Operacja hemisesekcji rdzenia kręgowego klatki piersiowej i ocena lokomotoryczna w otwartym polu u szczura

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) wiąże się z poważnymi zaburzeniami funkcji motorycznych, czuciowych i autonomicznych. Eksperymentalne modele zwierzęce SCI są cennymi narzędziami do zrozumienia anatomicznych i fizjologicznych zdarzeń związanych z patologią SCI, do zbadania mechanizmów neuronalnych w naprawie i powrocie do zdrowia oraz do badań przesiewowych pod kątem skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych interwencji terapeutycznych. Szczur jest najczęściej używanym gatunkiem w badaniach nad SCI¹. Modele szczurów są tanie, łatwe do odtworzenia i dostępna jest duża bateria testów behawioralnych do oceny wyników funkcjonalnych². Pomimo pewnych różnic w położeniu przewodów, rdzeń kręgowy szczura ma ogólnie podobne funkcje sensomotoryczne z większymi ssakami, w tym naczelnymi^3,4. Szczury mają również analogiczne konsekwencje fizjologiczne i behawioralne do SCI, które odnoszą się do ludzi⁵. Modele naczelnych i dużych zwierząt mogą zapewnić bliższe przybliżenie ludzkiego SCI⁶ i są niezbędne do udowodnienia bezpieczeństwa i skuteczności leczenia przed eksperymentami na ludziach, ale są rzadziej używane ze względu na względy etyczne i dobrostan zwierząt, koszty i wymogi regulacyjne⁷.

Modele SCI transsekcji szczurów są wykonywane przez celowe przerwanie rdzenia kręgowego z selektywnym uszkodzeniem za pomocą noża do preparacji lub nożyczek do irydektomii po laminektomii. W porównaniu z pełną transsekcją, częściowa transsekcja u szczura skutkuje mniej poważnym urazem, łatwiejszą pooperacyjną opieką nad zwierzętami, spontaniczną regeneracją lokomotoryczną i bardziej zbliżonym modelem SCI u ludzi, który jest przeważnie niekompletny z częściowym oszczędzeniem tkanki łączącej rdzeń kręgowy i struktury nadrdzeniowe⁸. Jednostronna hemisekcja przerywa wszystkie drogi wstępujące i zstępujące tylko po jednej stronie i powoduje wymierne i wysoce powtarzalne deficyty lokomotoryczne, co ułatwia eksplorację podstawowych mechanizmów biologicznych. Najbardziej widoczną konsekwencją funkcjonalną hemisekcji jest początkowy paraliż kończyn po tej samej stronie i poniżej poziomu zmiany ze stopniowanym spontanicznym odzyskiwaniem funkcji lokomotorycznej w ciągu kilku tygodni^9,10,11,12. Model hemisekcji jest szczególnie przydatny do badania plastyczności neuronalnej uszkodzonych i resztkowych dróg i obwodów związanych z odzyskiwaniem funkcjonalnym^{9,11,12,13,14,15,16,17,18}. W szczególności, hemisekcja wykonywana na poziomie klatki piersiowej, tj. powyżej obwodów rdzeniowych, które kontrolują lokomocję kończyn tylnych, jest szczególnie przydatna do badania zmian w kontroli lokomotorycznej. Ponieważ istnieje nieliniowa zależność między nasileniem zmian a regeneracją lokomotoryczną po SCI¹⁹, odpowiednie testy behawioralne w celu oceny wyników funkcjonalnych mają kluczowe znaczenie w modelach eksperymentalnych.

Dostępna jest obszerna bateria testów behawioralnych do oceny konkretnych aspektów funkcjonalnej regeneracji lokomotorycznej u szczura2^,20. Wiele testów lokomotorycznych nie zapewnia wiarygodnych pomiarów na wczesnym etapie po SCI, ponieważ szczury są zbyt niepełnosprawne, aby utrzymać swoją masę ciała. Pomiar spontanicznej sprawności lokomotorycznej, który jest wrażliwy na deficyty we wczesnym okresie po urazie i nie wymaga szkolenia przedoperacyjnego ani specjalistycznego sprzętu, jest korzystny w celu monitorowania powrotu do zdrowia lokomotorycznego w odpowiednich punktach czasowych, w których należy uzupełnić specjalistyczne testy behawioralne. Wynik oceny Martineza na otwartym polu10, pierwotnie opracowany do oceny sprawności lokomotorycznej po SCI szyjki macicy u szczura, jest 20-punktowym wynikiem porządkowym oceniającym globalną sprawność lokomotoryczną podczas spontanicznego poruszania się po powierzchni na otwartym polu. Punktacja jest przeprowadzana oddzielnie dla każdej kończyny za pomocą rubryki, która ocenia określone parametry szeregu pomiarów lokomotorycznych, w tym ruch kończyn stawowych, podparcie ciężaru, pozycję palców, zdolności krokowe, koordynację kończyn przednich i tylnych oraz pozycję ogona. Wynik oceny pochodzi ze skali oceny Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) przeznaczonej do oceny sprawności lokomotorycznej po stłuczeniu klatki piersiowej²¹. Jest przystosowany do dokładnej i wiarygodnej oceny funkcji lokomotorycznych kończyn przednich i tylnych, pozwala na niezależną ocenę różnych parametrów punktacji, które nie są zgodne z hierarchiczną punktacją BBB, i zapewnia liniowy profil odzyskiwania¹⁰. Dodatkowo, w porównaniu z BBB, wynik oceny jest czuły i wiarygodny w przypadku poważniejszych modeli urazów^10,11,20,22. Wynik oceny został wykorzystany do oceny upośledzenia ruchu u szczura po szyjce macicy^10,12 i thoracic⁹ SCI samodzielnie i w połączeniu z urazowym uszkodzeniem mózgu²³.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół krok po kroku do wykonania hemisekcji klatki piersiowej SCI na poziomie kręgu T8 u samicy szczura Long-Evans oraz do oceny regeneracji lokomotorycznej kończyn tylnych na otwartym polu.

Eksperymenty opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez komisję etyki na Université de Montréal.

1. Chirurgia hemisekcji klatki piersiowej

1. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice, maskę i fartuch), aby utrzymać aseptyczne środowisko podczas operacji. Oczyść obszar operacyjny chusteczkami nasączonymi alkoholem i umieść sterylne obłożenia chirurgiczne na polu operacyjnym. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne i umieść je na polu operacyjnym.
2. Znieczulić szczura mieszaniną izofluranu (3% indukcji, 0,5-3% konserwacji) i tlenu (1 l/min). Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia chirurgicznego, sprawdzając brak szczypania palców u nóg i odruchów rogówkowych. Stale monitoruj szczura podczas całego zabiegu i dostosuj ilość podawanego środka znieczulającego zgodnie z wymaganiami, aby utrzymać głębokość znieczulenia chirurgicznego.
3. Ogolić grzbietowy tułów między biodrem a szyją, umieścić szczura na polu operacyjnym, zdezynfekować miejsce nacięcia chusteczkami nasączonymi alkoholem i roztworem prowiodu i utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej sterowanej sprzężeniem zwrotnym, monitorowanej przez termometr doodbytniczy.
4. Umieść maść okulistyczną na oczach, aby utrzymać ich nawilżenie i w razie potrzeby nakładaj ją ponownie przez cały zabieg.
5. Wykonać skalpelem 2,5 cm nacięcie w skórze pokrywające kręgi T6−T10. Cofnij skórę i powierzchowną tkankę tłuszczową za pomocą nożyczek preparacyjnych.
   UWAGA: Segmenty kręgów T6−T10 można zidentyfikować albo rostralnie przez delikatne badanie palpacyjne grzbietowych segmentów kręgosłupa od podstawy czaszki, zaczynając od zauważalnej wypukłości 2. kręgu piersiowego²⁴, lub doogonowo przez badanie palpacyjne najbardziej wysuniętego do tyłu pływającego żebra, które wywoła ruch w 13. kręgu piersiowym.
6. Oddziel mięśnie przykręgosłupowe przyczepiające się do grzbietowej strony kręgów T7−T9 za pomocą nożyczek preparacyjnych i samozatrzymującego się retraktora. Oczyścić i oczyścić pozostałą tkankę za pomocą cienkich kleszczyków i aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby odsłonić wyrostki kolczyste i blaszki kręgowe.
   UWAGA: Ten i następne kroki są znacznie wspomagane przez wizualizację mikroskopową (~5−15x).
7. Ostrożnie odetnij fasety (stawy zygapofizyjne) obustronnie na kręgach T7 i T8 za pomocą delikatnych trymerów do kości. Przeciąć grzbietową tkankę łączną między blaszkami kręgowymi T8 i T9 powierzchownie skalpelem (głębokość 1 mm), uważając, aby nie uszkodzić rdzenia podszywkowego.
8. Usuń wyrostek kolczysty kręgu T8 za pomocą trymerów do kości. Za pomocą zakrzywionych kleszczy hemostatycznych ostrożnie zaciśniętych na wyrostku kolczystym T7, obróć ogonowy koniec blaszek T8 lekko obrotowo (~ 20 °), włóż trymery do kości pod blaszkę T8 i wykonaj cięcie linii środkowej rozciągające się wzdłuż blaszki. Kontynuuj laminektomię, powtarzając nacięcia po lewej i prawej stronie blaszki kręgowej przyśrodkowej do wyrostków poprzecznych, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
   UWAGA: Należy uważać, aby usunąć wszystkie fragmenty kości powstałe w wyniku laminektomii.
9. Wlej lidokainę (2%, 0,1 ml) do odsłoniętego kanału kręgowego i usuń oponę twardą pokrywającą odcinek kręgosłupa T8 za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek do irydektomii. Powtórz podawanie lidokainy do odsłoniętego rdzenia kręgowego i zidentyfikuj linię środkową rdzenia, wizualizując linię środkową utworzoną między wyrostkami kolczystymi rozciągającymi się między odsłoniętym kręgiem T7−T9.
   UWAGA: Wraz z wyrostkami kolczystymi na T7 i T9, odsłonięte zwoje korzenia grzbietowego na T8 mogą być również wykorzystane do identyfikacji linii środkowej, a igła 30 G może być umieszczona w linii środkowej pępowiny, aby pomóc w późniejszej hemisekcji.
10. Wytnij rdzeń kręgowy od linii środkowej w kierunku jednej strony za pomocą noża preparacyjnego. Uważaj, aby nie przeciąć przedniej tętnicy rdzeniowej po stronie brzusznej (nie wywieraj mocnego nacisku na trzon kręgu). Za pomocą nożyczek do irydektomii ostrożnie przeciąć pozostałą tkankę po uszkodzonej stronie rdzenia kręgowego, aby upewnić się, że ćwiartka brzuszno-boczna jest odpowiednio przecięta.
11. Umieść sterylną gąbkę hemostatyczną nasączoną solą fizjologiczną (~6 x 2 mm) w odsłoniętej jamie powyżej rdzenia kręgowego i zszyj warstwy mięśniowe (4-0 poliglaktyna 910). Następnie zszyj skórę wokół miejsca nacięcia.
12. Natychmiast po zabiegu należy podać odpowiednie leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,05 mg/kg podskórnie [s.c.]), antybiotyk (enrofloksacyna, 10 mg/kg s.c.) i uzupełnić utracone płyny 5 ml roztworu Ringera z mleczanami (dootrzewnowo [i.p.])
.
13. Usuń szczura ze znieczulenia. Umieść szczura w ciepłym miejscu pod poduszką grzewczą lub lampą (~ 33 °C), aż zwierzę całkowicie się obudzi.
14. Zapewnij dodatkową analgezję codziennie przez pierwsze 3 dni po operacji i stale monitoruj oznaki bólu, utraty wagi, nieprawidłowego oddawania moczu, infekcji, problemów z gojeniem się ran lub autofagii.

2. Procedura testowania w otwartym terenie i ocena wydajności lokomotywy

1. Utrzymuj szczury codziennie przez 1 tydzień i przyzwyczajaj je do areny na dwie 5-minutowe sesje przed testem, aby zaaklimatyzować się do podnoszenia, delikatnie ze środka pnia, na otwartym polu i zapewnić wiarygodność pomiaru podczas testów.
2. Umieść kamerę na poziomie gruntu, zwróconą w stronę okrągłej areny z pleksiglasu na otwartym polu, aby nagrywać sesje testowe do analizy offline (minimum 30-60 klatek/s).
3. Rozpocznij nagrywanie wideo i umieść szczura na środku areny w słabych warunkach oświetleniowych, aby zachęcić do aktywności lokomotorycznej.
4. Kontynuuj sesję testową przez 4 minuty, aby zapewnić odpowiednią ilość napadów lokomotorycznych do analizy. Podnoś i zastępuj szczury na środku areny, gdy pozostają nieruchome przez ponad 20 sekund, aby promować lokomocję.
5. Oceń sprawność lokomotoryczną zarejestrowanej sesji testowej, wypełniając rubrykę podaną w tabeli 1 zgodnie z parametrami w poniższych podsekcjach.
   UWAGA: Pomocne jest ocenianie każdego parametru osobno poprzez wielokrotne przeglądanie nagranej sesji testowej za pomocą oprogramowania, które pozwala na zmienną prędkość odtwarzania i analizę klatka po klatce (np. odtwarzacz multimedialny VLC).
   1. W przypadku ruchów kończyn stawowych należy oceniać ruchy stawów kończyn tylnych podczas spontanicznej lokomocji oddzielnie dla kostki, kolana i biodra jako normalne (ponad połowa zakresu ruchu, przyznany wynik = 2), nieznaczne (mniej niż połowa zakresu ruchu, przyznany wynik = 1) lub nieobecne (przyznany wynik = 0).
   2. Aby utrzymać ciężar ciała, oceń zdolność mięśni prostowników kończyn tylnych do kurczenia się i podtrzymywania obciążonego ciężaru ciała, gdy kończyna leży na ziemi oddzielnie, zarówno wtedy, gdy szczur jest nieruchomy, jak również podczas aktywnej lokomocji. Przyznaj wynik 1, gdy obecne jest podparcie ciężaru, i wynik 0, gdy nie ma podparcia ciężaru.
      UWAGA: Stacjonarne podparcie ciężaru jest uważane za niezbędne do aktywnego wspomagania ciężaru.
   3. W przypadku pozycji palca oceń położenie palców kończyn tylnych, gdy szczur jest nieruchomy i podczas lokomocji. Przyznaj wynik 2, gdy palce kończyn tylnych są wydłużone, oddalone od siebie i tonizują podczas lokomocji przez ponad 50% okresu badania (uważanego za normalny). Przyznaj wynik 1, gdy cyfry pozostają w przeważającej mierze zgięte, i wynik 0, gdy cyfry pozostają w przeważającej mierze atoniczne.
   4. W przypadku steppingu należy wypełnić ten parametr tylko wtedy, gdy szczur jest w stanie utrzymać ciężar ciała podczas stąpania. Oceń krok, oceniając orientację ułożenia łap kończyn tylnych w momencie pierwszego kontaktu i podczas oderwania od ziemi, a także płynność fazy wymachu podczas stąpania.
      UWAGA: Istnieją 3 punkty dla tego parametru opisane w następujących podrozdziałach oddzielnie oceniające: 1) osiową orientację ułożenia łapy przy kontakcie kończyny (ustawienie grzbietowe/podeszwowe), 2) wzdłużną orientację ułożenia łapy przy pierwszym kontakcie i podczas podnoszenia (równoległą do osi ciała lub obróconą wewnętrznie/zewnętrznie) oraz 3) jakość ruchu kończyny podczas wymachu (regularny lub nieregularny).
      1. W przypadku ułożenia łapy w kontakcie z kończyną, należy ocenić orientację osiową ułożenia łapy w kontakcie z kończyną jako 0, gdy ułożenie grzbietowe występuje w więcej niż 50% kroków.
         UWAGA: Ułożenie podeszwowe jest uważane za niezbędne do oceny orientacji łapy przy kontakcie i uniesieniu (krok 2.5.4.2), ruchu wahadłowego (krok 2.5.4.3) i koordynacji kończyny przedniej i tylnej (krok 2.5.5).
      2. Za orientację łapy przy kontakcie z kończyną i uniesieniu należy przyznać wynik 2, gdy wzdłużne osie łapy i ciała są równoległe, oraz wynik 1, gdy kończyna jest obracana na zewnątrz lub wewnętrznie, oddzielnie zarówno dla kontaktu kończyny, jak i podnoszenia.
      3. Za ruch wymachu przyznaj wynik 2, gdy stawy kończyn tylnych poruszają się w harmonijny i regularny sposób podczas wymachu oraz wynik 1, gdy podczas zamachu występują gwałtowne lub spazmatyczne ruchy stawów.
   5. W przypadku koordynacji kończyn przednich i tylnych należy wypełnić ten parametr tylko wtedy, gdy podczas badania wystąpią 4 kolejne kroki i jeśli kończyny mogą aktywnie utrzymywać ciężar ciała. Przyznaj wynik 3, gdy koordynacja jest stała (>90% kroków), 2 jeśli jest częsta (50−90% kroków), 1 gdy jest sporadyczna (<50% kroków) lub 0, gdy jest nieobecna (0% kroków).
      UWAGA: Koordynacja kończyna przednia - kończyna tylna jest definiowana jako regularna zmiana kroku między kończyną tylną, która jest nacinana, a kończyną przednią po tej samej stronie ciała.
   6. W przypadku pozycji ogona oceń pozycję ogona podczas lokomocji jako w górę (nad ziemią, przyznany wynik = 1) lub w dół (dotknięcie ziemi, przyznany wynik = 0).
      UWAGA: Podwyższona pozycja ogona podczas lokomocji jest wskaźnikiem stabilności tułowia u szczura. Po półsekcji ogon jest zwykle trzymany blisko ziemi lub dotyka jej, ponieważ stabilność tułowia jest osłabiona.
   7. Dodaj indywidualne wyniki z każdego parametru, aby uzyskać sumę dla każdej kończyny tylnej wynoszącą maksymalnie 20 punktów.
      UWAGA: Wynik 20 wskazuje na normalną sprawność lokomotoryczną. Wyniki <20 reprezentują rosnące upośledzenie ruchu, a wynik 0 oznacza paraliż kończyn.

Powtarzalne zmiany o wysokim stopniu spójności mogą być generowane za pomocą techniki hemisekcji. Aby ocenić i porównać rozmiary zmian między grupami eksperymentalnymi, maksymalny obszar zmiany jako procent całkowitego przekroju poprzecznego rdzenia kręgowego można łatwo obliczyć za pomocą histologicznego barwienia odcinków rdzenia kręgowego. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne uszkodzenie lewego półści oraz nakładkę proporcji maksymalnej powierzchni uszkodzenia dzielonej między szczurami o średniej wielkości zmiany 47,3% ± 4,0% powierzchni przekroju poprzecznego rdzenia (n = 6).

Rycina 1: Reprezentatywne zmiany w obrębie kręgosłupa. (A) Mikrofotografia przekroju koronalnego kręgosłupa w epicentrum zmiany od szczura poddanego hemisekcji, zabarwiona fioletem krezylowym (ciała komórkowe, kolor fioletowy) i szybkim błękitem luksolowym (mielina, kolor niebieski) wskazująca na uszkodzenie istoty szarej i białej skoncentrowanej w lewej półkłodzie. D, grzbietowy; V, brzuszny; L, po lewej; R, po prawej. Podziałka skali: 1 mm. (B) Schematyczne nałożenie wspólnej proporcji maksymalnej powierzchni zmiany chorobowej w grupie szczurów (n = 6). Położenie skrzyżowanego przewodu korowo-rdzeniowego w funiculusie grzbietowym po prawej stronie jest zacienione na czarno. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Główną konsekwencją hemisekcji jest początkowy paraliż kończyny tylnej po stronie zmiany w ciągu pierwszych dwóch, trzech dni po operacji. Sprawność lokomotoryczna bardziej chorej kończyny tylnej poprawia się gwałtownie u szczura po hemisekcji w ciągu pierwszych kilku tygodni po urazie. Małe deficyty w przeciwległej kończynie tylnej są zwykle obserwowane początkowo po półsekcji, które mogą odzwierciedlać kompensację bardziej dotkniętej kończyny lub deficyty wynikające z braku stabilności postawy, podparcia ciężaru ciała i konsekwentnego chodzenia. Duży i utrzymujący się deficyt w przeciwległej kończynie tylnej wskazywałby na obustronną zmianę rozciągającą się do przeciwległej.

Przykładowa rubryka oceny wydajności lokomotorycznej znajduje się w Tabeli 1.

Tabela 1: Przykładowy arkusz punktacji. Przykładowa rubryka oceny wydajności lokomotorycznej. Dla każdego parametru możliwe wyniki są wskazane w nawiasach. I, wewnętrzny; E, zewnętrzny; P, równolegle; FL-HL, kończyna przednia-kończyna tylna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Przebieg czasowy reprezentatywnych zmian w sprawności lokomotorycznej w stanie nienaruszonym i w ciągu pierwszych pięciu tygodni po półsekcji lewej strony w oddzielnych grupach szczurów (n = 6 na grupę) jest przedstawiony w Rysunek 2.

Rycina 2: Reprezentatywny przebieg w czasie zmian sprawności ruchowej kończyn tylnych na otwartym polu w stanie nienaruszonym i przez pięć tygodni po hemisekcji klatki piersiowej lewej strony. Wydajność lewej kończyny tylnej (A) jest znacznie upośledzona w stosunku do wartości nienaruszonych w ciągu pierwszych trzech tygodni po hemisekcji, a prawej kończyny tylnej (B) w pierwszym tygodniu po hemisekcji. Dane są wykreślane jako średnia grupy ± odchylenie standardowe (SD; n = 6 na grupę). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testów nieparametrycznych Kruskala-Wallisa uzupełnionych wielokrotnymi testami porównawczymi Dunna w celu oceny różnic grupowych między punktami czasowymi. *p < 0,05, ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.