Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59748

⸱

30 sierpnia 2019

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Streszczenie

Niedokrwienie wątroby i uszkodzenie reperfuzyjne (I/R), powszechne wyzwanie kliniczne, pozostaje nieuniknionym procesem patofizjologicznym, który, jak wykazano, powoduje wiele uszkodzeń tkanek i narządów. Pomimo ostatnich postępów i podejść terapeutycznych, ogólna zachorowalność pozostaje niezadowalająca, zwłaszcza u pacjentów z podstawowymi nieprawidłowościami miąższu. W kontekście agresywnego wzrostu nowotworu i przerzutów podejrzewa się, że chirurgiczny I/R jest promotorem regulującym nawroty guza. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie klinicznie istotnego mysiego modelu I/R wątroby i przerzutów do wątroby jelita grubego. W ten sposób staramy się pomóc innym badaczom w ustaleniu i udoskonaleniu tego modelu dla ich rutynowej praktyki badawczej, aby lepiej zrozumieć wpływ I/R wątroby na promowanie przerzutów do wątroby.

Wprowadzenie

Wątroba jest jednym z najczęstszych miejsc rozwoju choroby przerzutowej1. Śmiertelność prawie zawsze można przypisać powikłaniom związanym ze wzrostem guza w wątrobie. U pacjentów z przerzutowymi guzami litymi w wątrobie zabieg chirurgiczny pozostaje kluczową interwencją w celu kontroli choroby i możliwego podejścia leczniczego. Jednak u zdecydowanej większości pacjentów ostatecznie występuje nawrót choroby, głównie w klasie wątroby2,3. Podczas operacji wątroby często dochodzi do krwawienia śródoperacyjnego, co często wymaga transfuzji krwi i różnych podejść technicznych do tamowania krwawienia, w tym metod zaciskania naczyń krwionośnych. Jednak takie środki powodują niedokrwienie/reperfuzję wątroby (I / R) do tkanki wątroby. Niekorzystny wpływ I/R na czynność komórek wątrobowych został dobrze udokumentowany. Uszkodzenie I/R wątroby powoduje zapłon kaskad zapalnych podczas przywracania przepływu krwi przez szlaki zapalne4. Nie tylko uszkodzenie I/R wątroby przyczynia się do niewydolności wątroby, ale obecne dowody pokazują również, że uszkodzenie I/R stymuluje adhezję komórek nowotworowych i sprzyja występowaniu przerzutów i wzrostowi istniejącej choroby mikroprzerzutowej5. Wcześniej informowaliśmy, że stres chirurgiczny indukuje aktywację komórek odpornościowych, co nie tylko pomaga we wzroście guza pierwotnego, ale także ułatwia przerzuty poprzez wychwytywanie komórek rakowych w krążeniu6.

Tutaj szczegółowo opisujemy technikę tworzenia modelu guza myszy z przerzutami do wątroby. W tym modelu przedstawiono również metodę wywoływania uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego wątroby, która działa jako substytut stresu chirurgicznego występującego klinicznie podczas hepatektomii. Połączone metody iniekcji raka i I/R wątroby mogą z powodzeniem interpretować rozwój CRLM u pacjentów, którzy przeszli pierwotną resekcję guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dla zwierząt są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i przestrzegają wytycznych National Institutes of Health (NIH). Narzędzia używane do wszelkich zabiegów chirurgicznych były dokładnie sterylizowane.

1. Wstępne przygotowanie

  1. Przed wstrzyknięciem komórek rakowych do śledziony myszy należy sterylizować w autoklawie i sterylizować wszystkie narzędzia, które mają być używane podczas zabiegu.
  2. Wysterylizuj i/lub autoklaw w autoklawie poduszkę grzewczą, rękawiczki chirurgiczne, gazę, nożyczki, małe zaciski, rozszerzacz naczyń, kleszcze chirurgiczne i uchwyt na igłę.
  3. Przygotować pooperacyjny lek przeciwbólowy (0,1 mg/kg buprenorfiny) do podania po splenektomii i co 12 godzin przez 2 dni.

2. Hodowla komórkowa

  1. Upewnij się, że komórki rakowe są wolne od zanieczyszczenia mykoplazmą, używając zestawu ELISA mycoplasma.
  2. Przygotować 500 ml roztworu pożywki do hodowli Dulbecco Modified Eagle (DMEM) w temperaturze 4 °C do hodowli mysich komórek raka jelita grubego (MC38). Pożywki hodowlane należy uzupełnić 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 15 mM HEPES i 200 mM L-glutaminy.
  3. Hodowla komórek nowotworowych w kolbie wolnej od DNA i RNAzy (75 cm2). Inkubować kulturę komórkową w inkubatorze z nawilżaną komórką/tkanką zawierającym 5% CO2 . Utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C.
  4. Gdy proliferujące komórki osiągną 90-100% zbieżności, odessaj stare podłoże, umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie potraktuj je 1x trypsyną (0,25%), aby odłączyć komórki od kolby.
  5. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 700 x g.
  6. Zassać pożywkę i przemyć dwukrotnie 1x PBS przez wielokrotne wirowanie.
  7. Kontynuuj potwierdzanie żywotności komórek, barwiąc je barwieniem błękitem trypanowym (0,4%).
  8. Zawiesić komórki do stężenia 1 x 106 komórek/ 100 μL w 1x PBS. Dokładnie pipetuj komórki, aby uniknąć grudek. Utrzymuj komórki rakowe na lodzie przed wstrzyknięciem.

3. Wstrzykiwanie komórek nowotworowych

  1. Znieczulenie 8-12-tygodniowych samców myszy (C57BL6) poprzez podanie ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (12 mg/kg) dootrzewnowo za pomocą igły o pojemności 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm).
  2. Ogol skórę brzucha myszy za pomocą maszynki do strzyżenia, aby uniknąć infekcji pooperacyjnych.
  3. Umieść myszy na systemie chowania stabilizatora magnetycznego. Upewnij się, że myszy są całkowicie pod wpływem znieczulenia, szczypiąc palec u nogi lub ogon.
  4. Dodaj krople soli fizjologicznej do oczu, aby uniknąć wysuszenia podczas zabiegu.
  5. Wyszoruj roztwór jodu powidonu (7,5%) do ogolonej ściany brzucha, aby zdezynfekować skórę przed wykonaniem nacięcia chirurgicznego.
  6. Najpierw podnieś skórę za pomocą kleszczy zębatych i wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie unieś mięsień brzucha i otrzewną, aby utworzyć nacięcie w linii środkowej o długości około 3 cm (proces od środkowego brzucha do mieczykowatego w celu odsłonięcia zawartości brzucha. Należy uważać, aby nie przedłużać nacięcia poza wyrostek mieczykowaty, aby uniknąć rozległego krwawienia.
  7. Umieść hemostat po obu stronach nacięcia i pod wyrostkiem mieczykowatym. Wyprostuj brzuch, ciągnąc ogon w dół i przyklejając go taśmą. Użyj 6-calowego aplikatora ze sterylną bawełnianą końcówką, aby oddzielić i odsłonić śledzionę od tkanki tłuszczowej trzustki.
  8. Przed wstrzyknięciem do śledziony należy przetrząsnąć komórki rakowe, aby uniknąć zbryleń komórek.
  9. Do wstrzykiwań należy użyć strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml 28 g (0,36 mm x 13 mm). Unikaj pęcherzyków powietrza.
  10. Powoli i ostrożnie wstrzyknij 100 μl komórek w końcówkę śledziony. Umieść bawełnianą końcówkę i delikatnie dociśnij, aby uniknąć cofania się do okolicy brzucha. Udane wstrzyknięcie można zaobserwować, identyfikując zmianę koloru wątroby podczas wstrzyknięcia.
  11. Zwilż sterylną gazę 1x PBS i umieść ją na wypreparowanym obszarze.
  12. Przenieś myszy na poduszkę grzewczą na 15 minut, aby umożliwić komórkom rakowym krążenie w systemie.
  13. Aby przejść do chirurgicznego niedokrwienia i uszkodzenia reperfuzyjnego, wykonaj kroki 5.3-5.10.
    UWAGA: Ta procedura ma na celu zbadanie wpływu indukowanego przez I/R tworzenia ognisk przerzutowych.

4. Splenektomia

  1. Aby wykonać splenektomię, użyj ręcznego urządzenia do kauteryzacji. Ostrożnie podnieś śledzionę gładkimi kleszczami i kauteryzuj naczynia krwionośne śledziony, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Usuń śledzionę, przecinając naczynia w kauteryzowanym odcinku.
  2. Bezpośrednio po zabiegu należy zamknąć nacięcie w dwuwarstwowym wzorze, zszywając najpierw warstwę mięśniową, a następnie skórę. Używaj szwów polipropylenowych 4-0 zarówno na ścianę brzucha, jak i na skórę.
  3. Przed powtórzeniem procedury na innym zwierzęciu należy zdezynfekować wszystkie narzędzia, spryskując je 70% izopropanolem lub wkładając do kąpieli perełkowej.
  4. Umieść myszy z powrotem w oryginalnych klatkach i szukaj oznak niepokoju i bólu pooperacyjnego.
  5. Pooperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.

5. Uraz reperfuzyjny niedokrwienny

  1. Po 5 dniach od pierwszej laparotomii znieczulić myszy, podając ketaminę (150 mg / kg) i ksylazynę (12 mg / kg) dootrzewnowo za pomocą igły 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm). Wykonaj kroki 3.3–3.4.
  2. Wyszoruj roztwór jodu powidonu (7,5%) na ogolonym brzuchu myszy, aby zdezynfekować skórę i wykonać laparotomię w linii środkowej, jak opisano powyżej w kroku 3.6.
  3. Za pomocą dwóch zwilżonych bawełnianych końcówek delikatnie wysuń jelito z jamy ustnej, aby odsłonić powiązane struktury, w tym żyłę wrotną. Wypreparuj wnękę wątroby z otaczającej tkanki.
  4. Podnieś środkowy i lewy płat boczny do przepony. Oddziel płat kwadratowy od lewego płata bocznego, wycinając wnękę wątroby nożyczkami sprężynowymi za pomocą mikroskopu operacyjnego, aby zapewnić wyraźną widoczność w kierunku struktury triady wrotnej.
  5. Umieść mały wilgotny bawełniany wacik między płatem środkowym a prawym płatem bocznym, aby stworzyć wystarczającą przestrzeń do zaciskania. Za pomocą kleszczyków rozszerzających naczynia ostrożnie przełóż 10 cm nić (szew polipropylenowy 4,0), aby podnieść triadę portalową. Zatkaj wszystkie struktury w triadzie wrotnej (tętnica wątrobowa, żyła wrotna i przewód żółciowy) po lewej i środkowych płatach wątroby, umieszczając zacisk mikronaczyniowy za pomocą aplikatora zaciskowego Micro-Serrefine z blokadą.
  6. Jeśli płaty nie wykazują znacznego zblednięcia, ponownie wyreguluj zacisk, zdejmując go i ponownie nakładając.
    UWAGA: Jeśli natychmiastowe blanszowanie wątroby nie występuje nawet po ponownym wyregulowaniu zacisku, dokładnie rozważ, czy kontynuować I/R.
  7. Usuń mały bawełniany wacik umieszczony między środkowym a prawym płatem bocznym. Delikatnie włóż jelito do jamy brzusznej. Przykryj ścianę brzucha wilgotną gazą (nasączoną 1x PBS) i przykryj folią, aby zminimalizować utratę parowania.
  8. Umieść mysz na poduszce grzewczej i przyłóż zacisk na okres 60 minut.
  9. Przez cały okres niedokrwienny szukaj dowodów na uszkodzenie niedokrwienne, wizualizując blade blednięcie prawego przyśrodkowego oraz lewego przyśrodkowego i bocznego płata.
  10. Rozpocznij reperfuzję, zdejmując zaciski po upływie 60 minut.
    UWAGA: Dowody reperfuzji można zaobserwować poprzez natychmiastową zmianę koloru środkowego i lewego płata bocznego.
  11. Bezpośrednio po reperfuzji zamknij nacięcie dwuwarstwowym wzorem szwów, najpierw zszywając warstwę mięśniową, a następnie skórę. Użyj nici polipropylenowej 4-0 za pomocą uchwytu na igłę, aby zamknąć ścianę brzucha i skórę.
  12. Przed powtórzeniem procedury na innym zwierzęciu należy zdezynfekować wszystkie narzędzia, spryskując je 70% izopropanolem lub wkładając do podgrzanej kąpieli perełkowej.
  13. Umieść myszy z powrotem w oryginalnych klatkach i szukaj oznak niepokoju i bólu pooperacyjnego.
  14. Pooperacyjne leki przeciwbólowe (0,1 mg/kg buprenorfiny) należy wstrzykiwać co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.
  15. W przypadku myszy pozorowanych z wątrobą I/R należy wykonać laparotomię, rozwarstwienie wnęki i szwy brzuszne.
    nuta: Rola stresu chirurgicznego wpływającego na powstawanie przerzutów do wątroby może być badana za pomocą dwóch różnych projektów eksperymentalnych. Powyższy protokół (Model-1) służy do ustalenia choroby wątroby z mikroprzerzutami i zbadania wpływu I/R wątroby na jej wzrost (Rysunek 1A). Alternatywnie, I/R wątroby i wstrzyknięcie guza mogą być wykonywane jednocześnie (Model-2) w celu zbadania wpływu uszkodzenia I/R na tworzenie nowych ognisk przerzutowych (Figura 1B). Aby to zrobić, wstrzyknij komórki rakowe do śledziony, jak opisano powyżej, i pozwól im krążyć przez 15 minut. Wykonać I/R wątroby lub pozorowaną operację wątroby po okresie krążenia przez 60 minut. Wykonaj boczną splenektomię 60 minut później, a następnie zamknij nacięcie laparotomii.

6. Ocena operowanych myszy

  1. Podczas zabiegu chirurgicznego należy upewnić się, że myszy są pod wpływem znieczulenia III stopnia, wykonując test odruchu powiekowego i rogówkowego. Dodatkowa dawka środka znieczulającego musi być podana w przypadku objawów odruchów.
  2. Pooperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,1 mg/kg) należy podawać bezpośrednio po zabiegu i co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.
  3. Pozwól myszom na 30–60 minut rekonwalescencji po znieczuleniu. Stale monitoruj myszy i nie zostawiaj ich bez opieki aż do całkowitego wyzdrowienia.
  4. Szukaj oznak niepokoju, takich jak zgarbione plecy, zamknięte oczy, powolne ruchy i brak pielęgnacji. Traktuj odpowiednio, dopóki myszy nie powrócą do normalnej aktywności.
  5. Po operacji należy zapewnić opiekę uzupełniającą, w tym płyny, ciepło, środek odwracający działanie johimbiny na ksylazynę, miękką pościel ręcznikiem papierowym (w celu uniknięcia zachłyśnięcia), aby poprawić okres rekonwalescencji.

7. Ocena uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia wątroby

  1. Natychmiast po założeniu zacisku upewnij się, że występuje blade blednienie środkowego i lewego płata bocznego w porównaniu z płatami ogoniastymi i czworokątnymi.
  2. Oceń uszkodzenie niedokrwienne wątroby, mierząc poziom aminotransferazy alaninowej (sALT), aminotransferazy asparaginianowej w surowicy (sAST) i dehydrogenazy mleczanowej (sLDH) w surowicy. Krew można pobrać z żyły twarzowej w celu ekstrakcji surowicy po 3–6 godzinach od rozpoczęcia reperfuzji. Wykonaj histologię wątroby, aby przeanalizować procentowy obszar guza w płacie niedokrwiennym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wszystkie myszy typu dzikiego (C57BL6) (n = 20) poddano modelowi przerzutów do wątroby zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Wszystkie myszy, którym wykonano wstrzyknięcia, z urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym lub bez niego, przeżyły do dnia utylizacji. Schemat na Ryc. 1A przedstawiający wątrobę po wstrzyknięciu komórek nowotworowych ilustruje zaklemowanie triady wrotnej (tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i przewodu żółciowego), co indukuje częściowe niedokrwienie wątroby (70%) w obrębie pła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model zwierzęcy opisany w tym manuskrypcie opiera się na dwóch głównych podejściach. Pierwszym z nich jest rozpoznanie zdolności komórek rakowych do lokalizacji i namnażania się w płatach wątroby. Drugim jest zbadanie wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia wątroby na wzrost guza i przerzuty. Model ten pozwala na odpowiednie badanie przerzutów do wątroby przy braku wtórnych przerzutów u myszy immunokompetentnej. Model jest przydatny w rozwiązywaniu problemów związanych ze skutecznością przerzutów, takich jak prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych konfliktów interesów, które miałyby związek z niniejszą pracą.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sarze Minemyer i Alexandrowi Comerci za korektę językową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle MediumLonza12-614F
Płodowa surowica bydlęcaLonza900-108
L-glutaminaGibco25030-081
PenicilinFisher scientific15-140-122
StretomysinFisher scientific15-140-122
HEPESFisher Scientific
Hyclontrypsynysh30042.02
Kolba do hodowli komórkowych 75 cm5 komórek Gwiazda658170
15 ml PP Rurki stożkoweBioExcell41021037
Trypan Blue StainGiibco15250-061
GauzeFisherbrand1376152
CautryBovieAA01
Zacisk mikronaczyniowyNarzędzia Finescience18055-03
Aplikator zaciskowy Micro-Serrefine z zamkiemFine science tooslFST-18056-14
Nożyczki sprężynoweFine science tooslFST-15021-15
Rozszerzacz naczyńFine science tooslFST-00276-13
Stabilizator magnetyczny System wciąganiaFine science tooslFST-18200020
Kleszcze Micro-AdsonFine science tooslFST-11019-12
Kleszcze Micro-AdsonFine science tooslFST-11018-12
4-0 szew polipropylenowyEthiconK881H
Uchwyt na igłęAparat Harvard72-8826
Poduszka grzewczaFisher scientific
ClipperOster559A
roztwór powidonu i joduMedlineMDS093945
Strzykawka 1ml 25GBD bezpieczeństwo Glide305903
Strzykawka insulinowa 0,5 mlBD Strzykawki insulinowe32946
Aplikator z końcówką bawełnianąFisher Scientific23-400-101
Chirurgiczny MikroskopLeicaLR92240
Mycoplasma Elisa KitRoche11663925910
KetaminaPutney#056344
KsylazynaNADA#139-236
Pasek ALTHeska15809554
Pasek ASTHeska15809542
LDHHeska15809607
SH30237011443915

Bibliografia

  1. Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).
  2. Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
  3. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  4. van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
  5. Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
  6. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  7. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).
  8. Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
  9. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).
  10. Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  11. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  12. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ischemia i reperfuzja wątrobyprzerzuty raka jelita grubego do wątrobyzaciskanie żyły wrotnejtechnika wstrzyknięcia do śledzionyefekty stresu chirurgicznegowzrost guza przerzutowegookluzja płata wątrobykrążenie komórek nowotworowych
Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.