te składają się z białek innych niż FAHD, które wiążą się z kolumną, oraz z białek, które wiążą się z białkiem FAHD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zatwierdzone kolonie są wybierane i wybierane. Po amplifikacji w pożywce odżywczej ekspresja białka jest wyzwalana przez zastosowanie substancji chemicznej IPTG. Osad bakteryjny zawierający wyrażone białko w ilościach miligramowych jest zbierany, a jego ekspresja jest weryfikowana za pomocą SDS-PAGE (patrz na przykład Rysunek 7B). Podczas tego skądinąd prostego procesu mogą wystąpić pewne problemy. Po pierwsze, niektóre białka tworzą ciała inkluzyjne, ponieważ najwyraźniej w jakiś sposób zakłócają naturalny metabolizm bakterii gospodarza. Zaobserwowano to w przypadku niektórych mutacji punktowych ludzkich FAHD1 i FAHD2. W takich przypadkach inne systemy ekspresji, takie jak komórki owadów, mogą być bardziej odpowiednie i powinny być brane pod uwagę. Na przykład po zebraniu osadu z komórek owadów oczyszczanie białek przebiega zgodnie z tymi samymi krokami, które opisano w niniejszym protokole. Po drugie, czasami okazuje się, że system DE3-pET jest "nieszczelny" (tj. białko jest już do pewnego stopnia eksprymowane przed indukcją IPTG). Potencjalna przyczyna tego zjawiska nie jest dobrze poznana, ale może pomóc w powolnej ekspresji białka przez noc w inkubatorze w chłodni. Po trzecie, nie ulega ekspresji żadne białko. Jest to prawdopodobnie najgorszy scenariusz, ponieważ prawdopodobnie wskazuje na uszkodzony wektor plazmidu i dlatego zaleca się sekwencjonowanie plazmidu.

Jeśli do znakowania białka użyto znacznika His, chromatografia powinowactwa z agarozą Ni-NTA jest łatwą i tanią metodą wychwytywania, eliminującą większość zanieczyszczeń (Rysunek 7C). Podobne metody istnieją dla innych systemów znaczników (np. STREP-II). Jeśli nie użyto żadnego znacznika, połączenie wytrącania siarczanu amonu i następującej po sobie hydrofobowej chromatografii wymiennej może również oddzielić białko od większości innych białek (Rysunek 8A). Jednak porównując te dwie metody (Rysunek 7C vs. Rysunek 8A), wyższość metod Ni-NTA można wykazać za pomocą analizy SDS-PAGE. Dlatego zaleca się stosowanie białka znakowanego przez Hisa.

Rysunek 8: Reprezentatywne wyniki dla eksperymentów FPLC (HIC, wymiana jonowa, SEC).
(A) Typowy chromatogram i 12,5% analiza SDS-PAGE akryloamidu chromatografii HIC-fenylowej po wytrąceniu siarczanu amonu (AS) nieznakowanego białka FAHD1, jak opisano w sekcji 4 protokołu. Zielona linia odzwierciedla gradient bufora B, który nie zawiera AS. Podczas tego procesu AS jest stopniowo wypłukiwany z systemu. Porównanie tego panelu z Rysunek 7C pokazuje moc chromatografii powinowactwa Ni-NTA w porównaniu z metodą HIC-phenyl oraz zalety stosowania systemu His-tag do oczyszczania białek. (B) Przykładowy chromatogram i analiza SDS-PAGE 12,5% akrylamidu w chromatografii kationowej wymiennej FAHD znakowanego Hisem po oczyszczeniu Ni-NTA. Za pomocą gradientu soli nałożona próbka jest rozdzielana na poszczególne białka. (C) Przykładowy chromatogram i analiza SDS-PAGE 12,5% akryloamidu SDS-PAGE chromatografii wykluczającej wielkości G75 FAHD znakowanego Hisa po chromatografii kationowej wymiennej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kolejno, białko jest dalej oddzielane od resztek zanieczyszczeń przez chromatografię kationowo-anionowymienną (na przykład, zobacz Rysunek 8B), a następnie chromatografię wykluczającą rozmiar (na przykład zobacz Rysunek 8C). Zaleca się ustalenie początkowej strategii oczyszczania w tej kolejności; Jednakże kolumny te powinny być używane w połączeniu, następnie i w odmianie, aż białko będzie wystarczająco czyste.

Proste testy aktywności, w celu sprawdzenia decyzji "tak lub nie" dotyczących aktywnych substratów i/lub kofaktorów, mogą być wykonywane z białkami znakowanymi Hisem po oczyszczeniu Ni-NTA lub białkami nieoznakowanymi po kolumnie wymiany jonowej. Specyficzne działania i stałe kinetyczne muszą być określone dla białka o najwyższej czystości. Można próbować krystalizować białka po kolumnie jonowej, ale jakość kryształów prawie zawsze koreluje z czystością białka. Przeciwciała poliklonalne mogą być wytwarzane przeciwko białkom na każdym etapie protokołu oczyszczania; Jednak w tym przypadku jakość również koreluje z czystością białka.

Discussion

Kroki krytyczne

Białka FAHD są bardzo wrażliwe na stężenia soli. Przy niskich stężeniach NaCl białka mogą wytrącać się po rozmrożeniu, ale zwykle można je w pełni odtworzyć przy wyższych stężeniach soli. Oznacza to, że jeśli białko FAHD z jakiegoś powodu wytrąca się, może zostać odzyskane lub ponownie sfałdowane przy wyższych stężeniach soli (>300 μM). Niektóre bardziej hydrofobowe białka mogą jednak nie zostać odzyskane (na przykład ludzki FAHD2), ale detergenty, takie jak CHAPS (maksymalnie 1%) lub glicerol (10%), mogą być używane do utrzymywania ich w stabilnym roztworze. W każdym przypadku zaleca się szokowe zamrażanie przy użyciu ciekłego azotu i przechowywanie w temperaturze -80 °C, ponieważ jest to delikatny i powolny proces rozmrażania.

Podczas oczyszczania Ni-NTA w kroku 3.1.10 mogą wystąpić pewne nieoczekiwane problemy. Warto zauważyć, że wyższy OD w drugiej pobranej próbce niż w pierwszej próbce wskazuje na zbyt dużą objętość żywicy agarozowej (zwróć uwagę i użyj mniej żywicy w następnym eksperymencie). Również sama żywica agarozowa prowadzi do sygnału OD przy 280 nm (tj. rozerwanie złoża żywicy agarozowej da sztuczne sygnały). W razie wątpliwości zaleca się zastosowanie innych metod, takich jak test Bradforda lub BSA w celu określenia stężeń białka.

W testach enzymatycznych należy wziąć pod uwagę trzy krytyczne aspekty. Po pierwsze, ocena stężenia białka ma kluczowe znaczenie dla uzyskania prawidłowych określonych czynności. Poziom czystości białka ma wpływ na wynik i należy go oszacować. W przypadku znakowanego białka należy obliczyć masę części znacznikowej, a specyficzna aktywność musi zostać odpowiednio skorygowana. W przypadku prostych testów opisanych w sekcji 7 protokołu czystość Ni-NTA jest wystarczająca do rozróżnienia aktywnych i nieaktywnych substratów, kofaktorów itp. W przypadku bardziej złożonej kinetyki Michaelisa-Mentena wszystkie stężenia reagentów i substratów muszą być prawidłowo określone. Zwłaszcza w przypadku stosowania szczawiooctanu (który z czasem ulega autodekarboksylacji) enzymatyczna część reakcji musi zostać skorygowana pod kątem autodekarboksylacji (przy założeniu, że obie reakcje zachodzą jednocześnie). Należy wziąć pod uwagę początkowe zmiany w sygnale gęstości optycznej skierowanym do tautomeryzacji keto-enolu substratu. Po trzecie, należy dostosować stężenia i objętości. Reakcja z określonymi stężeniami enzymu i substratu może dawać różne wyniki w zależności od objętości testu. Jeśli w studzience jest za dużo enzymu, przyleganie cieczy może w rzeczywistości zniekształcić wynik.

W celu oceny kinetyki Michaelisa-Mentena zaleca się przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w partiach 100 μL, 200 μL i 300 μL w celu znalezienia optymalnej kombinacji. Podobne aspekty dotyczą stosunku stężeń enzymatycznych do substratów w testach kinetycznych. Zbyt dużo enzymu na substrat lub zbyt dużo substratu na enzym umieszcza system poza liniowym zakresem Michaelisa w stanie ustalonym. Aby zoptymalizować te warunki, wymagane są wstępne eksperymenty. Przykładowe dostosowanie dla ludzkiego białka FAHD1 (typu dzikiego) przedstawiono w sekcji 8, co skutkuje diagramami kinetycznymi (jak pokazano na przykład na rysunku 5B).

W celu krystalizacji kroplę roztworu białkowego pipetuje się do środka szkiełka nakrywkowego i miesza z kroplą koktajlu krystalizacyjnego, który zwykle składa się z buforu (np. Tris-HCl, HEPES) i środka strącającego (np. glikolu polietylenowego, siarczanu amonu). Opcjonalnie można zastosować kroplę roztworu inhibitora do kokrystalizacji (takiego jak szczawian w tym protokole). Szkiełko nakrywkowe umieszcza się następnie do góry nogami nad studzienką zbiornika zawierającego koktajl krystalizacyjny, uszczelniając studnię szczelnie za pomocą oleju uszczelniającego (ryc. 6B). Idealnie byłoby, gdyby na początku eksperymentu w kropli nie zachodziło wytrącanie, co oznacza, że białko pozostaje w roztworze. Ponieważ stężenie środka strącającego w zbiorniku jest wyższe niż w kropli, kropla zaczyna tracić wodę poprzez parowanie do atmosfery studni, aż do osiągnięcia równowagi ze zbiornikiem. Dyfuzja wody do zbiornika powoduje powolny spadek objętości kropli, co z kolei powoduje wzrost stężenia zarówno białka, jak i strącania w kropli. Jeśli roztwór białka osiągnie wymagany stan przesycenia, a tym samym metastabilności, może dojść do spontanicznego zarodkowania, po którym następuje wzrost kryształów. Osiągnięcie stanu przesycenia jest koniecznym, ale niewystarczającym warunkiem krystalizacji. Krystalizacja białek wymaga zarówno korzystnych warunków termodynamicznych, jak i kinetycznych i w dużym stopniu zależy od nieprzewidywalnych właściwości białka, które ma zostać skrystalizowane²².

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Ekspresja białka w E. coli może być nieefektywna. Różne stężenia IPTG, temperatura ekspresji i czas amplifikacji, takie jak temperatura pokojowa przez kilka godzin lub w zimnym pomieszczeniu przez noc, mogą wymagać przetestowania dla każdego nowego białka w celu znalezienia optymalnych warunków. Wytrącanie się białka w ciałach inkluzyjnych jest czasami obserwowane w przypadku bardziej hydrofobowych białek FAHD. W takich przypadkach zalecana jest ekspresja białek w innych systemach modelowych, takich jak komórki owadów, ponieważ prawdopodobieństwo powstania ciał inkluzyjnych^{jest mniejsze 26}.

Ponieważ białka FAHD są wrażliwe na stężenia soli i kofaktorów, a także pH, strategie oczyszczania dla różnych homologów, ortologów i wariantów mutacji punktowych mogą się różnić w zależności od ustawienia. Opisane metody oczyszczania zostały opracowane dla ludzkiego i mysiego białka FAHD1 typu dzikiego. Stężenia substancji chemicznych, takich jak NaCl i imidazol, a także pH, mogą wymagać dostosowania do poszczególnych białek o różnym punkcie izoelektrycznym (pI). Warto również zauważyć, że nie każde białko znakowane Hisem może dobrze wiązać się z żywicą Ni-NTA. Jeśli wiązanie białek z kolumną Ni-NTA jest nieefektywne, dostosowane stężenia NaCl i imidazolu, a także zmienne warunki pH w buforze biegowym Ni-NTA mogą pomóc w poprawie jakości wyniku. Jeśli nie, pominięcie etapu Ni-NTA i przejście do etapu chromatografii jonowej może również prowadzić do skutecznej strategii oczyszczania. Jeśli białko wiąże się z kolumną Ni-NTA, ale nie może zostać wymyte z kolumny, dodanie pewnej ilości mM EDTA może pomóc w zakłóceniu kompleksu Ni²⁺ .

Jeśli chodzi o proces krystalizacji, należy zrozumieć, że samoorganizacja dużych i złożonych cząsteczek białka w regularną sieć okresową jest z natury mało prawdopodobnym procesem, który w dużym stopniu zależy od trudnych do kontrolowania parametrów kinetycznych. Nawet niewielkie zmiany w konfiguracji używanej do krystalizacji mogą radykalnie zmienić wynik i nie utworzą się żadne kryształy. Czystość białka ma na ogół ogromne znaczenie. Z reguły mocno przeciążony żel SDS-PAGE nie powinien pokazywać innych pasm. Również kolejność, w jakiej wykonywane są kroki, może mieć wpływ na wynik. Na przykład, aby zapewnić odtwarzalność, często konieczne jest utrzymanie takiej samej sekwencji pipetowania, następnie najpierw dodanie białka, a na końcu dodanie środka strącającego do kropli krystalizacji (lub odwrotnie). Niezależnie od zastosowanej metody, należy zachować tę samą wartość przy próbie odtworzenia lub zwiększenia skali eksperymentów. Jeśli zgodnie z tym protokołem nie zaobserwuje się żadnych kryształów, skład chemiczny strącacza, pH, wielkość kropli i stosunek białka do osadu mogą być zmieniane w małych przyrostach. Cierpliwość i konsekwentne obserwacje kropli są cnotą.

Uwagi do mechanizmów katalitycznych FAHD1

Przedstawione metody zostały opracowane specjalnie w celu uzyskania białek FAHD1 o wysokiej jakości. Umożliwiło to wzrost kryształów FAHD1, a także inżynierię kryształów zawierających FAHD1 skompleksowanych do inhibitora (szczawian, PDB:6FOG). Struktury rentgenowskie zapewniają architekturę 3D wnęki katalitycznej enzymu. Wyniki te stanowią kompleksowy opis reszt potencjalnie ważnych dla mechanizmów katalitycznych tego intrygującego enzymu. FAHD1 został po raz pierwszy opisany jako zdolny do rozszczepiania acylopirogronianów (acetylopirugronian, fumarylpirogronian)¹¹. Później stwierdzono, że FAHD1 działa również jako dekarboksylaza szczawiooctanu¹². Chociaż substraty acylopirogronian i szczawiooctan są różnymi ugrupowaniami chemicznymi, przemiany chemiczne dzielą mechanistycznie strategiczne rozszczepienie wspólnego pojedynczego wiązania C^{3-C 4}, co jest energetycznie ułatwione, jeśli orbitale wiązania C^{3-C 4} pozostają prostopadłe do π-orbitali C 2-karbonylu¹⁵. Taka konformacja pozwala na stabilizację rezonansową 3-karbanionu C przejściowo powstałego podczas procesu rozszczepienia. Substraty FAHD1 (szczawiooctan i acylopirogronian) są elastycznymi cząsteczkami i mogą występować w formach tautomerycznych (keto-enol), a także w formach uwodnionych^C2 (ryc. 9A). Równowaga między różnymi gatunkami zależy głównie od rodzaju zastosowanego składu buforowego, pH i obecności jonów metali. Poniżej omawiamy hipotetyczne scenariusze mechanistyczne zainspirowane analizą struktur krystalicznych promieniowania rentgenowskiego, które ujawniły centrum katalityczne FAHD1.

Rysunek 9: Szczegóły dotyczące proponowanego mechanizmu katalitycznego FAHD1 u człowieka.
(A) Szczawiooctan występuje w stanie krystalicznym, jak również w roztworze obojętnym, głównie w formie Z-enolu²⁴. Jednak w fizjologicznych warunkach pH forma 2-keto jest dominującą reprezentacją²⁵. (B) Szkic chemiczny jamy¹⁵ hFAHD1 ze szczawiooctanem związanym Mg (po lewej) i acylopirogronianem (po prawej, z R¹ jako spoczynkiem organicznym; czerwona strzałka oznacza atak nukleofilowy sąsiedniej ustabilizowanej cząsteczki wody) (patrz dyskusja). (C) Porównanie preferowanych konformacji dla rozszczepienia C^{3-C 4} w mechanizmie dekarboksylazy (b do c) i hydrolazy (b' do c) FAHD1: oba procesy prowadzą do powstania Mg-skompleksowanego pirogronianu-enolanu (patrz dyskusja). Oczekuje się, że półprodukty b i b' zostaną ustabilizowane przez Q109, jak naszkicowano w panelu B (patrz dyskusja). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aktywność dekarboksylazy FAHD1

Szczawiooctan występuje w stanie krystalicznym, a także w roztworze obojętnym, głównie w postaci Z-enolu²⁴. Wykazano jednak, że w fizjologicznych warunkach pH (warunki buforowe przy pH 7,4) forma 2-keto jest dominującą reprezentacją szczawiooctanu²⁵ (ryc. 9A) i że enolizacja nie jest warunkiem wstępnym dekarboksylacji²⁷. Warto zauważyć, że jony^Mg2+ nie mają wpływu na stosunek gatunków szczawiooctanu przy pH 7,4 lub poniżej²⁸. Transpozycja formy keto szczawiooctanu do centrum katalitycznego FAHD1 (kierowana przez związany szczawian w skompleksowanym enzymie (PDB: 6FOG¹⁵)) ujawniła resztę Q109 jako regulator konformacyjny związanego szczawiooctanu¹⁵. Jak opisano w innym artykule¹⁵, wiązanie wodorowe z grupą karbamoilową Q109 stabilizuje konformację szczawiooctanu wynikającą z rotacji wokół wiązania C^{2-C 3} (Rysunek 9B, lewy panel). W wyniku tej rotacji wiązanie C^{3-C 4} (do rozszczepienia) przyjmuje dyspozycję zbliżoną do ortogonalnej względem π-orbitali C 2-karbonylu (rysunek 9C). Dwutlenek węgla może zostać uwolniony. Podstawowym produktem tego procesu byłby stabilizowany rezonansowo Mg-enolan pirogronianu. Z badań kompleksów szczawiooctanu szczawiowo-Mg wiadomo, że enolan tworzy najbardziej stabilny kompleks ^28,29. Zakładając porównywalną stabilność dla kompleksu enolanowo-pirogronianowego Mg, kofaktor FAHD1 może zostać zablokowany, ale reszta lizyny K123 może protonować enolan pirogronianu w równowadze, aby zapobiec utracie kofaktora¹⁵.

Podana interpretacja sugeruje, że enol pirogronianu jest odrębnym produktem pośrednim w katalitycznej funkcji ODx FAHD1. Na tym etapie hipotetycznego modelu dane eksperymentalne nie dostarczają żadnych dalszych wskazówek co do tego, dlaczego zamknięta pokrywa powinna się otworzyć w celu uwolnienia produktu. Można jednak wywnioskować, że proponowany mechanizm wygląda jak hamowanie enzymu przez produkt: struktura krystaliczna ujawnia konserwatywną cząsteczkę wody utrzymywaną w orientacji kierunkowej w kierunku centrum katalitycznego FAHD1 przez reszty H30 i E33 przedstawione w krótkiej helisie¹⁵, która jest indukowana po związaniu liganda i zamknięciu pokrywy. Gdyby pierwotny enol pozostał w równowadze z enolanem, stabilizowany rezonansowo enolan mógłby zostać stłumiony do pirogronianu przez cząsteczkę wody. Powstały hydroksyl byłby w stanie wyprzeć pirogronian z kofaktora Mg, na którym otworzyłaby się pokrywa. Na koniec centrum katalityczne zostałoby przywrócone w środowisku mitochondrialnym. W tym hipotetycznym scenariuszu cząsteczka wody w jamie działałaby odpowiednio jako kwas.

Aktywność hydrolazy FAHD1

Aktywność hydrolazy enzymu domyślnie wymaga pośredniego tworzenia nukleofila hydroksylowego. Mechanizm ten występuje zwykle w połączeniu z aktywnością katalityczną kwasowo-zasadową. Stan przejściowy reakcji musi być przygotowany poprzez kontrolę konformacyjną przez krytyczne łańcuchy boczne aminokwasów w jamie. Analogicznie do dyskusji na temat funkcji dekarboksylazy, związany z enzymem acylopirogronian w postaci 2-keto zostanie poddany kontroli konformacyjnej przez wiązanie wodorowe tlenu 4-karbonylowego z Q109 (ryc. 9B, prawy panel). Struktura krystaliczna FAHD1 związanego ze szczawianami (PDB:6FOG) ujawnia konserwowaną cząsteczkę wody utrzymywaną w orientacji kierunkowej w kierunku centrum katalitycznego FAHD1 przez reszty H30 i E33 przedstawione w krótkiej helisie¹⁵. Diada E33-H30 jest zdolna do deprotonacji kierunkowo umieszczonej wody, a powstały hydroksyl jest w idealnej dyspozycji do atakowania 4-karbonylu acylopirogronianu przedstawionego pod kontrolą konformacyjną przez Q109¹⁵.

Warto zauważyć, że podobny mechanizm zaproponowano w odniesieniu do FAH¹⁸. Oczekuje się, że atak nukleofila hydroksylowego spowoduje powstanie oksyanionu, który jest stabilizowany na kontrolowanym orbitalnie rozszczepieniu wiązania C^{3-C 4} (ryc. 9C). W tym modelu rotacja wiązania C^{3-C 4} (rysunek 9C) następuje po ataku nukleofilowym przez utworzony hydroksyl wskazany na rysunku 9B (tj. przygotowuje acylopirogronian do rozszczepienia wiązania). Podstawowymi produktami byłyby kwas octowy i enolan Mg-pirogronianu. W tym hipotetycznym scenariuszu kwas octowy mógłby wygasić enol do pirogronianu, a następnie wspomóc przemieszczanie się produktu. Powyżej pH 7,5 i w obecności jonów Mg acylopirogroniany występują w równowadze między formami keto- i enolowymi, przy czym ta ostatnia nieznacznie preferuje³⁰. Najprawdopodobniej obie formy są zdolne do wiązania się z kofaktorem FAHD1 pod kolejnym zamknięciem pokrywy. Przetwarzanie substratów enolowych acylopirogronianu przez enzym jest utrudnione ze względu na płaską strukturę formy enolu. Rozszczepienie C^{3-C 4} skutkowałoby karbanionem winylowym bez stabilizacji rezonansowej.

Dlatego proponujemy etap ketonizacji katalitycznej, aby przygotować się do ataku nukleofilu hydroksylowego na karbonyl acylu. Ten proces ketonizacji wymagałby jednak kontroli nad transpozycjami protonów przez reszty FAHD1, które przypisywałyby FAHD1 nieodłączną aktywność izomerazy. Podaje się, że kwasowość wodoru enolowego związanego z Mg wykazuje dziesięciotysięczny wzrost w porównaniu z nieskompleksowaną formą²⁸. Deprotonacja formy enolu związanej z Mg byłaby możliwa do przeprowadzenia przez nieprotonowany K123. Deprotonacja K123 może być wspomagana przez karboksylan D102. Sieć wiązań wodorowych utworzona przez reszty D102-K47-K123 może działać jako niezbędny przekaźnik protonów w centrum katalitycznym FAHD1¹⁵. Tak utworzony enolan pośredni może być następnie schładzany przez triadę E33-H30-H₂0 pod ketonizacją substratu¹⁵. Forma 2-keto znalazłaby się pod kontrolą konformacyjną Q109, a jednocześnie utworzony hydroksyl zaatakowałby acyl karbonylu. Podsumowująca dyskusja implikuje kontrolę FAHD1 nad cząsteczką wody do przełączania między kwasem a zasadą poprzez wzajemne oddziaływanie reszt tworzących ubytki.

Przyszłe zastosowania lub kierunki metody

Przyszłe zastosowania opisywanych tutaj metod są liczne. Mnóstwo prokariotycznych członków nadrodziny FAH wciąż czeka na charakterystykę funkcjonalną. Nawet dostępne informacje na temat aktywności katalitycznej znanych członków nadrodziny FAH są skąpe i w większości przypadków opierają się na założeniach teoretycznych, a nie na danych eksperymentalnych. Zastosowanie opisanych tu metod dla prokariotycznych członków nadrodziny FAH zależy od konkretnych zainteresowań badawczych w zakresie bakteriologii. Z drugiej strony, niedawne wykazanie, że eukariotyczni członkowie nadrodziny FAH odgrywają istotną rolę w różnych przedziałach komórkowych (np. cytozol vs. mitochondria) podkreśla potrzebę lepszego scharakteryzowania tych białek (z których trzy zostały do tej pory zidentyfikowane), w szczególności dlatego, że obecne dane sugerują, że niektóre niescharakteryzowane białka mogą pełnić różne funkcje w kontekście biologii mitochondrialnej. badania nad starzeniem się i badania nad rakiem. Sugeruje się, że pełna charakterystyka molekularna i fizjologiczna tych eukariotycznych członków nadrodziny FAH może dostarczyć ważnych informacji na temat głównych dziedzin współczesnych badań w sektorze biomedycznym. Potrzebne są dalsze badania nad mechanizmami FAHD1 (i pokrewnych enzymów), aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw dwufunkcyjności FAHD1, która wciąż nie jest w pełni wyjaśniona. Dodatkowe badania z mutantami FAHD1, badania NMR i badania strukturalne nad kompleksami inhibitorów mogą pomóc w rozwiązaniu prawdziwych scenariuszy mechanistycznych, dla których FAHD1 wydaje się być kompetentny. Co więcej, wspomagane komputerowo projektowanie naśladowców enolu zdolnych do wiązania się z kofaktorem Mg ostatecznie doprowadzi do powstania silnych inhibitorów FAHD1.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21(DE3) pLysS kompetentny E. coli	Promega	L1195	Wysokowydajna ekspresja białka z genu z promotorem T7 i miejscem wiązania rybosomów
pET E. coli T7 Wektory ekspresji			MERCK-http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0,45 i mikro; m jednostki filtracyjne	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0,45 &mikro; m, PES 33 mm, nie sterylne
0,22 &mikro; m jednostki filtracyjne	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0,22 i mikro; m, PES 33 mm, niesterylne
Probówki Eppendof 1,5 ml	VWR	525-1042	probówki mikroodśrodkowe; autoklawizowane
15 ml Falcon	VWR	734-0451	probówki odśrodkowe
50 ml Falcon	VWR	734-0448	odśrodkowe
Spektrofotometr kuwetowy PS Semi-Micro	VWR	30622-758	VIS przezroczyste kuwety
Kuwety UV Spektrofotometr Semi-Micro	VWR	47727-024	Przezroczyste kuwety UV/VIS
izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	ROTH	2316	substancja chemiczna stosowana do indukcji ekspresji białek za pomocą systemu DE3/pET
imidazol	ROTH	X998	substancja chemiczna stosowana do elucji sekwencji polihistydyny (6xHis) z żywicy o powinowactwie naładowanej niklem
Szklane kolumny ekonokolumnowe	Bio-Rad	-	http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378	antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; oporność endió w plazmidzie pLysS BL21(DE3) E. coli; 25 &mikro; g/ml stężenie końcowe
kanamycyna	Sigma-Aldrich	60615	antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; do stosowania, jeśli oporność ta jest kodowana w zastosowanym wektorze pET; 50 &mikro; g/ml stężenie końcowe
ampicylina	Sigma-Aldrich	A1593	antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; do stosowania, jeśli oporność ta jest kodowana w zastosowanym wektorze pET; 100 &mikro; g/ml stężenie końcowe
Ultra-15, MWCO 10 kDa	Sigma-Aldrich	Z706345	do wzbogacania białek; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Filtry odśrodkowe Ultra-0,5 Filtry odśrodkowe	Sigma-Aldrich	Z677108	do wzbogacania białek; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
kwas szczawiooctowy	Sigma-Aldrich	O4126	Metabolit TCA
okklalanian sodu	Sigma-Aldrich	71800	, kompetycyjny inhibitor enzymów z nadrodziny FAH,
rurki do dializy, membrana celulozowa	Sigma-Aldrich,	D9277	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; lub porównywalna
agaroza Ni-NTA	Thermo-Fischer	R90101	żywica o powinowactwie naładowana niklem, która może być stosowana do oczyszczania rekombinowanych białek zawierających sekwencję polihistydyny (6xHis)
96-dołkowa mikropłytka UV	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS przezroczyste płaskie dno 96-dołkowe
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa	Thermo-Fischer	26616	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
Ä System KTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	-	przy użyciu systemu FPLC firmy GE Healthcare; istnieją różne wersje niestandardowe; w tej pracy użyto "Ä System KTA pure"
HiTrap Kolumna Phenyl HP	GE Healthcare Nauki przyrodnicze-https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences-https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Kolumna Superdex 75 pg (G75)	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
Kolumna HiLoad Superdex 200 pg (G200)	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
Czytnik mikropłytek TECAN	Nauki przyrodnicze-https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylopirogronian	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	-	niestandardowa synteza
benzoilopirogronianu	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	-	niestandardowa synteza
VDX i płytka handlowa (24 dołki)	Hampton	HR3-142	24-dołkowe płytki używane do krystalizacji za pomocą Hanging Drop Vapor Diffusion
olej parafinowy	Hampton	HR3-411	używany do krystalizacji za pomocą wiszących
szkiełek nakrywkowych Vapor Diffusion (22 mm)	Karl Hecht KG	14043	szkiełka nakrywkowe używane do krystalizacji za pomocą dyfuzji
parowej Hanging DropBulion Luria (LB) pożywka	przygotowana samodzielnie	-	ogólna pożywka dla E. coli: 5 g/L ekstraktu drożdżowego; 10 g/L peptonu z kazeiny; 10 g/L chlorku sodu; 12 g/L agar-agar
NZCYM pożywka	samodzielnie przygotowana	-	lepsza pożywka dla E. coli, używana do amplifikacji: 10 g/L aminy NZ; 5 g/L NaCl; 5 g/L ekstraktu drożdżowego; 1 g/L casaminokwasy; 2 g/L MgSO4; dostosuj pH do 7,4
bulion Luria (LB) płytki agarozowe	samodzielnie przygotowane	-	autoklawowane płytki agarozowe zawierające pożywkę LB i antybiotyki do selekcji groth bakteryjnej; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Bufor biegowy Ni-NTA	samodzielnie -		20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazol; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD
Bufor elucyjny Ni-NTA	samodzielnie przygotowany	-	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazolu; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD
bufor do biegania HIC	przygotowany	samodzielnie-44	mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM naziemna telewizja cyfrowa; dostosować do pH 7
bufor biegowy HIC AS	przygotowany	bufor	biegowy HIC nasycony siarczanem amonu (AS); dostosować do pH 7: 70 g siarczanu amonu + 90 ml buforu, mieszać przez noc w chłodni; dostosować do pH 7,0
Bufor o niskiej zawartości soli Mono S	przygotowany samodzielnie	-	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD
Bufor o wysokiej zawartości soli Mono S			samodzielnie-44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD
Bufor niskosolny Mono Q	przygotowany	samodzielnie-20	mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; dostosować do pH 8,0
Bufor o wysokiej zawartości soli Mono Q	przygotowany samodzielnie	-	20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glicerolu; dostosować do pH 8,0
G75 / G200 bufor do biegania		samodzielnie-15	mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; dostosować do pH 7,4
bufor do oznaczania enzymów	przygotowany samodzielnie-50		mM Tris-HCl pH7,4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
białkowy bufor krystalizacyjny	przygotowany samodzielnie -		G75 / G200 działający bufor z 1 mM
roztworem zbiornikowym DTT do krystalizacji	samodzielnie przygotowany	-	100 mM Na-HEPES pH 7,5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2